Вкусовые почки, сенсорные концевые элементы для восприятия вкуса являются гетерогенными объединениями из 30-100 удлиненных клеток с небольшим количеством яйцеобразных клеток, расположенных в базальном компартменте. В ротовой полости грызунов вкусовые почки расположены в трех различающихся типах вкусовых сосочков, грибовидные, листовидные и окруженные валом, внедренных в эпителий мягкого нёба. Среди вкусовых почек рта удлиненные клетки классифицируются на 3 основных типа, исходя из их морфологии и экспрессии специфических молекулярных маркеров (Chaudhari and Roper, 2010; Finger and Simon, 2000; Murray, 1973). Типа II клетки ответственны за восприятие сладкого, умами и или горького вкуса и они экспрессируют вкусовые рецепторные белки для этих веществ (DeFazio et al., 2006), а также элементы общего нижестоящего трансдукционного каскада, включая PLC?2 (Clapp et al.,2004), IP3R3 (Clapp et al., 2001; Miyoshi et al., 2001) и Trpm5 (Perez et al., 2002; Zhang et al., 2003). Типа II клетки высвобождают АТФ в качестве нейротрансмиттера в ответ на вкусовые стимулы (Finger et al., 2005) а секретируемый АТФ, как полагают, катализируется с помощью NTPDase2, т.е. ecto-ATPase, распределяющейся избирательно на плазматической мембране глия-подобных Type I клетках (Bartel et al., 2006; Vandenbeuch et al., 2013). Помимо испускания нейротрансмиттеров, Type I клетки обладают др. глия-подобным признаком, они содержат далеко простирающиеся клеточные отростки, которые тесно охватывают соседние вкусовые клетки (Pumplin et al., 1997). Type III клетки ответственны за восприятие кислого вкуса и экспрессируют белки, ассоциированные с трансдукцией кислого, включая PKD2L1 и Carbonic anhydrase IV (Chandrashekar et al., 2009; Kataoka et al., 2008). Далее, Type III клетки являются единственными вкусовыми клетками , формирующими обычные синапсы с вкусовыми афферентными нервами и таким образом экспрессируют многочисленные белки, ассоциированные с дифференцированными нейронами, такие как NCAM и Snap25, и накапливают нейротрансмиттер серотонин (Nelson and Finger, 1993; Yang et al., 2000; Yee et al., 2001). Несмотря на эти нейрональные характеристики вкусовые почки происходят из эпителия (Barlow and Northcutt, 1995; Stone et al., 1995), и у взрослых вкусовые почки постоянно обновляются в течение всей жизни, среднфф продолжительность жизни у них 10-14 дней (Beidler and Smallman, 1965; Farbman, 1980). Современная модель оборота клеток вкусовых почек базируется на том, что стволовые клетки вкусовых почек, расположенные вне вкусовых почек, самообновляются и дают transit amplifying (TA) клетки. TA клетки в конечном итоге выходят из клеточного цикла, проникают в почки в виде пост-митотических клеток вкусовых предшественников, которые в свою очередь дифференцируются в зрелые вкусовые рецепторные клетки (Mistretta and Hill, 1995; Miura and Barlow, 2010). Для подтверждения этой модели Okubo et al. (2009) использовали отслеживание генетических клонов у мышей и показали, что Keratin (K)14-позитивные базальные эпителиальные клетки, расположенные вне вкусовых почек, дают клетки, которые проникают во вкусовые почки и вкусовые сосочки. Однако, K14+ клетки не генерируют исключительно клетки вкусовых почек, эти базальные кератиноциты продуцируют также не вкусовые эпителиальные клетки языка. Итак, предшественники вкусовых почек идентифицируются широко, мало известно о последовательных ступенях в клоне клеток, которые ведут к дифференцировке вкусовых почек. Базальные клетки представляют собой самостоятельный набор клеток внутри вкусовых почек. Они имеют яйцеобразную морфологию и лишены отростков и, как полагают, избирательно экспрессируют Sonic hedgehog (Shh+) (Miura et al., 2001). Однако, точное расположение базальных клеток не определено. Фактически эти клетки определяются по их расположению в базальном компартменте вкусовых почек, как полагают, они функционируют в качестве стволовых клеток вкусовых почек или пролиферирующих предшественников, исходя из экспрессии маркеров и инкорпорации аналогов тимидина, отслеживающих синтез ДНК во время S фазы (Asano-Miyoshi et al., 2008; Perea-Martinez et al., 2012; Sullivan et al., 2010). Напротив, используя экспрессию Shh в качестве маркера базальных клеток, Miura и колл. показали, что Shh-экспрессирующие базальные клетки внутри вкусовых почек являются преимущественно, хотя и не исключительно пост-митотическими и обнаруживают высокую скорость оборота (Miura et al., 2004, 2005). Исходя из этого было предположено, что Shh+ базальные клетки являются пост-митотическими предшественниками для всех или для субнабора дифференцированных типов клеток вкусовых почек (Miura and Barlow, 2010; Miura et al., 2006). Здесь мы использовали отслеживание генетических клонов у взрослых мышей, чтобы проверить эту гипотезу. Мы показали, используя 2 разных репортерных аллеля (CAG-CAT-EGFP, Kawamoto et al., 2000; and R26RLacZ, Soriano, 1999), что Shh-экспрессирующие базальные клетки дифференцируются в клетки, расположенные исключительно во вкусовых почках, и что Shh-производные клетки представляют собой все 3 типа вкусовых клеток в каждом из трех исследованных вкусовых полей (fungiform papillae, FP; circumvallate papilla, CV; soft palate, SP). Далее мы установили, что пропорции меченных клонов Type I, II и III вкусовых почек отражают относительное количества каждого клеточного типа в контрольных вкувовых почках, т.е. Type I клетки оказываются меченными наиболее часто, Type II клетки имеют промежуточную частоту мечения, тогда как меченный клон Type III наименее распространен. Наконец, усилив рыхлое мечение с помощью Rosa26LacZ репортерного аллеля (Soriano, 1999), мы установили, что распределение клонально меченных клеток во вкусовых почках подкрепляет пост-митотическое состояние для базальных клеток, экспрессирующих Shhs. Мы пришли квыводу, что эти клетки не являются популяцией стволовых, а скорее представляют потенциально обязательную ступень предшественников для дифференцировки вкусовых почек. Итак, установлено, что Shh-экспрессирующие базальные клетки это популяция пост-митотических предшественников для каждого из 3 функциональных типов клеток вкусовых рецепторов и выявляют важную ступень прогрессии в клоне клеток первичных рецепторных органов вкусовых почек.

