Shiuan Wang, Hugo J. Bellen Development 2015 142: 2392-2396; doi: 10.1242/dev.123737
The retromer complex is a multimeric protein complex involved in recycling proteins from endosomes to the trans-Golgi network or plasma membrane. It thus regulates the abundance and subcellular distribution of its cargo within cells. Studies using model organisms show that the retromer complex is involved in specific developmental processes. Moreover, a number of recent studies implicate aberrant retromer function in photoreceptor degeneration, Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Here, and in the accompanying poster, we provide an overview of the molecular and cellular mechanisms of retromer-mediated protein trafficking, highlighting key examples of retromer function in vivo.
Ретромерный комплекс, консервативный белковый комплекс, первоначально идентифицированный у дрожжей, играет критическую роль в рециклинге белков, подвергшихся эндоцитозу, из эндосом в trans-Golgi network (TGN) или плазматическую мембрану. Недавние исследования показали, что ретромерный комплекс регулирует субклеточную локализацию и предупреждает деградацию с помощью лизосом, избранных количеств белков, включая сигнальные рецепторы, ионные каналы и низкомолекулярные транспортеры (Seaman and Williams, 2002; Steinberg et al., 2013; Temkin et al., 2011). Функция ретромеров поэтому используется в различных онтогенетических контекстах включая развитие крыльев дрозофил (Belenkaya et al., 2008; Franch-Marro et al., 2008; Port et al., 2008), полярность эпителиальных тканей (de Vreede et al., 2014; Pocha et al., 2011; Zhou et al., 2011) и образование гема (Chen et al., 2013). Кроме того, ретромерный комплекс важен для поддержания нейронов (Wang et al., 2014), нарушения функции ретромеров приводят у человека к нейродегенеративным заболеваниям, включая болезнь Алцгеймера (Muhammad et al., 2008; Small et al., 2005;Wen et al., 2011) и Паркинсона (Vilari?o-G?ell et al., 2011; Zimprich et al., 2011).
Постер
Components of the retromer complex
Ретромерный комплекс содержит две главные части: Vps26-Vps29-Vps35 тример [наз. cargo recognition complex (CRC)] и часть, содержащую определенные sorting nexin (Snx) белки (Burd and Cullen, 2014). Vps26, Vps29 и Vps35 образуют стабильную третичную структуру как у дрожжей (Seaman et al., 1998), так и в клетках млекопитающих (Haft et al., 2000), а потеря любого из компонентов может нарушать функцию ретромера (Arighi et al., 2004; Seaman, 2004). Следовательно, CRC считается стержнем ретромерного комплекса.
Sorting nexins идентифицированы у разных видов. На сегодня известны 33 sorting nexins у млекопитающих (10 у дрожжей), из них 10 ассоциированы с ретромерным комплексом (Gallon and Cullen, 2015). Vps5 и Vps17, которые являются гомологами дрожжевых Snx1/2 и Snx5/6, первоначально были обнаружены как существенные компоненты ретромеров, т.к. они тесно ассоциировали с CRC (Seaman et al., 1998). Однако, последующие исследования на клетках млекопитающих показали, что Snx3 также участвует в функции ретромера, обнаруживая более сильное связывание CRC, чем Snx5 (Harterink et al., 2011). Это указывает на то, что взаимодействие между CRC и sorting nexins варьирует у разных видов, чтобы регулировать разные биологические процессы. Недавно установлено, что Snx27 регулирует доставку ретромерных грузов из эндосом обратно на плазматическую мембрану скорее, чем в TGN клеток млекопитающих (Temkin et al., 2011).
The selective transport of retromer cargoes
У позвоночных ретромерный комплекс регулирует транспорт избранных грузов с помощью разных путей (Burd and Cullen, 2014). Во время этого процесса разные факторы участвуют сначала в рекрутировании компонентов CRC комплекса на эндосомы. Напр., в клетках HeLa, SNX3 и RAB7 взаимодействуют с CRC непосредственно и необходимы для привлечения ретромерного комплекса на мембраны эндосом (Harterink et al., 2011; Rojas et al., 2008; Seaman et al., 2009; Vardarajan et al., 2012). Локализация ретромерного комплекса на эндосомах может также негативно регулироваться, напр., с помощью TBC1D5, Tre2-Bub2-Cdc16 (TBC) семейства Rab GTPase-активирующего белка, который снижает активность Rab7 (Seaman et al., 2009).
