Figure 1
Multilineage priming reflects the competency of stem cells to adopt one of several fates and provides a substrate for commitment. Multiple lineage-affiliated genes (colors relate to different lineages: purple, A; blue, B; red, C) are coexpressed in variable patterns in multipotential cells preceding lineage commitment. Commitment is associated with downregulation of genes associated with alternative lineages. Lineage biases in multipotent cells are associated with differential lineage priming, suggesting that priming sets the stage for commitment and determines the repertoire of fates that the cell may adopt. In the cartoon, A/B-and B/C-biased multipotent cells are shown coexpressing genes associated with those respective lineages. Whether these multilineage priming states are reversible and dynamic or represent stable states has yet to be demonstrated.
Figure 2 Revising the road map for lineage commitment in the hematopoietic system. Lineage commitment pathways have been proposed based on the prospective isolation of lineage-restricted progenitor populations and assessment of their lineage potential through reconstitution of irradiated recipients and/or in vitro differentiation assays. (A) The classical model posits that stem cells and multipotent progenitors reside at the apex of the hierarchy with restriction to MegE, lymphoid, or myeloid fates occurring in downstream progenitors that have lost self-renewal capacity. Common myeloid progenitors (CMP) and common lymphoid progenitors (CLP), therefore, represented the first lineage restriction point in the lineage tree. (B) The classical roadmap was revised once it was discovered that the MPP compartment contains lymphomyeloid-restricted progenitors (LMPPs) that have lost MegE potential. Recently, HSCs with potent MegE potential but little or no lymphoid potential have been identified, suggesting that MegE commitment may occur in HSCs and represents the first branchpoint in the lineage tree (indicated by broken arrow). In both the classical model and the revised model self-renewal capacity and multipotentiality are tightly linked in apical HSCs residing at the top of the hierarchy. (C) Myeloid bypass model: multilineage clonal tracking of single HSCs has suggested a myeloid bypass model in which megakaryocyte- and myeloid-restricted progenitors are generated in the most primitive HSC compartment which are capable of long-term self-renewal and reconstitution of restricted myeloid lineages. This model is significantly different to the earlier models (A,B) because it suggests that self-renewal and multipotentiality can be uncoupled. Abbreviations: c-Kit, c-Kit proto-oncogene; Ery, erythroid; Flt, FMS-like tyrosine kinase 3; G/M, granulocyte/monocyte; GMP, granulocyte/monocyte progenitor; HSC, hematopoietic stem cell; KLS, Kit+, Lin-, Sca1+; Lin- cells, cells negative for lineage markers; Meg, megakaryocyte; MegE, megakaryocyte/erythroid; MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor; MPP, multipotent progenitor; MyRP, myeloid-restricted progenitor; Sca, stem cell antigen 1.
Understanding lineage commitment one cell at a time
Детерминация является точкой, в которой клетки становятся ограниченными необратимо (при физиологических условиях) к определенной судьбе и теряют потенциал дифференцировки в др. типы клеток. Это необходимо отличать от процессов более ранней спецификации, при которой потенциал стволовых клеток и клеток предшественников предопределяется до детерминации в один определенный клон. При мультипотентной спецификации клеток происходит становление компетентности дифференцироваться во множество разных клонов клеток. Эти процессы теоретически отличны и могут регулироваться с помощью разных, хотя и взаимосвязанных механизмов.