Discussion

Используя как низкой (R26RLacZ) , так и высокой (CAG-CAT-EGFP) эффективности репортерные аллели Cre recombinase и уникальные маркеры качественных особенностей вкусовых клеток, мы показали, что Shh-экспрессирующие базальные клетки внтри почек являются непосредственными предшественниками всех 3 дифференцированных типов вкусовых клеток. Мы получили качественно сходные результаты с обоими репортерами. Более того, наши результаты с низкой эффективностью генетического мечения строго подтвердили предыдущие находки, что Shh-экспрессирующие базальные клетки не являются пролиферативными или стволовыми клетками для вкусовых почек, а скорее представляют временную пост-митотическую популяцию (Miura et al., 2004). Недавно др. группа также сообщила, что Shh-позитивные клетки дают Type III вкусовые клетки, иммунореактивные к carbonic anhydrase IV в CV вкусовых почках и подтвердила оборот этих базальных клеток (Takeda et al., 2013). Однако, наше исследование представляет всесторонний и количественный анализ клонов Shh-экспрессирующих базальных клеток, показавшее их вклад во все типы вкусовых почек в каждом из 3 основных полей вкусовых ощущений, the FF, CV и SP.

Two Reporter Alleles Provide Confirmatory Results But With Different Labeling Efficiencies

В нашем исследовании по картированию судеб Shh+ базальных клеток, R26RLacZ и CAG-CAT-EGFP репортерные аллели предоставили качественно идентичные результаты в ответ на активацию CreER, согласующиеся с опубликованными сообщениями по отслеживанию клонов с использованием обоих репортеров в др. тканях (Bi et al., 2011; Schuller et al., 2008; Zhang et al., 2010). Однако, наш количественный анализ выявил достоверные отличия в эффективности репортеров, обусловленные, скорее всего, различиями в молекулярной структуре репортеров. Do-первых, Cre recombinase менее эффективна, когда увеличивается расстояние между исследуемыми loxp сайтами, и т.о., более высокие уровни Cre энзима необходимы с увеличением расстояния между loxp (Vooijs et al., 2001). Как следствие между loxp сайтами в R26RLacZ аллеле (~2.5 kb) (Soriano, 1999) расстояние значительнее, чем в CAG-CAT-EGFP аллеле (~1.1 kb) (Kawamoto et al., 2000), поэтому более высокие уровни Cre необходимы для рекомбинации R26RLacZ репортера. Во-вторых, CAG промотор приблизительно в 10 раз более мощный, чем промотор Rosa26 у временно трансфицированных или в стабильно интегрированных ES клетках мыши (Chen et al., 2011). В-третьих, R26RLacZ аллель содержит кодирующую последовательность для одной копии LacZ гена, ассоциированного с локусом Rosa26, тогда как CAG-CAT-EGFP трансген содержит множественные копии EGFP репортера, расположенных тандемно голова-хвост. Поэтому репортер CAG-CAT-EGFP создает существенное умножение сигнала по сравнению с R26RLacZ аллелем и, скорее всего, вносит значительно больший вклад в эффективность мечения CAG-CAT-EGFP.

