Посещений:
РАЗВИТИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

Роль Ror2

Novel domains of expression for orphan receptor tyrosine kinase Ror2 in the human and mouse reproductive system
Ripla Arora, Eran Altman, Nam D. Tran and Diana J. Laird
Developmental Dynamics Volume 243, Issue 8, pages 1037–1045, August 2014

The noncanonical Wnt receptor and tyrosine kinase Ror2 has been associated with recessive Robinow syndrome (RRS) and dominant brachydactyly type B1. The phenotypes of mouse mutants implicate Ror2 in the development of the heart, lungs, bone, and craniofacial structures, which are affected in RRS. Following a recently identified role of Ror2 in the migration of mouse primordial germ cells, we extensively characterized its expression throughout the fetal internal reproductive system and the postnatal ductal system. Results: We show that Ror2 gene products are present in the germ cells and somatic cells of the testis and the ovary of both the mouse and human fetus. In reproductive tract structures, we find that Ror2 is expressed in the mesonephros, developing Wolffian and M?llerian ducts, and later in their derivatives, the epididymal epithelium and uterine epithelium. Conclusions: This study sets the stage to explore function for this tyrosine kinase receptor in novel regions of expression in the developing reproductive system in both mouse and human. Developmental Dynamics 243:1037-1045, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.


