Paolo Bianco, Pamela G. Robey Development 2015 142: 1023-1027; doi: 10.1242/dev.102210
Skeletal stem cells (SSCs) reside in the postnatal bone marrow and give rise to cartilage, bone, hematopoiesis-supportive stroma and marrow adipocytes in defined in vivo assays. These lineages emerge in a specific sequence during embryonic development and post natal growth, and together comprise a continuous anatomical system, the bone-bone marrow organ. SSCs conjoin skeletal and hematopoietic physiology, and are a tool for understanding and ameliorating skeletal and hematopoietic disorders. Here and in the accompanying poster, we concisely discuss the biology of SSCs in the context of the development and postnatal physiology of skeletal lineages, to which their use in medicine must remain anchored.
Строма костного мозга (BM) включает самообновляющиеся, мультипотентные предшественники для скелетных клонов (хряща, кости, адипоцитов костного мозга, фибробластов). Эти предшественники (skeletal stem cells, SSCs) надежно охраняют резервуар кость-образующих клеток для роста кости во время развития, для моделирования кости (скульптурирования формы кости) и для ремоделирования кости (оборота кости в течение всей жизни); они генерируют адипоциты во время роста и во время ремоделирования BM; и при определенных обстоятельствах, они образуют хрящ. BM stromal cells (BMSCs), включая SSCs, также формируют и регулируют локальную микрососудистую сеть, регулируют дифференцировку остеокластов (кость-резорбирующих клеток), у создают и поддерживают гематопоэтические микроусловия (HME), необходимые для роста и созревания кровяных клеток. Кроме того, они могут быть важны для долговременного хранения само-обновляющихся hematopoietic stem cells (HSCs) (функция ниши) [rev. Bianco et al. (2013, 2008)]. SSCs, которые действуют как скелетные предшественники и как организаторы и регуляторы локальных микроусловий BM, физически существуют как периваскулярные клетки (adventitial reticular cells, ARCs), располагающиеся на наружной стороне эндотелиальной выстилки синусоидов BM, при этом обнаруживают отличающиеся фенотипы и ретикулярную морфологию (Sacchetti et al., 2007; Bianco et al., 2013). Современные доказательства приписывают этому специфическому набору клеток функцию стволовых клеток и организаторов, пока они не покинут это пространство для дальнейшего совершенствования потенциала субпопуляций в нем.
Here and in the accompanying poster, we summarize the emergence of skeletal lineages throughout embryonic development and postnatal growth and adaptation, as a frame necessary and suitable for understanding the biology of postnatal SSCs. We also briefly consider how the inherent properties of SSCs, sculpted through development, can guide their proper use in medicine, both for understanding and for treating diseases.
Origin of the concept of SSCs
Концепция SSC возникла благодаря плодотворным исследованиям посредством гетеротопических трансплантатов интактных постнатальных BM образцов (лишенных кости) или общей клеточной суспензии BM, при этом обнаруживалось образование эктопических 'косточек', состоящих из многих скелетных тканей и воспроизводящих архитектуру органа кости - костного мозга (Friedenstein et al., 1966; Tavassoli and Crosby, 1968). Последующие работы приписывали это функции специфической клеточной популяции. Образование косточек впервые было объяснено слипчивыми (не-гематопоэтическими) BMSCs; затем клоногенным субнабором из них, способным к независимому от плотности росту (предшественники ), и точнее, мультипотентными клоногенными предшественниками, дающими хрящ, кость и адипоциты in vivo (Owen and Friedenstein, 1988). Наконец, они были распознаны как само-обновляющиеся, анатомически и фенотипически характеризующиеся клоногенные, мультипотентные предшественники (т.e. bona fide SSCs) (M?ndez-Ferrer et al., 2010; Sacchetti et al., 2007; Zhou et al., 2014).
