У эмбрионов позвоночных клетки ретинальных предшественников первоначально специфицированы в переднем нейроэктодермальном регионе, известном как глазное поле. Во время развития этот пул мультипотентных клеток пролиферирует и в специфической временной последовательности дает все типы клеток зрелой сетчатки. Мы всё ещё далеки от полного понимания лежащих в основе механизмов, а также роли каждого из молекулярных компонентов.

Одной из первых ступеней в развитии сетчатки является миграция проспективных ретинальных предшественников в глазное поле, где они воспринимают соотв. сигналы, поддерживающие пролиферацию этих клеток и управляют детерминацией судеб клеток сетчатки. Топографическое расположение глазного поля соответствует переднему региону, где сигналы BMP, Wnt и Nodal репрессируются, а передача сигналов IGF и FGF активна (rev. Andreazzoli, 2009). Специфическая комбинация этих сигналов делает возможной соотв. экспрессию Eye Field Transcription Factors (EFTFs), которые отвечают за предопределение свойств ранних ретинальных предшественников и запускают последующие фазы развития глаз (Zuber et al., 2003). Фактически, совместная инъекция EFTFs, или их активатора Noggin, достаточна, чтобы индуцировать ретинальную судьбу в плюрипотентных эктодермальных клетках, которые после трансплантации способны генерировать сетчатку полностью (Viczian et al., 2009; Lan et al., 2009).

Среди EFTFs, критическую роль играет Rx1 (также известен как Rax), это транскрипционный фактор с paired-подобным гомеодоменом, необходим для развития сетчатки у позвоночных (Mathers et al., 1997; Andreazzoli et al., 1999; Bailey et al., 2004; Muranishi et al., 2012). Rx1 экспрессируется в глазном поле и в пролиферирующих предшественниках сетчатки глазного пузырька, тогда как его экспрессия постепенно подавляется, когда происходит дифференцировка нейронов, за исключением фоторецепторов и клеток Мюллеровой глии (Casarosa et al., 1997; Furukawa et al., 1997, 2000; Pan et al.,2010). У Xenopus в конце ретиногенеза экспрессия Rx1 в основном ограничивается Ciliary Marginal Zone (CMZ), нишей для ретинальных стволовых клеток, которая генерирует все типы ретинальных клеток в течение всей жизни животных (Perron and Harris, 2000). Rx1 участвует в контроле нескольких ступеней развития сетчатки. Самой ранней из описанных функций Rx1 является обеспечение миграции потенциальных ретинальных предшественников в глазное поле (Kenyon et al., 2001). Rx1 затем поддерживает ретинальные предшественники глазного поля и глазного пузырька в пролиферативном мультипотентном состоянии (Andreazzoli et al., 2003; Casarosa et al., 2003; Zaghloul and Moody, 2007). Сходная роль, по-видимому, выполняется и в CMZ , где Rx1 экспрессируется как в ретинальных стволовых клетках, так и в пролиферирующих предшественниках. У рыб Rx3, функциональный гомолог Rx1, как было установлено, управляет выбором клеточной спецификации предшественников переднего мозга в направлении выбора ретинальной судьбы (Stigloher et al., 2006; Bielen and Houart, 2012). Более того, Rx3 необходим для клеточной миграции, которая управляет эвагинацией глазного пузырька (Rembold et al., 2006). Наконец, Rx1 также выполняет более позднюю функцию во время ретиногенеза путем предопределения фоторецепторов и Мюллеровой глии (Furukawa et al., 2000; Nelson et al., 2009; Pan et al., 2010; Muranishi et al., 2011).

Лишь немногие исследования, базирующиеся на поиске генов кандидатов, идентифицировали некоторые гены, регулируемые с помощью Rx1. На ст. ранней нейрулы способность Rx1 способствовать пролиферации и задержке дифференцировки нейронов у Xenopus , по крайней мере, частично обеспечивается активацией Zic2, Hes4 (ранее известному как Hairy2), Cyclin D1, Xhmgb3 и myc, а также за счет репрессии p27Xic (Andreazzoli et al., 2003; Terada et al., 2006). Rx3, как было установлено, позитивно регулирует Nlcam во время эвагинации глазного пузырька у медака и cxcr4 во время морфогенетического разделения предшественников глазного поля и телэнцефалона у рыбок данио (Brown et al., 2010; Bielen and Houart., 2012). Во время ретиногенеза у мышей Rx1 индуцирует Мюллерову глию, контролируя экспрессию Notch1 и Hes1 , и фоторецепторы посредством активации Otx2 (Furukawa et al., 2000; Muranishi et al., 2011). Мы недавно детально анализировали способность Rx1 репрессировать эндомезодермальные гены, которые, как известно, ингибируют выбор ретинальной судьбы (Giannaccini et al., 2013). Здесь идентифицированы новые Rx1-регулируемые гены, некоторые из которых являются предполагаемыми непосредственными мишенями, участвующими в регуляции транскрипции, миграции и адгезии клеток и в пролиферации клеток.