Рисунки к статье

Бесплодие касается приблизительно 14% пар репродуктивного возраста по всему миру и приблизительно 22% замужних женщин репродуктивного возраста в развивающихся странах (Chandra et al., 2013). Широко распространенной причиной бесплодия человека являются дефекты гамет или формирования репродуктивного тракта (Hull et al., 1985; Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine,2012a,b). Взаимодействия между предшественниками гамет у эмбрионов, известных как primordial germ cells (PGCs), и окружающими соматическими клетками важны для оптимальной продукции спермиев и ооцитов. Это соматическое окружение варьирует существенно в зависимости от ст. развития PGC (Wilhelm et al., 2007). Вплоть до колонизации PGCs клетками гонад, они бипотенциальны; гены, способствующие дифференцировке пола, активируются после этого (Kim and Capel, 2006). У мышей на день эмбриогенеза (E) 12.5, мужские и женские гонады дивергируют, поскольку PGCs у самцов агрегируют, оказываются окруженными поддерживающими клетками Сетоли и организуются, чтобы сформировать тяжи тестисов; Напротив в женских гонадах PGCs остаются диспергированными среди др. типов соматических клеток, включая поддерживающие гранулёзные клетки. PGCs в тестисах - обозначаемые как сперматогонии - оказываются митотически арестованными приблизительно на ст. E13.5 и не начинают мейоза и дифференцировку в зрелые спермии вплоть до рождения (Goetz et al., 1984). В женских гонадах PGCs - теперь оогонии - вступают в мейоз приблизительно на ст. E13.5 и организуют сами себя в кисты-подобные структуры во время позднего плодного периода. Оогонии энкапсулируются с помощью поддерживающих гранулёзных клеток, чтобы сформировать примордиальные фолликулы приблизительно к моменту рождения у мышей и во время середины беременности у человека; эти фолликулы впоследствии растут и циклически рекрутируются и овулируют в начале полового созревания (Pepling, 2012).
Эмбриональные предшественники внутренней репродуктивной системы включают Вольфовы протоки, которые развиваются, чтобы сформировать канальцевые структуры самцов, включая эпидидимис, семявыносящие протоки и семенные пузырьки и Мюллеровы протоки, которые развиваются, чтобы сформировать женские канальцевые структуры, включая яйцеводы, матку и верхнюю часть влагалища. Вольфовы протоки присутствуют, начиная со ст. E10.5, а Мюллеровы протоки образуются между E11.5 и E13.5. Эти две параллельные структуры сохраняются в мезонефросах вплоть до E15.5, после чего Мюллеровы протоки регрессируют у самцов в ответ на анти-Мюллеров гормон (известен также как Mullerian inhibitory substance)? секретируемый клетками Сертоли семенников (Behringer et al., 1994; Mishina et al., 1996; Belville et al., 1999; Hoshiya et al., 2003). В отсутствие анти-Мюллерова гормона Мюллеровы протки сохраняются, а Вольфовы протоки регрессируют у самок (Staack et al., 2003).
Ключевым механизмом детерминации пола самок является путь передачи сигналов Wnt. Мутации в Wnt4 и членов Wnt пути Rspo1 и β-catenin вызывают частичное превращение женского в мужской пол у мышей (Kim et al., 2006; Maatouk et al., 2008; Chassot et al., 2011). Мутации в Wnt4 человека ассоциированы с двумя синдромами: Serkal синдром (OMIM#611812), характеризующийся реверсией женского пола в мужской (Mandel et al., 2008), и Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser синдром (OMIM#277000), характеризующийся гипоплазией матки и аномалиями Мюллеровых протоков (Sultan et al., 2009). Несмотря на важность пути передачи сигналов Wnt в развитии женских гонад и протоков, рецептор для передачи сигналов Wnt во внутренней репродуктивной системе всё ещё не идентифицирован.
Ген Ror2 кодирует рецепторную тирозин киназу и считается рецептором для неканонического Wnt лиганда Wnt5a (Oishi et al., 2003; Minami et al., 2010). Доменовая структура Ror2 представлена N-терминальным сигнальным пептидом, Ig-подобным внеклеточным доменом, богатым цистеином frizzled-подобным доменом (Wnt лиганд связывающий домен), kringle доменом и единственным трансмембранным доменом; при этом цитозольный хвост содержит рецепторный тирозин киназный домен и богатый пролином внутриклеточный домен (Masiakowski and Carroll, 1992). Мутации в гене Ror2 ассоциированы с двумя крупными синдромами у человека: доминантной Brachydactyly type B1 (BDB1, OMIM#113000) (Afzal and Jeffery, 2003) и Recessive Robinow Syndrome (RRS, OMIM#268310) (van Bokhoven et al., 2000). BDB, который характеризуется укорочением пальцев и слиянием средних пальцев, ассоциирует со специфическими мутациями с избыточной функцией на C конце ROR2 белка, преимущественно в богатом серином треонином или тирозин киназном домене. Фенотип аутосомно доминантный и проявляется в гетерозиготном состоянии. Напротив, RRS ассоциирует с мутациями, возникающими по всему белку и обычно вызывающими потерю функции у гомозигот. Клинические признаки RRS включают дисморфные лицевые структуры, карликовость, брахидактилию с укороченными конечностями, врожденные пороки сердца в некоторых случаях и гипопластические наружные гениталии (Afzal et al., 2000; Oldridge et al., 2000; van Bokhoven et al., 2000; Schwarzer et al., 2009).
Из-за участия ROR2 в RRS и BDB, его экспрессию изучали активно на крупных органаз, таких как сердце, конечности, кости и хрящи (Al-Shawi et al., 2001; Matsuda et al., 2001), однако паттерн экспрессии не был проанализирован в развивающейся репродуктивно системе. Более того, гипоплазия гениталий, ассоциированная с синдромом RRS, по-видимому, пресекала любой анализ плодовитости или зародышевых клеток у таких пациентов. Мыши, гомозиготные по нулевому аллелю Ror2 являются перинатальными леталями и ограничивают анализ вклада этого гена в репродуктивную функцию (DeChiara et al., 2000; Takeuchi et al., 2000). Роль Ror2 в развитии репродуктивной системы распознана недавно, когда была установлена его функция в ранней миграции зародышевых клеток (Laird et al., 2011) у мышей. В др. исследовании самцов мыши, гомозиготных по точечной мутации Ror2, Ror2W749X с пониженной плодовитостью, хотя причина была неясна, поскольку спермии от этих мышей были подвижны и функциональны (Raz et al., 2008). В свете этих репродуктивных фенотипических отклонений у двух мутантов Ror2 мыши, мы систематически проверяли паттерн экспрессии Ror2 в развивающихся гаметах и репродуктивной системе во время дифференцировки пола и позднее. И у мышей и у человека мы показали, что Ror2 динамично экспрессируется в зародышевых клетках самцов и самок во время эмбрионального развития. Ror2 был также обнаружен в возникающих структурах протоков у эмбрионов, в матке взрослых мышей и людей и в эпителии эпидидимиса у постнатальных мышей.