Ассоциация CRC с Snx белками затем предопределяет выбор груза и маршрут его переноса, т.e. на TGN или плазматическую мембрану. Напр., после ассоциации с Snx3, ретромерный комплекс выбирает специфические грузы, такие как 7 раз пронизывающий мембрану белок Wntless (Wls), действующий как рецептор Wnt, и cation-independent mannose-6-phosphate receptor (CI-MPR), перемещая их по пути в TGN (Arighi et al., 2004; Harterink et al., 2011; Seaman, 2004). Во время этого процесса, clathrin, clathrin-взаимодействующие белки, такие как RME-8 и WASH (Wiskott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog) комплекс, которые способствуют формированию разветвленных актиновых сетей на эндосомах, участвуют в формировании, разделении или стабилизации эндосомных трубочек (Gomez and Billadeau, 2009; Freeman et al., 2014; Popoff et al., 2009; Shi et al., 2009). Затем, содержащие груз пузырьки ассоциируют с p150glued-dynein комплексом и транспортируются в TGN вдоль треков микротрубочек (Wassmer et al., 2009). Когда ретромер, покрытый пузырьками, достигает TGN, то молекулярные привязи, такие как Golgi-associated retrograde protein (GARP) комплексы могут быть ответственны за закрепление этих пузырьков (Perez-Victoria et al., 2008). Присутствие phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P), богатого в Golgi phosphoinositide, затем облегчает высвобождение грузов из транспортных пузырьков на TGN (Niu et al., 2013).
Ретромерный комплекс может также обеспечивать транспорт белков из эндосом непосредственно обратно на плазматическую мембрану. Критическим компонентом, участвующим в этом пути, является Snx27, который соединяется с определенными грузами, такими как β2-adrenergic receptor (β2AR) (Temkin et al., 2011). Snx27 может также непосредственно взаимодействовать с комплексом WASH, чтобы регулировать зависимую от Snx1- или Snx5 доставку белка (Temkin et al., 2011). Активность комплекса WASH может регулироваться с помощью E3 RING ubiquitin ligase TRIM27 и её энхансера melanoma antigen-L2 (MAGE-L2) (Hao et al., 2013). В конце концов ретромеры, покрытые пузырьками, доставляются на плазматическую мембрану зависимым от Rab4 способом (Temkin et al., 2011). Необходимо отметить, что Snx3 может также регулировать транспорт белка из эндосом на плазматическую мембрану. Недавнее сообщение подтвердило, что Snx3 и Vps35 участвуют в рециклинге transferrin receptor (TfR) из эндосом на плазматическую мембрану непосредственно (Chen et al., 2013). Поскольку Snx3 является критическим для рекрутирования CRC, то возможно, что Snx3 сортирует многочисленные грузы на эндосомах и способствует доставке разных наборов грузов в разные мета предназначения.
Functions of the retromer complex in development and neuronal maintenance
Хотя идентифицировано более 150 грузов для ретромеров in vitro (Burd and Cullen, 2014), современные исследования подтвердили, что ретромерные комплексы регулируют очень специфические грузы, а значит и онтогенетические процессы in vivo.
Retromer-mediated control of Wnt signaling during Drosophila wing development
Главный лиганд пути передачи сигналов Wnt у Drosophila является Wingless (Wg), который секретируется с сигналы испускающих клеток и соединяется с Frizzled (Fz) рецепторами клеток, воспринимающих сигналы (Port and Basler, 2010). Трансмембранный белок Wls необходим для секреции Wg; он соединяется с Wg в Golgi и экскортирует Wg на клеточную поверхность посредством транспортных пузырьков (B?nziger et al., 2006; Bartscherer et al., 2006). Соотв., потеря Wls в крыловых имагинальных дисках приводит к внутриклеточному накоплению Wg в клетках, испускающих сигналы, и это сопровождается потерей передачи сигналов Wg (B?nziger et al., 2006; Bartscherer et al., 2006). Связь между передачей сигналов Wg и ретромерными комплексами стала очевидной, когда потеря функции ретромеров, как было установлено, приводит к дефектам передачи сигналов Wg (Coudreuse et al., 2006). Как и в случае потери wls, потеря Vps26 или Vps35 приводит к нарушению секреции Wg клетками, испускающими сигналы и снижает концентрацию Wls, демонстрируя, что ретромерный комплекс участвует в рециклинге Wls (Belenkaya et al., 2008; Franch-Marro et al., 2008; Port et al., 2008; Yang et al., 2008).