Skeletal, not 'mesenchymal', stem cells
Выяснение взаимоотношение между SSCs и 'мезенхимными стволовыми клетками' не является вопросом семантики. Важно выяснить связь между терминами, концепциями и биологическими объектами, связь часто расплывчатую в последние годы академического и прикладного использования терминологии. Термин 'мезенхимные стволовые клетки' (MSCs), сегодня используется для обозначения культур фибробластных клеток от практически любой ткани и органа (da Silva Meirelles et al., 2006), фактически впервые было предложено для обозначения культур BMSCs (Caplan, 1991; Pittenger et al., 1999). Концепция 'MSCs' как не-HSCs в BM была заимствована от ранее сформулированной гипотезы SSC, но была распространена на не-скелетные ткани. Кстати, доказательства, полученные с помощью строгих методов, показывают, что BMSCs включают стволовые клетки для скелетных тканей и только для скелетной ткани. Более того, такие стволовые клетки могут быть найдены в BM, и только в BM. Все не-скелетные ткани и органы, в которых 'MSCs' как говорят, существуют (напр. мышцы, плацента, жировая ткань) являются онтогенетически отличными от скелетных клонов, и не вносят вклад в развитие скелета или постнатальную физиологию, не обладают скелетогенными свойствами, определяемыми in vivo и не генерируются с помощью скелетных предшественников, обнаруживаемых в BM. Клетки, которые могут быть индуцированы к остеогенезу с помощью передачи сигналов BMP [включая независимую от лиганда передачу сигналов от постоянно активных рецепторов, как в скелетных мышцах при состоянии fibrodysplasia ossificans progressiva (Medici et al., 2010; Shore et al., 2006)] существуют в др. производных мезодермы. Однако, эти 'индуцибельные' предшественники могут быть рассмотрены отдельно от 'предетерминированных' предшественников, обнаруживаемых в строме BM, которые изначально (natively) экспрессируют главный остеогенный ген, runt-related transcription factor 2 (Runx2), и не нуждаются в репрограммировании с помощью экзогенных BMPs чтобы сгенерировать кость. Кроме того, отсутствуют доказательства, что стволовые клетки с характеристиками эмбриональной мезенхимы или с мультипотентностью существуют помимо скелетных клонов в постнатальном BM или в постнатальном организме. Мы полагаем, что термин 'MSC' неправильный и д. быть оставлен.
Skeletal lineages
Способность генерировать хрящ, кость, строму и адипоциты костного мозга характеризует SSCs. Это всё скелетные клоны: они являются анатомической частью скелета. Эти клоны связаны др. с др. в специфических онтогенетических процессах и связаны с обнаружимыми постнатальными предшественниками - SSC. Хрящ, кость, строма и адипоциты костного мозга, подобно индивидуальным костям, развиваются в разное время (при этом хрящ формируется первым, а адипоциты последними) и из многих эмбриональных клонов. Лицевые кости происходят из нервного гребня (эктодермы), тогда как остальной скелет происходит из параксиальной или латеральной пластинки мезодермы (Olsen et al., 2000). Т.о., два разных зародышевых слоя и множественные спецификации мезодермы возникают во время развития, в том же самом диапазоне тканей, которые генерируются с помощью постнатальных SSCs. Независимо от онтогенетического происхождения, BM строма обнаруживается во всех костях за исключением слуховых косточек, исследования, кстати, не выявили существенных различий в свойствах BMSCs из разных костей. Во время органогенеза, хрящ, кость, строма и адипоциты костного мозга генерируются за счет последовательного выбора разных судеб, это указывает на бинарный выбор на разных стадиях развития - при этом ранние клоны, формируются исключительно во время эмбриогенеза, тогда как генез поздних клонов распространяется на плодный, постнатальный период и взрослую жизнь.