Results and Discussion


Ror2 is Expressed in the Developing Mouse Gonads and Ducts


Ror2 персистирует в Вольфовых и Мюллеровых протоках самцов и самок на ст. E13.5 (Fig. 1E',F' blue and pink arrows).

Ror2 is Localized to the Membrane of Transfected HEK-293T Cells Using Different Antibodies


Все три использованные моноклональные антитела против Ror2 обнаруживались на ст. E12.5 в лёгочной ткани мышей, которые экспрессировали высокие уровни транскриптов Ror2 (Al-Shawi et al., 2001; Matsuda et al., 2001) и полностью отсутствовали в эпителии Ror2-/- лёгких (Fig. 3B). Затем эти антитела использовали, чтобы охарактеризовать экспрессию Ror2 у эмбрионов и постнатальных мышей на срезах гонад, также охарактеризовать экспрессию ROR2 на срезах плодных гонад человека и в матке взрослых женщин (Figs. 6, 7).

Ror2 is Expressed in the Mouse Fetal Testis and Ovary


Среди сигнальных механизмов, стоящих ниже Ror2 находятся β-catenin зависимый (канонический) и насколько ответвлений неканонического Wnt пути, включая planar cell polarity (PCP) (Minami et al., 2010). Wnt5a остается единственным лигандом, связывающим Ror2 in vivo (Oishi et al., 2003), хотя биохимическая ассоциация была продемонстрирована и с др. Wnts посредством домена, богатого цистеином, Ror2 (Mikels and Nusse, 2006; Yamamoto et al., 2008). Wnt5a активируется с помощью интерстициальных клеток развивающихся тестисов мышей, но не яичников во время дифференцировки пола (Chawengsaksophak et al., 2012); это указывает на то, что Wnt5a может действовать как лиганд для Ror2 в семенниках мышей. Wnt4, который, как было установлено, действует посредством и канонического и не канонического пути, экспрессируется в гранулёзных клетках (Kim et al., 2006) и, следовательно, является потенциальным лигандом для Ror2 в яичниках плодов (Liu et al., 2010; Naillat et al., 2010).
В развивающихся гонадах самцов на ст. E14.5 экспрессия Ror2 была выявлена с помощью иммунофлюоресценции (IF) и E-Cad экспрессирующих зародышевых клеток. Ror2 экспрессируется также в клетках Сертоли в тяжах тестисов (Fig. 4A' yellow arrows). Этот паттерн экспрессии сохраняется в E18.5. На ст. E12.5 у самок экспрессия Ror2 обнаруживалась с помощью IF в SSEA1-позитивных зародышевых клетках, а также в SSEA1-негативных поддерживающих клетках в мезенхиме (Fig. 5A,A'). Тщательная проверка выявила совместную локализацию Ror2 в Foxl2 позитивных гранулёзных клетках и некоторых Oct4-ΔPE-GFP позитивных зародышевых клетках E14.5 яичников (Fig. 5D,D', germ cells: yellow asterisks, granulosa cells: yellow arrows). Интересно, что паттерн экспрессии Ror2, по-видимому, демаркирует зачатки яйцеклеток и фолликулов яичников, поскольку он маркирует Foxl2 позитивные гранулёзные клетки, окружающие кисты зародышевых клеток (Fig. 5D'). Спустя день E15.5 экспрессия подавляется в E-Cad позитивных зародышевых клетках и сохраняется только в Foxl2 позитивных гранулезных клетках cell (Fig. 5E,E').