Одна дополнительная экспериментальная перемена может вносить вклад в репортерную эффективность в нашем исследовании; разные транспортеры были использованы для разбавления tamoxifen, минеральное масло для R26RLacZ и кукурузное масло для CAG-CAT-EGFP. Однако, вряд ли значительные различия в экспрессии наблюдаемые для репортерных аллелей могут быть приписаны этим отличиям транспортеров (vehicles), т.к. мы не наблюдали различий в эффективности репортеров из-за этого (Thirumangalathu and Barlow, unpublished data).Сходным образом, не выявлены отличия при прямом сравнение этих масел при tamoxifen-индуцибельном Cre-lox картировании судеб в кишечном эпителии (D. Breault, personal communication). Тем не менее мы не можем исключить, что использование метаболически инертных масел в качестве транспортера вызывает более ограниченное мечение в экспериментах с репортером R26RLacZ.

Shh+ Basal Cells Are Not Stem Cells, But Are Immediate Post-Mitotic Precursors of Taste Cells

Вкусовые клетки возобновляются от делящихся кератиноцитов вне вкусовых почек (Okubo et al., 2009), тогда как клетки внутри вкусовых почек в основном пост-митотические (Beidler and Smallman, 1965; Harrison et al., 2011; Nguyen et al., 2012). Однако, случайные пролиферирующие клетки внутри почки были описаны (Hirota et al., 2001; Perea-Martinez et al., 2012; Sullivan et al., 2010), это привело к предположению, что вкусовые почки предоставляют убежище находящейся в них популяции пролиферативных базальных клеток. Shh экспрессируется многими из этих базальных клеток и Miura с колл. показали, используя BrdU birthdating, что большое число Shh+ базальных клеток являются пост-митотическими (Miura et al., 2006). В соответствии с этим результатом при нашем картировании с низкой эффективностью с помощью R26RLacZ, мы установили, что Shh+ производные клетки появляются по одиночке, тогда как меченые дублеты не встречались (данные не показаны), независимо от продолжительности индукции тамоксифена или исследованного вкусового поля. Более того, мы установили одиночные меченные клоны, овоидные клетки оказывались расположены в базальном компартменте, где находятся Shh+ базальные клетки и при увеличении времени отслеживания индивидуальные клонально меченные клетки приобретали удлиненную морфологию дифференцированных клеток вкусовых рецепторов. Время этого перехода соответствует известной продолжительности дифференцировки вкусовых клеток. Для Type II и Type III клеток, дифференцировка, включая экспрессию соотв. иммуномаркеров для типа клетки и достижение веретенообразной морфологии, занимает 3-6 дней после последнего клеточного деления (Cho et al.,1998; Hamamichi et al., 2006; Perea-Martinez et al., 2012). Наконец, маловероятно, что одиночные производные клетки появляются благодаря апоптическим процессам внутри вкусовых почек регулярно элиминируя sibling клетки, поскольку клеточная гибель внутри вкусовых почек чрезвычайно редка (Cohn et al., 2010; Nguyen et al., 2012; Zeng and Oakley, 1999). Т.о., наши данные согласуются с пост-митотическим статусом Shh+ базальных клеток, хотя мы не можем исключить, что дополнительные Shh-негативные базальные клетки могут располагаться внутри почек и сохранять способность к клеточным делениям.

Shh+ Cells Differentiate Into Each of the Three Taste Cell Types and Do So in Proportion to the Abundance of Each Type in Mature Buds

Используя панель иммуномаркеров для каждого типа дифференцированных вкусовых клеток, мы показали, что Shh+ базальные клетки дают Type I, II и III клетки и что пропорция производных Shh+ клеток, дифференцирующихся в каждый тип приблизительно сравнима с их относительным количеством ву зрелых вкусовых почках.