Много внимания было уделено роли транскрипционных факторов (TFs) в спецификации и детерминации клеток в определенные клоны. Было предположено, что прирожденный клональный выбор является стохастическим и зависит от активации клон-специфичных TFs на уровнях, превышающих порог, чем приобретение клеточной судьбы посредством перекрестно антагонистических взаимодействий с альтернативными клон-специфицирующими TFs [1]. Однако, понимание того, как мультипотентные клетки сначала специфицируются и в последствии делают выбор, какую судьбу выбрать, зависит от способности измерять экспрессию генов на уровне одиночной клетки. Усредненные генная экспрессия и клеточное поведение при анализе на популяционном уровне маскируют присутствие определенных паттернов экспрессии и функциональных потенциалов внутри одной клетки. Разработка microfluidic qPCR платформ для обследования матрицы из 96 генов в 96 индивидуальных клетках революционизировала анализ экспрессии генов в одиночных клетках [2]. Предыдущие методы multiplex single cell reverse transcription и PCR (RT-PCR) не являются количественными и требуют ручного обслуживания и крупных реакционных объемов [3]. Чувствительность и точность, предоставляемые microfluidic processing небольших реакционных объемов и qPCR анализом, делают возможной аккуратную количественную оценку совместной экспрессии множественных генов в индивидуальных клетках [4, 5]. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) особенно пригодны для анализа одиночных клеток, поскольку эти клетки могут быть легко изолированы с помощью fluorescence activated cell sorting (FACS) и обладают значительной клоногенной способностью in vitro и in vivo. Анализ экспрессии генов в одиночной клетке был первым в этой системе и завершился клональным отслеживанием поведения HSPC, чтобы можно было увязать молекулярные и клеточные фенотипы.
Box 1
Exploring commitment through single cell transcriptomics in non-hematopoietic tissues
Box 2
Single cell analysis provides new answers to longstanding questions
Single cell approaches define cellular hierarchies and transcriptional networks regulating commitment
Multilineage priming in hematopoietic stem and progenitor cells
HSCs являются мультипотентными клетками, которые постоянно восполняют все классы кровяных клеток посредством серии клон-ограничивающих ступеней, приводящих к более дифференцированным и ограниченных в развитии клеткам. Выбор клеточной судьбы у HSCs, как полагают, является результатом активации и перекрестного антагонизма клон-специфицирующих TFs [1]. Ранние исследования, использующие в одиночных клетках multiplex RT-PCR, показали, что клон-ограничивающие гены экспрессируются на низких уровнях в мультипотентых стволовых клетках и клетках предшественниках и, как полагают, они 'primed' (инициированы) для экспрессии позднее во время дифференцировки [3,6]. Более того, значительные количества мультипотентных гематопоэтических клеток совместно экспрессируют гены, ассоциированные с множественными отличающимися клонами (30-60% клеток в данном исследовании), подтверждая, что конфликтующие клональные программы одновременно запускаются для подготовки к последующему клональному выбору, феномен, наз. multilineage priming (инициирование для многих клонов) [3] (схематизировано на Figure 1). Последующий анализ одиночных очищенных стволовых клеток и клеток предшественников, включая HSCs и клонально ограниченные предшественники - common myeloid progenitors (CMPs) и common lymphoid progenitors (CLPs) [56, 57] (Figure 2A) - показал, что эти клетки часто экспрессируют связанные с клонами гены в соответствии с их потенциалом дифференцировки [7]. CMPs обнаруживают особенно высокий уровень multilineage priming, при этом почти 50% одиночных CMPs совместно экспрессируют множественные связанные с миэлоидным и эритроидным клонами гены, тогда как 21% CLPs беспорядочно экспрессируют T и B клеточные гены. Анализ на популяционном уровне также выявил экспрессию клон-специфических генов в HSPCs [8] , но поскольку это может отражать присутствие смеси по-разному детерминированных клеток, присутствующих в гетерогенной популяции, использование анализа экспрессии генов в одиночных клетках является критическим для демонстрации, что они представляют собой одновременный multilineage priming в индивидуальных клетках [3, 7]. Считается, что multilineage priming отражает присутствие открытого хроматина в primed локусах, которые и составляют платформу для детерминации, и делает возможной гибкость мультипотентных клеток, чтобы генерировать множественные клоны.