Паттерн экспрессии Ror2 в соматических клетках гонад может предоставить пригодный маркер для очистки новой популяции клеток в дополнение к имеющейся информации. В ранних дифференцирующихся тестисах и овариях мышей Ror2 очерчивает тяжи тестисов и зачатки яйцеклеток и фолликулов яичников, соотв. Хотя тяжи тестисов можно различать по морфологии, начиная со ст. E12.5, этого не происходит в отношении зачатков яйцеклеток и фолликулов яичников и нет маркера для ранней идентификации этой структуры (Pepling, 2012). Благодаря присутствию Ror2 позитивных соматических клеток, окружающих агрегаты оогоний на ст. E14.5 и E15.5, Ror2 обладает потенциалом к использованию в качестве маркера зарождающихся зачатков яйцеклеток и фолликулов яичников. Напротив, гетерогенная экспрессия Ror2 может определять важное состояние развития в компартменте зародышевых клеток. На ст. E14.5, мы наблюдали Ror2 в немногих Oct4-ΔPE-GFP позитивных зародышевых клетках и на ст. E15.5, Ror2 полностью отсутствовал в E-Cad позитивных зародышевых клетках. Это наблюдение ставит вопрос, образуют ли Ror2 позитивные зародышевые клетки самостоятельную популяцию, отличающуюся от Ror2-негативных клеток. Альтернативно возможно, что все зародышевые клетки проходят через Ror2 позитивное состояние, как часть онтогенетической прогрессии, такой как вступление в мейоз. Соотв. экспрессия Ror2 в зародышевых клетках самцов контрастирует с более динамичной и гетерогенной экспрессией в зародышевых клетках самок, совпадающей с инициацией мейоза, возникают вопросы относительно роли во время половой дифференцировки зародышевых клеток, которые можно будет разрешить с помощью обусловленных нокаутов.

Ror2 is Detected in the Epithelium of Developing Ducts Postnatally


Ror2 обнаруживается в эпителии эпидидимиса самцов на ст. P0 и P21 с помощью IF (Fig. 6A,B). У самок экспрессия обнаруживается в эпителии взрослой матки и др. происходящих из протоков эпителиях, окружающих яичники (Fig. 6C,D). Экспрессия Ror2 присутствует в маточных железах на день беременности (GD) 11 (Fig. 6E' white arrow). Тщательная проверка выявила, что обогащение Ror2 было выше на базальной стороне эпителия матки (Fig. 6E' yellow arrow) по сравнению с просветной стороной эпителия (Fig. 6E,E'). Экспрессия Ror2 на просветной стороне матки не была описана ранее (Hatta et al., 2010). Это небольшое расхождение в паттернах экспрессии может быть объяснено чувствительностью детекции разных используемых антител.
В развитии женского репродуктивного тракта (FRT) участвуют несколько не канонических Wnt лигандов, включая Wnt4, Wnt5a, Wnt7a и Wnt9b. Wnt7a-дефицитные самки бесплодны благодаря аномальному развитию яйцеводов и матки, происходящих из Мюллеровых протоков (Parr and McMahon, 1998). Мутации в Vangl2, ключевом компоненте PCP и не канонической передачи сигналов Wnt, приводят к FRT фенотипу, сходному с таковым у Wnt7a мутантов. У Vangl2Looptail мутантов рога матки неспособны сливаться в шейке, сворачивание в спираль маточных труб теряется и эпителий матки оказывается дезорганизованным (Vandenberg and Sassoon, 2009). FRT дефекты были также описаны в отсутствие др. компонентов PCP, включая Celsr1, делеция которого приводит к стерильности, и Celsr2, когда мутантные самки обнаруживают атрезию влагалища (Boutin et al., 2012). Несмотря на участие множественных рецепторов Wnt, включая Fzd3 и Fzd6 в передаче сигналов PCP в др. органах, ни один из них не обнаруживает влияние на эмбриональное или постнатальное возникновение FRT (Wang et al., 2006; Stuebner et al., 2010). PCP фенотипы, наблюдаемые в слуховой улитке мыши, нервной трубке и в гаструляции xenopus у Ror2 дефицитных эмбрионов (Schambony and Wedlich, 2007; Gao et al., 2011) делают Ror2 подходящим кандидатом на роль рецептора, обеспечивающего не каноническую передачу сигналов Wnt-PCP. В репродуктивном развитии самцов бесплодие описывается у трети самцов, несущих две копии гипоморфого аллеля гена Vangl2, несмотря на кажущиеся нормальными копуляторные пробки и вид спермиев (Guyot et al., 2011). Сходным образом, самцы мышей, гомозиготные по точечной мутации в Ror2, Ror2W749X, обнаруживают частично проявляющееся бесплодие, несмотря на кажущееся незатронутым качество спермиев (Raz et al., 2008). Сходство фенотипов мутантов Ror2 и Vangl2 у самцов и у мутантов по не каноническому Wnt лиганду и мутантов Vangl2 у самок может указывать, что эти гены оперируют в общем Ror2 обеспечиваемом пути передачи сигналов PCP во время развития репродуктивного тракта.