Type I клетки в целом представляют приблизительно половину дифференцированных клеток внутри вкусовых почек (Bartel et al., 2006; Murray, 1993), хотя точную пропорцию трудно установить в секционном материале из-за сложной и запутанной морфологии этих клеток. Однако, с помощью anti-NTPDase2 иммуно-окрашивания диспергированных препаратов клеток вкусовых точек мы установили, что приблизительно 50% Shh-производных клеток в самом деле клетки Type I . Type II клетки составляю приблизительно 20% о веретенообразных клеток во вкусовых почках во всех трех вкусовых полях (CV: Ma et al., 2007; FF and SP: Ohtubo and Yoshii, 2011). В нашем исследовании по отслеживанию клонов, пропорция производных от Shh+ клеток Type II составляла 10-20% при использовании R26RLacZ репортера, тогда как с аллелем CAG-CAT-EGFP, Type II клетки представляли 20-30% происходящих лот Shh клеток, опять же количество грубо согласуется с превалирование клеток этого типа в зрелых вкусовых почках. Type III были менее многочисленны, особенно в FF и SP, где эти Snap25+ клетки представляли 6 и 5%, соотв., из клеток в каждой из почек (Ohtubo and Yoshii, 2011). Type III клетки более многочисленны в CV вкусовых почках, оцениваемые с помощью иммунореактивности на серотонин (Kim and Roper, 1995), он и составляют 15% клеток на вкусовую почку (Ma et al., 2007). В соответствии с их менее частым появлением, в общем-то меньше Shh+ производных клеток дифференцируется в Type III клетки; не более 4% в FF или SP или 8% в CV клеток Type III обнаруживают экспрессию репортера (and see Table 1).

Почему мечение Type III значительно менее частое, чем ожидается? Во-первых, Type III клетки, как было установлено недавно, живут значительно дольше, чем клетки Type II, с периодом полужизни (half lives) в 22 в противовес 8 дням, соотв. (Perea-Martinez et al., 2012). Т.о., Type III клетки обновляются примерно в 3 раза менее часто, чем клетки Type II, это должно сказываться на ограничении мечения Type III клеток в нашем исследовании. Во-вторых, Shh может экспрессироваться на более низких уровнях или в течение более короткого периода в базальных клетках, предназначенных стать клетками Type III, так что уровни Cre recombinase, управляемой промотором Shh не всегда достаточны, чтобы активировать экспрессию генов в клетках, предназначенных дифференцироваться в клетки Type III. В третьих, в исследованиях на мышиных эмбрионах, Shh-экспрессирующие вкусовые плакоды дают начало дифференцированным клеткам Type I и II у пост-митотических мышей; Type III клетки не встречались (Thirumangalathu et al., 2009). Т.о., у эмбрионов могут присутствовать Shh-негативные предшественники для Type III клеток во вкусовых почках взрослых. Одним из возможных кандидатов является популяция базальных клеток, экспрессирующих Mash1, обнаруживаемая во вкусовых почках взрослых (Kusakabe et al., 2002; Miura et al., 2003; Nakayama et al., 2008). Mash1 bHLH транскрипционный фактор также избирательно экспрессируется в NCAM-иммунореактивных Type III клетках (Miura et al., 2006; Seta et al., 1999, 2006), это указывает на участие Mash1 в дифференцировке этго типа клеток. Интересно, что некоторые, но не все Shh-экспрессирующие базальные клетки одновременно экспрессируют Mash1, в то время как некоторые базальные клетки, по-видимому, экспрессируют Mash1 и Shh (Miura et al., 2006). Остается протестировать, действительно ли эти паттерны экспрессии маркируют разные популяции базальных клеток, предназначенных давать разные типы вкусовых клеток.

