Передача сигналов Notch эволюционно законсервированный механизм, важный для координации пролиферации и дифференцировки многих предшественников во множественных органах и тканях во время развития (Gaiano and Fishell, 2002; Hitoshi et al., 2002; Murtaugh et al., 2003; Dontu et al., 2004; Sander and Powell, 2004; Nobta et al., 2005; Bolos et al., 2007; Laky and Fowlkes, 2008; Aguirre et al., 2010). У млекопитающих имеются 4 Notch рецептора (Notch1-4) и 5 Notch лигандов, наз. Jagged (Jag1 и Jag2) и Delta-like (Dll1, Dll3 и Dll4). После связывания с помощью соединенного с мембраной лиганда на соседней клетке Notch рецептор подвергается протеоличтическому расщеплению, которое вызывает высвобождение Notch intracellular domain (NICD). NICD затем транслоцируется в ядро клетки реципиента, где он образует комплексы с транскрипционными ко-активаторами, чтобы воздействовать на эффекторные для Notch гены (Oswald et al., 2001). Во время нейрального развития Notch лиганды и рецепторы экспрессируются в виде перекрывающихся, но различающихся паттернов в центральной и периферической нервной системе и играют жизненно важную роль в пролиферации, поддержании и дифференцировке нейральных предшественников (Louvi and Artavanis-Tsakonas, 2006). Напр., передача сигналов Notch необходима для поддержания клеток предшественников, спецификации Мюллеровых клеток и ингибировании клеточных судеб фотороцепторов sj shtvz ретиногенеза (Jadhav et al., 2006a, 2006b; Yaron et al., 2006; Hayes et al., 2007; Riesenberg et al., 2009; Nelson et al., 2011; Luo et al.,2012). В развивающейся вентральной части спинного мозга она участвует в поддержании предшественников и в обеспечении разнообразия подтипов V2 промежуточных нейронов (Yang et al.,2006a; Del Barrio et al., 2007; Peng et al., 2007; Kang et al., 2013). Очевидно, что каждый Notch лиганд может выполнять самостоятельную роль. Напр., во время развития внутреннего уха, Jag1 является критическим для становления просенсорного домена, тогда как Dll1 и Jag2 действуют, чтобы ограничить продукцию волосковых клеток (Kiernan et al., 2005; Hartman et al., 2010). Для предшественников сетчатки и спинного мозга, Dll1 и Dll4 участвуют в их пролиферации. В то время как Dll1, по-видимому, регулирует нейрогенез домен-специфическим способом в спинном мозге (Marklund et al., 2010; Ramos et al., 2010), Dll4, кроме того, необходим для генерации разнообразия нейронов (Del Barrio et al., 2007; Rocha et al., 2009; Luo et al., 2012).
Dll4-обеспечиваемая передача сигналов Notch, как было установлено, важна для сосудистого ремоделирования и артериального ангиогенеза, дифференцировки T клеток и нейрального развития (Liu et al., 2003; Corada et al., 2010; Billiard et al., 2011). В спинном мозге избыточная экспрессия Dll4 приводит к увеличению V2b промежуточных нейронов за счет клеток V2a (Peng et al., 2007). Было предположено, что Dll4 может преимущественно экспрессироваться в V2a предшественниках, чтобы активировать передачу сигналов Notch в соседние V2b предшественники для спецификации промежуточных нейронов V2b (Del Barrio et al., 2007; Peng et al., 2007). Экспрессия Dll4 в субнаборе родоначальников и предшественников в V2 домене согласуется с этой гипотезой (Rocha et al.,2009); , однако, чтобы подтвердить, необходимо продемонстрировать, что Dll4-экспрессирующие родоначальники и предшественники продуцируют промежуточные нейроны V2a. Во время развития сетчатки зависимое от условий устранение Dll4 приводит к снижению пролиферации предшественников и усиливает генерацию фоторецепторов (Luo et al., 2012), участвуя в важной роли Dll4 в спецификации ретинальных типов клеток. Т.к. в спинном мозге Dll4 и др. Delta-like лиганды Dll1 и Dll3 экспрессируются в субпопуляциях ретинальных родоначальников/предшественников (Nelson et al., 2009). Теперь необходимо определить, имеет ли экспрессия Dll4 какую-либо специфичность в родоначальниках/предшественниках, соразмерную его функции в разных типах клеток.
Выявление клонов нейронов из Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников предоставит клеточную основу для понимания Dll4-обеспечиваемой передачи сигналов Notch, ведущей к разнообразию типов клеток в сетчатке и спинном мозге. Преходящая природа экспрессии
Dll4 мешает непосредственному наблюдению потомков Dll4. Поэтому мы использовали стратегию Cre-loxP картирования судеб, чтобы определить клеточные клоны, происходящие из Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников в сетчатке и спинном мозге. Это позволило нам показать, что только определенные типы клеток возникают из Dll4-экспрессирующих родоначалников/предшественников во время развития сетчатки и спинного мозга, подтвердив, что предпочтительная экспрессия родоначальниками/предшественниками вносит вклад в Dll4 функциональную специфичность при спецификации типов клеток.