ROR2 Expression is Detected in Human Embryonic Gonads and Ducts


Гаметогенез у людей хотя и менее изучен, чем у мышей, он обладает общими клеточным и молекулярным механизмом. Зародышевые клетки человека более затяжные, чем у мышей, при этом митотический арест у мужчин и вступление в мейоз у женщин наступает на 10 неделе по сравнению со ст. E13.5 у мышей. Консервативная RNA helicase VASA экспрессируется человеческими PGCs during migrationво время миграции в гонадный гребень и во время митотического ареста или инициации мейоза, хотя она подавляется в субнаборе менее дифференцированных PGCs около 11 недель (Anderson et al., 2007; Gkountela et al., 2013). Мы использовали мышиные anti-hROR2 антитела, чтобы исследовать экспрессию во втором триместре эмбриональные гонады человека. В 18 недельных семенниках человека, ROR2 обнаруживается на мембране в VASA позитивных зародышевых клетках, расположенных в тяже; более низкий уровень экспрессии ROR2 присутствует в др. клетках внутри тяжей тестисов и в окружающих поддерживающих клетках (Fig. 7A). В 16 недельных яичниках женщин иммуноокрашивание на ROR2 выявляется в некоторых, но не во всех VASA позитивных зародышевых клетках, а также в др. клетках (Fig.7B). Это подкрепляет предыдущее наблюдение, что во втором триместре VASA позитивные зародышевые клетки человека являются гетерогенной популяцией, это оставляет открытой возможность экспрессии ROR2 в VASA негативной популяции зародышевых клеток (Gkountela et al., 2013) или во внезародышевых клетках. Как и у мышей экспрессия ROR2 выявляется в зародышевых клетках развивающихся гонад у мужчин и женщин, при этом экспрессия в зародышевых клетках женщин оказывается гетерогенной. Кроме того, экспрессия ROR2 выявляется в эпителии 20 недельного эпидидимиса человека (Fig. 7C) и 21 недельной матке (Fig. 7D), это сравнимо с экспрессией ROR2 в протоках, наблюдаемой у мышей (Figure 6). Предыдущая работа показала сходный паттерн экспрессии Ror2 у мышей и кур (Stricker et al., 2006), это открывает возможность консервативности его функции у позвоночных. Здеь мы показали сходство паттерна экспрессии у мыши и человека.
Наш анализ Ror2 РНК транскриптов и белка открыл множественные новые домены экспрессии и заложил основу для разрешения важных вопросов касательно функции PCP и не канонического сигнального пути Wnt в развитии гамет, поддерживающих клеток гонад и протоков репродуктивного тракта.