Revising the roadmap of hematopoietic commitment: single cell analysis of multipotent progenitors (MPPs) reveals early separation of megakaryocyte/erythroid (MegE) and lymphoid fates
Ранние исследования клональной детерминации HSC подтвердили модель, согласно которой HSCs дают MPP (также известные как краткосрочные HSC), которые могут давать два клон-ограниченных предшественников, CMPs и CLPs, каждый из которых может продуцировать более ограниченные типы кровяных клеток (Figure 2A). В этой классической модели гематопоэтической детерминации, клональное ограничение впервые происходит в нижестоящем компартменте само-обновляющихся стволовых клеток и это приводит к бифуркации миэлоэритроидных и лимфоидных судеб. Однако, исследования экспрессии генов комбинированных одиночных клеток с помощью клонального функционального подхода показали значительную гетерогенность как в HSC , так и в MPP популяциях, включая дискретные подтипы с отличающейся клональной склонностью и с ранним отделением MegE и лимфоидных судеб у MPPs, и возможно также у HSCs (Figure 2B: the revised model). MPP компартмент является т.о., мультипотентным благодаря присутствию популяции из смеси по-разному детерминированных предшественников, тем самым подчеркивается необходимость тщательного анализа клеточной функции на уровне одиночной клетки.
Гематопоэтическая дорожная карта была пересмотрена после идентификации лимфомиэлоидно-ограниченных предшественников в Flt3+ (FMS-like tyrosine kinase 3) порции компартмента MPP, наз. lymphoid primed multipotent progenitors (LMPPs) [9, 10]. Хотя HSCs генерируют все гематопоэтические клоны, они специфически экспрессируют миэлоид- и MegE-ассоциированные гены, но не лимфоидные гены [7, 8]. Анализ генной экспрессии в одиночной клетке из LMPPs показал, что они (Figure 2B) являются наиболее примитивными клетками, экспрессирующими общие лимфоидные гены и это сопровождается потерей MegE priming, но сохраняется myeloid priming [11]. В отличие от Flt3-MPPs, менее 1% одиночных Flt3+ LMPPs экспрессируют протестированные гены клона MegE, и функционально LMPPs обладают незначительной или не обладают способностью продуцировать MegE клоны (не превышая sort purity в 1-3%) [9]. Напротив, 70% из одиночных клоногенных LMPPs имеют комбинированную способность к лимфомиэлоидной дифференцировке, если растут в условиях, поддерживающих мульти-клональность [9]. На таком молекулярном уровне ~30% одиночных LMPPs экспрессируют один или более ранних протестированных лимфоидных генов [interleukin 7 receptor, (Il7r), sterile immunoglobulin heavy chain complex (IgH) или recombination activating gene 1 (Rag1)], и все эти совместно экспрессирующиеся гены, связанные с GM клоном, подтверждают что лимфомиэлоидный priming функционально связан с компетентностью этих предшественников [11]. Важно, что ни одной одиночной клетки не было найдено в каком-либо HSPC компартменте (HSC, MPP или LMPP), которые бы экспрессировали MegE и лимфоидные гены, подтверждая четкое разделение этих судеб. Иерархическая организация клонального priming (инициирования) в HSPCs, при этом миэлоидное и MegE priming (инициирование) предшествует лимфоидному priming (запуску), отражается в пересмотренной модели гематопоэтической детерминации [9, 11] (Figure 2B). Это может не иметь совпадения с той иерархией клонального ограничения в гематопоэзе параллельно с более ранними эволюционными и онтогенетическими источниками миэлоидных клеток по сравнению с лимфоидными клетками [12, 13]. Открытие, что организация клонального priming в HSPCs отражает немедленную компетентность разных субнаборов стволовых клеток и клеток предшественников, подтверждает идею, что мультиклональный priming непосредственно облегчает детерминацию клеточных судеб в мультипотентных клетоках.