Cartilage and bone
Индивидуальные сегменты скелета формируются с помощью двух разных процессов, обозначаемых как мембранозная и эндохондральная оссификация. В последнем случае, который касается огромного большинства костей, хрящ замещается костью и BM в ней. В первом случае хрящевой зачаток не образуется или замещается костью за счет др. процесса. Самой ранней стадией эндохондральной оссификации во время эмбрионального развития является возникновение мезенхимных конденсатов. Затем хондрогенез генерирует хрящ, который образует зачаток эндохондральной кости (Hall, 2005; Kronenberg, 2003). В каждом конденсате центральные клетки превращаются в хрящевые и затем созревают далее в гипертрофический хрящ, позднее замещаемый костью и BM. Наиболее периферические мезенхимные клетки образуют оболочку, из которой развивается надхрящница (слой соединительной ткани) и суставные мягкие ткани (Hall, 2005). Примитивная надхрящница дает как хондроциты, так и остеогенные клетки и два клона пространственно перекрываются в специфических местах (углублениях Ranvier's) (Hall, 2005). Как только образуются центры оссификации и ростовые пластинки, появляются периферические ('пограничные') и гипертрофические хондроциты (HCs), чтобы внести вклад с субнабор костных клеток (Bianco et al., 1998a;Riminucci et al., 1998; Yang et al., 2014).
В большинстве мембранозных костей, хондрогенез абортивный, он проявляется лишь во временной экспрессии типа II коллагена (Nah et al., 2000). Однако, латентная хондрогенная фаза мембранозной оссификации может быть выявлена при специфических экспериментальных условиях (Jacenko and Tuan, 1986). Более того, настоящий зачаток хряща образуется при развитии определенных мембранозных костей (напр.. теменной кости), она замещается костью посредством уникального процесса: зачаток регрессирует за счет MT1-MMP-управляемой деградации матрикса и апоптоза находящихся хондроцитов, тогда как окончательная кость формируется вне (скорее всего, чем внутри, как при эндохондральной оссификации) регрессирующего хряща (Holmbeck et al., 1999, 2003).
Bone and BM stroma
Костная ткань образуется прежде возникновения полости BM: костные клетки, следовательно, появляются прежде костных предшественников BM. Пролиферирующие предшественники кость-формирующих клеток занимают наиболее наружные части надхрящницы/надкостницы, генерируя остеобласты, которые откладывают 'костную манжетку' во время ранней оссификации. Остеогенная надхрящница включает презумптивные костные предшественники BM стромы (Arai et al., 2002; Bianco et al., 1993), как подтверждают исследования по отслеживанию клонов (Maes et al., 2010). По мере того, как кость-резорбирующие остеокласты перфорируют костную манжетку, то подлежащие HCs, кровеносные сосуды из остеогенных надхрящницы/надкостницы проникают в формирующуюся полость для костного мозга. Относящиеся к надкостнице костные предшественники оказываются расположенными около сосудов, затем поступают в развивающийся BM (Arai et al., 2002;Bianco et al., 1993; Streeter, 1949). Примитивный, пре-гематопоэтический BM формируется крупного калибра, типа синусоидов, кровеносными сосудами в окружении остеогенных клеток, некоторые из которых располагаются на abluminal поверхности кровеносных сосудов (Bianco et al., 1993). Привнесенные кровью гематопоэтические предшественники затем засевают это окружение (Bianco et al., 1999). На всем протяжении пренатального и постнатального роста кости, строма BM обнаруживается в метафизах длинных костей, сохраняя активную пролиферацию; в том же самом месте ангиогенез запускает рост синусоидальной сети, приносимые кровью гематопоэтические предшественники могут продолжать пополнять локально растущий костный мозг (Wang et al., 2013). Рост стромы BM в этих местах регулируется с помощью parathyroid hormone (PTH) и PTH-related protein (PTHrP), известных участников развития кости и постнатальной физиологии. По мере удлинения кости, сайт-специфическое подавление PTH1 рецептора (PTH1R) может быть необходимо для ослабления локальной оссификации, тем самым создается пространство для устойчивого гематопоэза (Kuznetsov et al., 2004).