Figure 1. A: Venn diagram identifying the overlap of genes regulated in gain- and loss-of-function experiments. B: Pie chart of genes coherently regulated by Rx1. Percentages of each group classified according to their putative molecular function are indicated.

Discussion

Благодаря центральной роли, выполняемой Rx1 в развитии сетчатки, идентифицированные молекулярные пути, контролируемые этим транскрипционным фактором, представляют важную ступень в направлении раскрытия основных механизмов, лежащих в основе свойств ретинальных предшественников и возможно ретинальных стволовых клеток.

В исследовании по поиску нижестоящих генов для Rx1, базируясь на избыточной экспрессии Rx1 в нейрализованных анимальных шапочках, были идентифицированы Xhmgb3 и Myc в качестве регулируемых генов (Terada et al. 2006). В данной работе мы использовали скрининг микрочипов для идентификации генов, связано регулируемых в Rx1 GOF и LOF экспериментах, осуществленных на целых эмбрионах на ст. ранней нейрулы. Выбор целых эмбрионов вместо анимальных шапочек позволил получить более всестороннее наблюдение генов, регулируемых с помощью Rx1. В частности, в качестве нижестоящих генов необходимо, чтобы они все экспрессировались в эктодерме, как в случае с Xenf (Table 1) и др. эндомезодермальными генами, репрессируемыми с помощью Rx1 (Giannaccini et al., 2013), их нелегко идентифицировать в экспериментах с анимальными шапочками.

В нашем скрининге Rx1 мы обнаружили большое количество активируемых, по сравнению с подавляемыми генами. Это, скорее всего, отражает тот факт, что Rx1 ,по-видимому, в основном действует как активатор транскрипции (Andreazzoli et al., 1999; Chuang and Raymond, 2001), который может также подавлять специфические гены посредством активации репрессоров транскрипции, таких как TLE2 и Hes4 (this work; Giannaccini et al. 2013, Andreazzoli et al., 2003).

Rx1 as a Key Regulator of Gene Expression and Cell Proliferation in Retinal Progenitors

Данное исследование показало, что 39% отобранных генов, участвуют в регуляции или транскрипции или трансляции. В самом деле, Rx1 контролирует экспрессию JHDM1d и Atrx, двух ремодельеров хроматина, участвующих в резвитии ЦНС (Tsukada et al., 2010; Medina et al., 2009), нескольких гомеодоменовых и bHLH транскрипционных факторов, включая самого Rx1, субъединицу RNA polymerase II, а также как белки, участвующие в трансляции (включая рибосомный белок L9, митохондриальный рибосомный белок S5 и Eif4g) и связывающие РНК (Gtpbp1, scaf4, и Rbm24). Эти данные подтверждают ключевое иерархическое положение Rx1 в контроле экспрессии генов на множественных уровнях в предшественниках сетчатки.

Др. основной класс генов, регулируемых с помощью Rx1, идентифицирован нашим скринингом, он участвует в контроле пролиферации клеток. Мы и др. ранее показали, что Rx1 способствует пролиферации ретинальных предшественников (Andreazzoli et al., 2003; Casarosa et al., 2003; Zaghloul and Moody, 2007). Однако, некоторые из позитивно регулируемых с помощью Rx1 гены, по-видимому, способствуют клеточной пролиферации, тогда как др. репрессируют её. Напр., Rx1 активирует Nek2, ген, как известно, способствующий вступлению в митоз (Bahmanyar et al., 2008). С др. стороны, Rx1 подавление Tcp1, белка, способствующего переходу от G1 к S фазе (Stirling et al., 2007), как полагают, вызывает блок в G1, который типичен для стволовых клеток. В этом отношении, стоит отметить, что помимо экспрессии в активно пролиферирующих ретинальных предшественниках глазного поля, глазного пузырька и CMZ, Rx1 экспрессируется также в слабо пролиферирующих ретинальных стволовых клетках CMZ (Perron and Harris,2000; Casarosa et al., 2005). Находка, что Rx1 регулирует гены, обладающие противоположными эффектами на пролиферацию клеток, д. отражать разные функции Rx1 в этих двух классах клеток. Альтернативно, во время развития Rx1 может активировать белки, ингибирующие пролиферацию, чтобы ограничить эффекты Rx1-индуцируемых пролиферативных факторов, тем самым ограничивая их активность в определенный промежуток времени.

Downstream Effectors of Rx1-Mediated Cell Migration

Эктопическая экспрессия Rx1 способна изменять морфогенетические движения ранних эмбриональных клеток, заставляя вентральные клетки занимать глазное поле (Kenyon et al., 2001). Это указывает на то, что Rx1 выполняет раннюю роль, позволяя ретинальным предшественникам проникать в глазное поле, хотя молекулярные механизмы, не установлены полностью.