Prolonged Tamoxifen Induction Does Not Increase Reporter Activation as Expected

Предоставляя тамоксифен ad libitum свыше 3-х недель, не наблюдали драматического увеличения количества меченных клонов, как ожидалось. Фактически, CV, этот экспериментальный образец, по-видимому, снижал эффективность мечения. Имеется несколько возможных объяснений. Во-первых, активность CreER сама по себе может быть вредной, как было показано, вызывает увеличение апоптоза у развивающихся эмбрионов (Naiche and Papaioannou,2007). Продолжительная локализация CreER в ядре, вызываемая тамоксифеном, может, скорее всего, вызывать клеточную гибель Shh+ клеток и их производных во вкусовых почках. Кроме того, накопление тамоксифена во время продолжающейся дозировки может приводить к цитотоксичности. Недавно Zhu с колл. показали, что субнабор кишечных стволовых клеток неожиданно оказался чувствительным к тамоксифену, т.к. они подвергались апоптозу, когда мыши обрабатывались обычными дозами, при отслеживании клонов (Zhu et al., 2013). Безусловно продолжительное воздействие тамоксифена вызывает достоверную, хотя и обратимую потерю веса тела (Kiermayer et al., 2007), указывая, что тамоксифен может широко влиять на общий гомеостаз у мышей. Наконец возможно, что тамоксифен, действуя как антагонист эстрогена, может влиять на возобновление вкусовых клеток до некоторой степени, более специфически. Как клетки ацинусов, так и протоков из Ebner's слюнных желез CV экспрессируют рецепторы эстрогена, в частности ERβ (Valimaa et al., 2004), as do minor salivary glands of the oral cavity (Tsinti et al., 2009). Т.к. слюнные железы секретируют цитокины, которые, как было установлено, влияют на обновление клеток (Morris-Wiman et al., 2000), поэтому изменение передачи сигналов эстрогена в von Ebner's и др. слюнных железах может влиять на секрецию важных сигналов для поддержания вкусовых почек.

How and When Do Shh+ Basal Cells Commit to a Specific Taste Cell Fate and What Is the Role of SHH in This Process?

Преходящее унижение клеток вну вкусовых почек генерирует клетки вкусовых предшественников, чья судьба может быть детерминирована прежде или тогда, когда они закончат свои терминальные деления, вступают в почку и начинают экспрессировать Shh. Альтернативно, судьба типов вкусовых почек может детерминироваться только после того, как Shh+ предшественники оказываются во вкусовой почке. Независимо от времени спецификации судеб, локальные сигналы, скорее всего, влияют на выбор клеточной судьбы. Базируясь на паттернах экспрессии в и вокруг зрелых вкусовых почек, предполагается ряд сигнальных путей, которые могут быть, скорее всего, кандидатами, включая Wnt/β-catenin, BMP и SHH (Feng et al., 2014; Gaillard and Barlow, 2011; Nguyen and Barlow, 2010; Miura et al., 2001). Определенно, Shh+ базальные клетки, как полагают, передают сигналы соседним стволовым и TA клеткам, т.к. последние экспрессируют как SHH рецептор Ptch, так и Gli1, ген мишень для SHH (Miura et al., 2001); однако, точная функция SHH в дифференцировке вкусовых клеток ещё предстоит определить.

Эти хорошо известные морфогены, также как др. локальные сигналы, скорее всего, регулируют экспрессию специфических регуляторов транскрипции для каждого типа вкусовых клеток. Напр., Pou2F3 (Skn-1a), гомеодоменовый транскрипционный фактор, избирательно экспрессируется в клетках Type II и необходим для их дифференцировки и/или поддержания (Matsumoto et al., 2011). Pou2F3 экспрессируется также в небольшой популяции базальных клеток внутри вкусовых почек, подтверждая, что Pou2F3 может предопределять судьбу клеток Type II пост-митотически в Shh-экспрессирующих предшественниках. Сходным образом, Mash1, специфичный для Type III клеток транскрипционный фактор, также экспрессируется в субнаборе Shh-экспрессирующих базальных клеток (Miura et al., 2006) (and see discussion above), и необходим для развития клеток Type III у эмбрионов (Seta et al., 2011). Хотя большинство Shh-экспрессирующих клеток дифференцируются в клетки Type I, гены, ассоциированные с судьбой клеток Type I полностью неизвестны.

Итак, наши результаты установили, что Shh-экспрессирующие базальные клетки как общие предшественники всех трех типов вкусовых клеток, не исключают существования дополнительных Shh-негативных предшественников, которые д. давать отличающиеся пропорции или наборы вкусовых клеток. В частности, все вкусовые почки содержат, по крайней мере, 5 функциональных категорий клеток вкусовых рецепторов, которые определяют сладкое, горькое, умами, кислое и/или солёное, а также поддерживающие клетки Type I и действительно ли все эти функциональные подтипы клеток возникают из Shh+ предшественников предстоит определить.

Sonic hedgehog–expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells Hirohito Miura, Jennifer K. Scott, Shuitsu Harada and Linda A. Barlow Developmental Dynamics Volume 243, Issue 10, pages 1286–1297, October 2014

Sonic hedgehog–expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells
Hirohito Miura, Jennifer K. Scott, Shuitsu Harada and Linda A. Barlow
Developmental Dynamics Volume 243, Issue 10, pages 1286–1297, October 2014