Discussion
В данном исследовании мы отслеживали клоны от Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников в сетчатке и спинном мозге путем генерации линии BAC трансгенных мышей (Dll4-Cre), которые экспрессируют Cre recombinase для Cre-loxP картирования судеб. Мы определили типы клеток потомков от Dll4-экспрессирующих клеток путем скрещивания Dll4-Cre мышей с Z/EG и R26R-YFP/lacZ репортерными линиями, что сопровождалось анализом иммуноокрашивания антителами против GFP/YFP и маркеров, специфичных для типов клеток. Эти эксперименты привели к заключению, что только избранные типы клеток возникают из Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников во время развития сетчатки и спинного мозга, подтвердив тем самым клеточный механизм функциональной специфичности для Dll4 при спецификации типов клеток.
В сетчатке мы установили, что Dll4-экспрессирующие родоначальники/предшественники дают по существу все амакринные и горизонтальные клетки и большинство фоторецепторов. С др. стороны, только приблизительно половина Brn3b-экспрессирующих ганглиолярных клеток происходит их Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников, которые продуцируют очень мало биполяырных и Мюллеровых клеток. Эти наблюдения согласуются с паттерном экспрессии Dll4 в развивающейся сетчатке, которая преимущественно локализуется в наружном слое нейробластов на эмбриональной стадии. Более того, наши результаты согласуются с предыдщим сообщением, согласно которому судьбы ретинальных клеток, экспрессирующих Dll4 были грубо проверены с помощью анализа экспрессии β-gal в линии Dll4LacZ/+ (Rocha et al., 2009), и было установлено, что они включают амакринные, горизонтальные, ганглиолярные клетки и фторецепторы. Тем не менее, относительно короткий β-gal perdurance ограничивает аккуратность и полноту результатв картирования. Наше исследование по картированию судеб, базирующееся на системе Cre-loxP, оказалось способным осуществить аккуратный и количественный анализ всех клеточных клонов, происходящих из Dll4-экспрессирующих ретинальных родоначальников/предшественников.
В спинном мозге мы установили, что Dll4-экспрессирующие родоначальники/предшественники преимущественно дают клоны V2 клеток, при этом генерируются небольшие количества до немногих клеток для всех др. подтипов промежуточных нейронов и двигательных нейронов вдоль дорсо-вентральной оси, предоставляя объяснение преимущественной роли идентифицированного таким образом Dll4 при бинарной спецификации судеб V2 клеток (Del Barrio et al., 2007; Peng et al., 2007; Misra et al.,2014). Как, Dll4-экспрессирующие родоначальники/предшественники в спинном мозге генерируют по большей части нейрональные потомки и лишь небольшое количество олигодендроцитов и астроцитов, два типа глиальных клеток.
В V2 домене спинного мозга мы установили, что почти все Chx10+ V2a и Sox1+ V2c нейроны генерируются из Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников и лишь приблизительно 38% Gata2+ V2b нейронов происходит из них. Более того, ранние V2b предшественники, как было установлено, лишены экспрессии Dll4 (Misra et al., 2014). Эти наблюдения согласуются с современным пониманием того, как передача сигналов Notch участвует в регуляции диверсификации подтипов V2a и V2b из p2 предшественников. Было предположено, что V2a и V2b нейроны генерируются из клеток общего предшественника, которые экспрессируют комбинацию транскрипционных факторов, включая Lhx3, Gata2, Ascl1 и Foxn4. Dll4, экспрессируемый V2a родоначальниками/предшественниками активирует передачу сигналов Notch в V2b родоначальниках/предшественниках и неавтонмно способствует выбору судьбы V2b, тогда как низкая или отсутствие активности Notch в V2a родоначальниках/предшественниках приводит к генерации автономно клеток V2a (Li et al., 2005; Del Barrio et al., 2007; Peng et al., 2007). В соответстви с этой идеей наши результаты показали, что Dll4 преимущественно экспрессируется V2a и лишь небольшим субнабором V2b родоначальников/предшественников.
Чтобы охарактеризовать клоны Dll4-экспрессирующих родоначальников/предшественников в сетчатке и спинном мозге, мы создали BAC Dll4-Cre линию трансгенных мышей, которая может управлять экспрессией Cre recombinase в специфических популяциях нейрональных родоначальников/предшественников во время эмбриогенеза мыши, в виде пространственного и временного паттерна, воспроизводящего эндегенный Dll4. Т.о., наша Dll4-Cre трансгенная линия может также служить удобным инструментом для изучения Cre-loxP-обеспечиваемой условиями избыточной и/или потери функции в сетчатке и спинном мозге.