В данное работе мы идентифицировали три гена, позитивно регулируемых с помощью Rx1 и экспрессирующихся в глазном поле, как известно, контролирующих миграцию и адгезию клеток: EphrinB1, SH2D3C и Fat1. Меняющая направление (reverse) передача сигналов EphrinB1 необходима ретинальным предшественникам, чтобы двигаться в глазное поле (Moore et al., 2004). Наблюдение, что нокдаун EphrinB1 вызывает репрессию Rx1 (Moore et al., 2004), тогда как избыточная экспрессия Rx1 вызывает эктопическую экспрессию EphrinB1 (this work), привело к гипотезе существования позитивной петли обратной связи между этими двумя генами. SH2D3C, посредник (interactor) для EphrinB1 рецептора (EphB2), является сигнальным белком, который содержит SH2 домен и guanine nucleotide exchange factor-like домен, который связывает GTPases семейства Ras. Он также связывает белок Cas, который действует как каркас для регуляции интегриновых адгезивных комплексов, контролирующих пролиферацию и миграцию клеток (Lu et al., 1999; Sakakibara et al., 2002). Ранняя экспрессия SH2D3C, которую мы наблюдали в вентральной части поля глаза и глазного пузырька, где она перекрывается с EphrinB1 и Rx1, согласуется с его ролью в регуляции миграции ретинальных предшественников и/или эвагинации глазного пузырька, хотя участие в развитии сетчатки продемонстрировано лишь формально. Fat1 принадлежит семейству протокадгеринов и регулирует динамику актина и межклеточные контакты (Ciani et al., 2003). Fat1 нокаутные мыши обнаруживают потерю межклеточной адгезии, голопрозэнцефалию и анофталмию (Ciani et al., 2003). Описанная функция Fat1 вместе с его экспрессией в глазном поле Xenopus, подтверждает, что он может вносить вклад в регуляцию миграции ретинальных предшественников.

Недавно, Rx3 рыбок данио, как было установлено, ингибирует экспрессию Ig-доменового белка Nlcam во время инициальной фазы конвергенции при образовании глазного пузырька (Brown et al., 2010). Nlcam экспрессируется в предшественниках переднего мозга, где он управляет их быстрой, направленной в медиальную сторону, миграцией. У рыбок данио Rx3 мутантных chokh, Nlcam эктопически экспрессируется в ретинальных предшественниках, заставляя их адаптировать некоторые миграторные характеристики предшественников телэнцефалона. Однако, наблюдение, что Nlcam не участвует в миграции, направленной наружу, происходящей во время эвагинации глазного пузырька, процесса, нарушенного у chokh мутантов, показывает, что Rx3 контролирует также др. регуляторные факторы миграции. Сюда входят EphrinB1, SH2D3C и Fat1, все они экспрессируются во время образования зрительного пузырька. Более того, Rx3 необходим для поддержания экспрессии хемокинового рецептора cxcr4, который вносит вклад в сегрегацию клеток глаз и телэнцефалона у рыбок данио (Bielen et al., 2012). Экспрессия в глазном поле EphrinB1, SH2D3C и Fat1 подтверждает, что эти гены могут кооперироваться с cxcr4, это подтверждают наши данные микрочипов у эмбрионов после инъекции MoRx1 (probeset no. Xl.548.1.S1_at), по определению специфичных для сетчатки морфогенетических движений. В частности, поскольку Rx1 и Rx3 обладают одним и тем же связывающим ДНК доменом, то возможно, что EphrinB1 и SH2D3C, которые являются непосредственными мишенями для Rx1, могут также непосредственно регулироваться с помощью Rx3. Недавно было показано, что клетки глазного поля нуждаются в laminin1 и Pard6γd для приобретения апикально-базальной полярности и приобретения нейроэпителиальных характеристик (Ivanovitch et al., 2013). В соответствии с описанной потребностью в Rx3 для начала экспрессии Pard6γd у рыбок данио, наши данные микрочипов показали, что Pard6γ (probeset no. Xl.1701.1.A1_x_at) активируется в Rx1 GOF экспериментах, подтверждая тем самым гипотезу, что Rx1 может участвовать в контроле этих событий.

Итак, мы идентифицировали ранее не описанные гены, регулируемые с помощью Rx1, которые вносят вклад в приобретение определенных признаков ретинальных предшественников, таких как подвижность и пролиферация. Функциональный анализ этих генов поможет составить детальное описание механизмов, действующих ниже Rx1. и определить действие др. ретинальных транскрипционных факторов, конвергирующих на некоторых из этих генов мишеней и тем самым определить сеть генетических взаимодействий в ретинальных предшественниках.