Несмотря на эту роль ретромерного комплекса в передаче сигналов Wg во время развития крыла, очень немногие др., зависимые от передачи сигналов Wg, онтогенетические события нуждаются в функции ретромеров. Напр., в отличие от потери wls и wg, потеря Vps26 или Vps35 не вызывает образования глаз крупных размеров (Bartscherer et al., 2006; Wang et al., 2014), указывая тем самым, что передача сигналов Wg во время развития глаз не зависит от Vps35 или Vps26. Кроме того, ретромерный комплекс, по-видимому, необязателен для трансдукции или тонко настройки др. сигнальных путей, которые, как известно, регулируются с помощью переноса пузырьков. В самом деле не обнаруживается фенотипических отклонений, связанных с дефектами путей передачи сигналов Hedgehog, Notch или BMP во время развития крыльев после нокдауна компонентов ретромеров (Belenkaya et al., 2008; Franch-Marro et al., 2008; Port et al., 2008; Wang et al., 2014), указывая тем самым, что зависимый от ретромеров транспорт в целом не играет критической регуляторной роли во всех путях передачи онтогенетических сигналов.
Итак, современные данные по Drosophila строго подтверждают только потребность в ретромерных комплексах при передаче сигналов Wg/Wnt во время развития крыльев; сигнальные события в др. тканях, по-видимому, осуществляются нормально в отсутствие функции ретромеров in vivo .
The retromer complex and apical polarity
Трансмембранный белок Crumbs важен для предопределения клеточной полярности. Он обеспечивает апикальные характеристики эпителиальных клеток и очерчивает границы между апикальным доменом плазматической мембраны и слипчивыми соединениями (Tepass, 2012). Потеря crumbs приводит к тяжелым дефектам эмбриогенеза и оогенеза у Drosophila (Tepass, 2012). Недавние исследования связали ретромерный комплекс с правильностью функции Crumbs. Потеря Vps35 нарушает образование слоев эпителиальных клеток фолликулярного эпителия во время оогенеза и эмбриогенеза (Pocha et al., 2011; Zhou et al., 2011). В последнем случае, это сопровождается потерей апикальных маркеров, таких как Crumbs и Patj. Однако, избыточная экспрессия Crumbs устраняет дефекты кутикулы и полярности у Vps35 мутантных эмбрионов (Zhou et al., 2011), подтверждая, что ретромерный комплекс необходим для рециклинга Crumbs и предупреждает его деградацию лизосомами. Недавно было показано, что нокдаун Scribble, и ассоциированных с ним белков, которые регулируют базо-латеральные качественные особенности эпителиальных клеток, нарушает зависимую от ретромеров сортировку Crumbs в крыловых имагинальных дисках (de Vreede et al., 2014). Следовательно, ретромерный комплекс может координировать различные сигналы полярности и сортировать соотв. грузы, для установления корректных доменов плазматической мембраны.
Retromer-dependent control of heme formation
Железо является важным ко-фактором для многочисленных клеточных и физиологических процессов, включая транспорт кислорода гемом в эритроциты. Гомеостаз железа является критическим для продукции гема в эритроцитах, а нарушения гомеостаза приводят к болезным, таким как анемия (De Domenico et al., 2008). Уровни железа в плазме регулируются с помощью плазматических transferrins (Tfs), которые соединяются с железом и затем с рецепторами TfRs клеточной поверхности (De Domenico et al., 2008). Комплексы iron-Tf-TfR затем подвергаются эндоцитозу посредством покрытых клатрином ямок и железо высвобождается из комплекса в кислую среду эндосом (De Domenico et al., 2008).
Недавнее исследование выявило участие Snx3-содержащего ретромерного комплекса в этом процессе. Во время эритроидного созревания у позвоночных, Snx3 экспрессируется на высоком уровне, а снижение его экспрессии сильно уменьшает общее содержание гемоглобина в печени плодов мышей, подтверждая, что концентрация Snx3 важна для продукции гема (Chen et al., 2013). Более того, TfRs физически соединяются с Snx3 и Vps35, а потеря Snx3 вызывает уменьшение TfRs (Chen et al., 2013), подтверждая, что содержащий Snx3 ретромерный комплекс необходим для рециклинга TfRs.