BM stroma and adipocytes
Адипоциты костного мозга образуются постнатально из экспрессирующих alkaline phosphatase (ALP) BMSCs, расположенных на наружном аспекте синусоидов (анатомически определяемые как ARCs) (Bianco et al., 1988). ARCs образуются во время плодного развития, когда детерминированные остеогенные клетки ассоциируют с кровеносными сосудами; они могут быть выделены как SSCs на постнатальных стадиях (Bianco, 2011). ARCs имеют одинаковое анатомическое расположение (непосредственно под эндотелиальным слоем) с клетками, наз. перицитами в др. тканях, хотя синусоиды BM не являются теми же самыми, что капилляры в др. тканях. ARCs также экспрессируют маркеры, экспрессируемые перицитами др. тканей (Bianco, 2014; Sacchetti et al., 2007). Специфические регионы скелета (апофизы длинных костей, коротких костей, лицевых костей человека; позвонков хвоста и коротких костей мышей) полностью заполнены адипоцитами на ранней стадии (yellow marrow); остальная часть скелета первоначально заполнена гематопоэтически активным (красным) костным мозгом с небольшим количеством или в отсутствие адипоцитов; количество адипоцитов в этих местах прогрессивно увеличивается во время роста скелета и старения, но и также модулируется в зависимости от гематопоэтических гомеостатических нужд (Bianco and Riminucci, 1998). Адипоциты костного мозга метаболически отличаются от extramedullary жира; они участвуют в регуляции кровотока внутри BM, и тем самым в гематопоэтической активности (Bianco, 2011). Они могут предоставлять негативные регуляторы для ниши HSC (Naveiras et al., 2009), поскольку SSCs/ARCs, по-видимому, являются позитивным регулятором. В постнатальном BM, реципрокные взаимоотношения (баланс) существуют между остеогенезом и адипогенезом (Abdallah and Kassem, 2012; Beresford et al., 1992), это важно для исследований остеопороза и старения костей (Justesen et al., 2001). Непосредственный вклад постнатальных скелетных предшественников в ремоделирование кости и BM нуждается в дальнейших интенсивных исследованиях (Kassem and Marie, 2011).
Regulation of lineage commitment
Онтогенетическое предопределение хондрогенеза, остеогенеза и адипогенеза регулируется тремя основными транскрипционными факторами: sex-determining region Y-box 9 (Sox9; хондрогенный) (Bi et al., 1999), Runx2 (остеогенный) (Komori et al., 1997) и peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2; адипогенный) (Muruganandan et al., 2009). Уровни этих факторов контролируются членами сверхсемейства transforming growth factor β/bone morphogenetic protein (TGFβ/BMP), Wnts (wingless type MMTV integration site) и hedgehogs, при активном их общении [rev. Cook and Genever (2013)]. В остеогенном предопределении, BMP действует посредством Msh homeobox/distal-less-related (Msx/Dlx) гомеобелков, чтобы усилить экспрессию Runx2, которая затем усиливает экспрессию osterix. BMPs также играют роль в хондрогенезе путем усиления активности Sox9. Кроме того, передача сигналов sonic hedgehog (SHH) увеличивает Nkx3.2, который снижает Runx2, делая возможной индукцию хряща. Передача сигналов Wnt предупреждает индукцию хряща, но контролирует ход гипертрофии хряща вместе с indian hedgehog (IHH) и PTHrP [rev. Cook and Genever (2013)]. Адипогенез стимулируется с помощью гормональной активации CCAAT enhancer-binding protein (C/EBP) β и δ, которые, в сою очередь, индуцируют PPARγ2. PPARγ2 усиливает активность C/EBPα, который поддерживает экспрессию PPARγ2 посредством позитивной петли обратной связи. Безусловно, передача сигналов Wnt способствует остеогенезу за счет стимуляции Runx2 и за счет ингибирования C/EBPα, ингибируя тем самым адипогенез [rev. Cook and Genever (2013)]. Кроме того, TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) помогает активировать Runx2-зависимую транскрипцию генов, репрессируя при этом PPARγ-зависимую транскрипцию генов (Hong et al., 2005).