The retromer complex and the maintenance of photoreceptors
Родопсин является сенсором света в фоторецепторах, а исследования на Drosophila показали, что продолжительная экспозиция света вызывает интернализацию родопсина в фоторецепторных клетках посредством эндоцитоза (Wang and Montell, 2007). Большая часть подвергшегося эндоцитозу родопсина деградируется лизосомами. Однако, недавние исследования показали, что существенная порция интернализованного родопсина может быть восстановлена посредством ретромерных комплексов (Wang et al., 2014). В отсутствие Vps26 или Vps35, родопсин аномально накапливается в эндосомах и переполняет систему эндолизосом и это приводит также к образованию токсического комплекса с Arrestin 2 (Alloway et al., 2000), приводя к тяжелой дегенерации фоторецепторов, наблюдаемой у ретромерных мутантов после воздействия светом (Wang et al., 2014).
Интересно, что усиление функции ретромерного комплекса может устранять патологию, вызываемую нарушением гомеостаза родопсина в эндолизосомной системе в определенных контекстах. Напр., дисфункция адапторного белка AP-µ3, который регулирует доставку белков в эндолизосомные компартменты (Dell'Angelica, 2009), или phospholipase C (PLC), которая регулирует активность подвергшегося эндоцитозу родопсина (Wang and Montell, 2007), приводит к персистенции родопсина в эндосомах, это в свою очередь вызывает дегенерацию фоторецепоров (Chinchore et al., 2009). Избыточная экспрессия Vps26 или Vps35, однако, смягчает дегенерацию фоторецепторов у AP-µ3 или PLC мутантов (Wang et al., 2014). Следовательно, ретромерный комплекс способен активно поддерживать функцию и целостность фоторецепторов.
The retromer complex and human disease
Как указывалось выше, ретромерные комплексы играют роль в ряде физиологических процессов, а нарушения функции ретромеров могут приводить к патологиям, такими как дегенерация фоторецепторов. Как же дисфункция ретромеров приводит к болезням.
Alzheimer's disease
Показано участие дисфункции ретромеров в болезни Алцгеймера (AD), которая характеризуется избыточной продукцией амилоидного β (Aβ) пептида (Alzheimer et al., 1995). В нейронах, Aβ пептиды продуцируются путем последовательного протеолитического расщепления amyloid precursor proteins (APPs) с помощью β-secretase и γ-secretase (Small and Gandy, 2006). Эти протеазы располагаются в эндосомах; следовательно, аппарат доставки пузырьков может регулировать продукцию Aβ (Small and Gandy, 2006).
В соотв. с возможной ролью ретромерного комплекса при AD, уровни VPS35 и VPS26, как было установлено, снижены в головном мозге пациентов с AD (Small et al., 2005). Последующие исследования показали, что частичная потеря Vps26 или Vps35 приводит усилению расщепления APP с помощью β-secretase в головном мозге мышей (Muhammad et al., 2008; Wen et al., 2011), благодаря аберрантному рециклингу SorLA (Sorl1), белка, важного для переноса из эндосом в Гольджи APP (Small and Gandy, 2006). Такие мыши, дефицитные по ретромеру, также обнаруживают потери нейронов, дефекты синаптической передачи и пластичности, и в конце концов обнаруживают нарушения познавательной способности и памяти (Muhammad et al., 2008; Wen et al., 2011).
Parkinson's disease
Аномальная функция ретромеров также участвует в болезни Паркинсона (PD), при которой прежде всего возникают нарушения в движениях, которые возникают в результате потери dopamine-продуцирующих нейронов в субстанции nigra головного мозга. Напр., идентифицирована вызывающая замену aspartate-to-asparagine (D620N) мутация в VPS35, вызывающая доминантную с поздним началом PD у людей (Vilari?o-G?ell et al., 2011; Zimprich et al., 2011). Последующие исследования были сконцентрированы на связи между ретромерным комплексом и PD у разных модельных организмов. Снижение уровней Vps35 в Drosophila dopaminergic нейронах, как было установлено, приводит к дефектам движений и снижению продолжительности жизни (Linhart et al., 2014; Macleod et al., 2013). Кроме того, эктопическая экспрессия Vps35D620N в субстанции nigra головного мозга крыс оказалась причиной потери dopaminergic нейронов (Tsika et al., 2014). Дальнейшие исследования показали, что D620N мутация нарушает взаимодействие между ретромерным комплексом и WASH комплексом, это, в свою очередь, нарушает обычный трафик аутофагического белка ATG9A и функцию аутофагии (McGough et al., 2014; Zavodszky et al., 2014). Эти данные подчеркивают непосредственную роль рертромерного комплекса в патогенезе PD и подтверждают, что D620N альтерации в VPS35 действуют как доминантно-негативные мутации при избыточной экспрессии.