Generating skeletal progenitors from pluripotent stem cells
Изучение плюрипотентных стволовых клеток (PSCs; включая эмбриональные стволовые клетки, ESCs; и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, iPSCs) предоставило способ выделения регуляторных цепочек (circuits) управляющих развитием кости и костного мозга человека, включая происхождение SSCs. Многие исследования имели целью дифференцировку ESCs или iPSCs в скелетную ткань [напр. Harkness et al. (2011); Mahmood et al. (2010)]; некоторые показали, что предполагаемые генерируемые из PSC скелетные предшественники могут давать гистологически подтвержденную кость in vivo, но неспособны воссоздать полость и строму BM и, следовательно, и SSCs (Harkness et al., 2011; Hong et al., 2014;Mahmood et al., 2010; Phillips et al., 2014). Эти находки созвучны с современной неспособностью генерировать подлинные HSCs, когда генерируют гематопоэтические клетки из PSCs (Kaufman, 2009). Также стоит отметить, что BM строма и SSCs состоящие там, появляются поздно во время органогенеза кости (see above), указывая, что современные протоколы для генерации SSCs из PSCs могут быть неспособны воспроизводить весь процесс скелетогенеза, особенно его более поздние события. В целом, специфическая характеристика свойств скелетогенных предшественников в определенные моменты времени и в пространстве является важной целью.
Isolation and assessment of skeletal stem/progenitor cells
Скелетогенные предшественники могут быть выделены на базе или поверхностных маркеров ('prospectively') или путем создания клональных слипчивых культур. Пока методы клоногенности остаются основными для характеристики клеток, изолированных по поверхностным маркерам и пока клеточные культуры остаются обязательными перед трансплантациями in vivo, выделение с помощью или поверхностных маркеров или с помощью слипчивости и колоногенности будут давать в основном идентичные результаты. Мультипотентность может быть оценена только на уровне единичных клеток; т.e. в клонах, происходящих из единичного colony-forming unit-fibroblast (CFU-F). Все анализы одиночных колоний подтверждают большое разнообразие среди клонов (способности к росту и дифференцировке) [e.g.Kuznetsov et al. (1997)], возможно отражая иерархию (Muraglia et al., 2000). Хотя очень популярная оценка иммунофенотипов in vitro и испытания мультипотентности в не клональных культурах не определяют культуру, как культуру SSCs или стволовых клеток (Bianco et al., 2013), и существенно снижают оценку роста, дифференцировки и самообновления стволовых клеток.
Cell proliferation and colony growth
Независимо от фенотипической гомогенности, все культуры не трансформированных клеток являются гетерогенными, поскольку кинетика их роста обязательно асимметрична: дальнейшие пролиферация, дифференцировка и старение потомства одиночной клетки не ведут себя униформно, синхронно или с одинаковой скоростью для всех клеток в растущей колонии. Более того, полностью симметричные кинетики роста популяции, происходящей из одиночной стволовой клетки, будут увеличивать количества стволовых клеток без генерации дифференцирующихся клеток; или, напротив, будут генерировать дифференцирующиеся клетки без увеличения количества стволовых клеток. Т.к. мы не имеем информации об относительной частоте симметричных или асимметричных клеточных делений в культурах, то действительное содержимое настоящих стволовых клеток или предшественников в культуре не может контролироваться в это время. Поэтому обращаясь к любой культуре BMSCs как к культуре 'стволовых клеток' или 'мезенхимных стволовых клеток' (as in a copious amount of literature) остается необоснованным и обманчивым.