Ретромерный комплекс взаимодействует с др. PD генами. Используя первичные нейроны крыс, недавно было показано, что glycine-to-serine (G2019S)-причинная мутация в LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2), гене, который участвует в доминантной с поздним началом PD, приводит к дефектам сортировки в эндолизосомной системе (Macleod et al., 2013). Интересно, что избыточная экспрессия Vps35 устраняет потерю допаминергических нейронов, наблюдаемую в головном мозге мух, экспрессирующих человеческий LRRK2G2019S мутантный белок (Macleod et al., 2013) и супрессирует дефекты локомоции (Linhart et al., 2014), подтверждая, что повышенная активность ретромеров может предупреждать нейро-дегенерацию, вызываемую мутациями LRRK2.
Повышенные уровни α-synuclein являются характерным признаком PD в большинстве спорадических с поздним началом случаев (Bendor et al., 2013), и недавно была установлена связь между α-synuclein и ретромерным комплексом (Miura et al., 2014; Zavodszky et al., 2014). Используя HeLa клетки, было установлено, что клетки, экспрессирующие Vps35D620N мутантный белок обнаруживают дефекты аутофагии и повышенные уровни аутофагии (Zavodszky et al., 2014). Соответственно в независимом исследовании было показано, что уменьшение концентрации Vps35 влияет на рециклинг CI-MPR и нарушает активность лизосомного энзима cathepsin D, это, в свою очередь, вызывает аберрантное накопление α-synuclein в эндолизосомных компартментах и усиливает вызываемые α-synuclein дефекты движений у мух (Miura et al., 2014). Эти данные показывают, что ретромерный комплекс необходим для поддержания эндолизосомной функции и предупреждения накопления α-synuclein.
Итак, ретромерный комплекс необходим для ключевых процессов, участвующих в деградации белков и он взаимодействует с PD генами, которые участвуют в эндолизосомной доставке или агрегации белков. Следовательно, ретромерный комплекс, по-видимому, играет центральную роль в регуляции количества белка и в предупреждении накопления токсических или нежелательных белков, вызывающих гибель нейронов.
Conclusions and perspectives
Work in recent years has revealed important functions for the retromer complex. Studies in yeast and cultured cells have uncovered dynamic interactions between core retromer components and various accessory proteins that allow the retromer complex to select different sets of cargoes. These cargoes are then delivered to their correct target compartments. Given its pivotal role in vesicular trafficking, the retromer complex has also been studied in various in vivo processes. Interestingly, many of the defects induced by deficient retromer function appear to be restricted to specific tissues during development, despite more than 100 retromer cargoes being identified in vitro. Hence, the dynamics of retromer-mediated protein trafficking in vivo might be much more specific than was anticipated. Systematic profiling of the interactions among retromer components, associated proteins and cargoes in various tissues using model organisms will be crucial to precisely elucidate retromer function in different developmental contexts.
Although the retromer complex regulates very specific signaling pathways in defined developmental processes, such as fly wing development, it seems to play a pervasive role in neurodegeneration. One possibility is that the retromer complex plays a major buffering role and helps maintain homeostasis. A reduction in this buffering capacity would thus partially perturb the homeostasis of numerous proteins. Although retromer mutant neurons may be able to cope with impaired protein homeostasis for a short time, they might not be able to tolerate the stress (e.g. of having to continuously synthesize more cargoes and bear the increased load of proteins in the endolysosomal system) over a long period, and this might account for the premature aging observed in retromer mutant neurons. Further studies that systematically compare the abundance and distribution of proteins in neurons isolated from control and retromer mutant animals at different ages would be crucial to address this issue and to further understand the role of the retromer complex in vivo.
)