Differentiation
Гетеротопические трансплантации non-doctored, не-индуцированных культур остаются основными для оценки способности к дифференцировке SSCs/BMSCs (Bianco et al., 2008). Суррогатные in vitro подходы чрезвычайно искусственны и склонны к артефактам. Это применимо в частности и к методам оценки остеогенной и адипогенной дифференцировки, даже если это комбинируется с ограниченным анализом экспрессии генов. Образование хряща в micromass или шариковых культурах наиболее реально, т.к. это покоится в конечном итоге на гистологической проверке настоящего хряща. Однако, подобно остеогенному и адипогенному подходам, расширенное толкование результатов шариковых культур наказывает за их использование (Robey et al., 2014). Хрящевые шарики, в свою очередь, могут быть трансплантированы, чтобы оценить возможность генерации косточек посредством уникальной онтогенетической последовательности (Serafini et al., 2014).
Self-renewal
Самообновление может быть оценено только обеспечением генерации in vivo клеточного компартмента, который анатомически, фенотипически и функционально эквивалентен одному лишь исходно культивируемому, вместе с разными компартментами. Для этого необходимо: (a) определение анатомии и фенотипа изолированной популяции; (b) доказательство, что та же самая популяция формируется in vivo; и (c) серийный пассаж и трансплантация (Sacchetti et al., 2007). Большие количества удвоений популяций (population doublings (PDs)) не подтверждают само-обновление постнатальных клеток, а просто подтверждают высокую пролиферативную способность.
SSCs in medicine
Существуют 4 пути, с помощью которых SSCs могут быть использованы для терапии, включая лечение пациентов: (1) так, предшественники, напр., костных клеток для преобразования костной ткани (Robey, 2011); (2) не как предшественники, напр., для создания условий сборки микрососудов и формирования сетей, в качестве ключевых компонентов HME/ниши или в качестве поддерживающих факторов и цитокинов в контексте стратегии преобразования ткани (Bianco, 2011; Bianco et al., 2013); (3) в качестве инструмента моделирования в базирующихся на стволовых клетках моделях болезни in vivo (Bianco et al., 1998b); и (4) в качестве концептуального инструмента, путем выявления специфических патологических изменений в тканях как результата динамики биологии стволовых клеток. Важно понять эту динамику для терапевтических целей, поскольку подверженные воздействию лекарств процессы могут оперировать на стволовых клетках и клетках предшественников скорее, чем на дифференцированных клетках (Bianco, 2014; Bianco and Riminucci, 1998). Любая из этих моделей SSC, влияющая на нужды медицины, и используемая специфическими способами, пока не изобретена. Преждевременные, эмпирические попытки клинического использования (напр. с помощью системных вливаний клеток, которые не пригодны для системных вливаний) не приведет к успеху и может даже предупредить его
(Bianco et al., 2013).
Concluding remarks
The skeleton provides a key example of a low-turnover system in which bona fide stem cells have been proven to exist and have been characterized in humans and mice (M?ndez-Ferrer et al., 2010; Sacchetti et al., 2007). This was carried out using experimental approaches germane to those that revealed the biology of other stem cells systems (i.e. hematopoietic), such as transplantation and single-cell analysis. Recent developments of classical approaches have been instrumental in identifying the SSCs, and remain crucial to the endeavor of probing their functions and regulation in humans. Very recently, advances towards identifying SSCs in the mouse have been reported (Chan et al., 2015; Worthley et al., 2015). These studies reveal novel facets of the ontogeny of the stromal system. Together with a more thorough appreciation of the specific developmental processes briefly discussed herein, these new data might contribute to a broader understanding of the stromal system in mammals.
SSCs have a unique role: they function at the same time as stem cells and as niche cells, as progenitors and as organizers of neighboring cells and tissues that they do not generate, such as nascent blood vessels and the HME. This singularity might rest on cellular properties and regulatory circuitries still to be elucidated. As central to the physiology and disease of two major systems such as the skeleton and blood, SSCs might provide conceptual and practical advances in medicine, provided their specificities are kept in mind.