Single cell analysis identifies platelet-primed HSCs at the apex of the hematopoietic hierarchy
Priming (инициирование) генов, связанных с клонами, было первоначально подтверждено на менее распространенных HSCs у взрослых, чем в мультипотентных и предетерминированных предшественниках или плодных HSCs [11], оставляя открытой возможность, что долговременные HSCs взрослых могут существовать преимущественно в unprimed нативном основном состоянии (отсутствие клонального priming в высоко плюрипотентных ESCs), как это подтверждено для ESCs [14]. Однако, ограниченные количества генов, связанных с клонами, были исследованы в более ранних работах, а анализ более широкого выбора клон-специфичных генов с использованием более чувствительного метода qPCR на Fluidigm Biomark microfluidic платформе показал значительные уровни priming во всех проанализированных HSCs [15, 16]. Поразительно, внутри хорошо очищенных HSCs, выделенных по экспрессии маркера SLAM (signaling lymphocyte activation molecule; известен также как CD150) {из которых ~20% были функционально долгосрочными HSCs (LT-HSCs) как это определялось по трансплантации одиночных клеток [17]}, ~60% одиночных клеток обладали megakaryocyte priming помимо одновременной экспрессии миэлоидных и эритроидных генов [15, 18]. Репортер GFP, внедренный в ген von Willebrand factor (vWF), был использован для выделения этой самостоятельной популяции LT-HSCs, которая обладает megakaryocytic priming (инициированной программой для мегакариоцитов). Трансплантация ограниченных количеств vWF+ HSCs выявила четкую склонность к тромбоцитам/миэлоцитам (в 50% более высокую, чем приживление B клеток), а трансплантации одиночных клеток показали, что эти HSCs дают преимущественно тромбоциты и некоторые миэлоидные клетки, но почти нет лимфоидных клетках. Заметно, очень немного vWF- HSCs с primed megakaryocyte-ассоцированными генами, и все из этих трансплантатов с vWF- клетками обладали склонностью к лимфоидному восстановлению (вклад в B клетки более 50% , чем в тромбоциты/миэлоциты), подтверждая, что priming на молекулярном уровне коррелирует со склонностью клеток к дифференцировке. Оба субнабора были способны к долговременному восстановлению из облученных реципиентов, но только vWF+ клетки давали vWF- клетки, но не vice versa, указывая, что эти platelet-primed (инициированные в направлении тромбоцитов) HSCs находятся на верху HSC иерархии. Следовательно, priming широко распространено внутри HSC компартмента, а дифференциальный priming ассоциирует со стабильной склонностью стволовых клеток. Иерархическая организация platelet-primed HSCs согласуется с пересмотренным клональным древом гематопоэза, в котором судьба в направлении MegE отделяется первой и указывает, что детерминация мегакариотического клона начинается в наиболее примитивном компартменте стволовых клеток (Figure 2B) [9, 15].
Mapping cellular hierarchies with single cell expression analysis supports the revised roadmap of hematopoiesis
Исследование коварианс генов в одиночных клетках может быть мощным методом картирования клеточных иерархий и выявления новых регуляторных взаимодействий, контролирующих детерминацию клонов, чтобы строить крупномасштабные сети регуляторных генов. Одним из ограничений использования qPCR анализа в одиночных клетках является уровень multiplexing, который может быть достигнут. Более того, наборы выбираемых генов могут потенциально влиять на интерпретацию этих экспериментов. Однако, путем оптимизации структуры multiplex праймера, снижения концентрации праймера во время преамплификации и использования гнездных qPCR праймеров, производительность в одиночных клетках qPCR повышается, делая возможным профилирование панели из 280 генов на 96 одиночных клетках с тремя 96.96 Fluidigm Dynamic Arrays [18].
Используя этот подход, идентифицированы новые клеточные промежуточные образования и регуляторные взаимодействия между генами, контролирующими детерминацию. Первоначальные эксперименты были сконцентрированы на маркерах клеточной поверхности для проспективной изоляции подтипов внутри определенных компартментов HSPC. Computational lineage-progression анализ посредством SPADE (spanning-tree progression analysis of density-normalized events) [19] воспроизвел известную гематопоэтическую иерархию с четким разделением между MegE и лимфомиэлоидными судьбами, подтвердив пересмотренную модель гематопоэза (Figure 2B) [9]. Более того, этот анализ выявил четкую гетерогенность в экспрессии генов во всех проанализированных типах гематопоэтических предшественников. Биологические и технические шумы обладают унимодальным log-нормальны распределением и поэтому присутствие бимодальности в экспрессии может быть использовано, чтобы вывести биологически многозначимые вариансы по данным экспрессии в одиночной клетке [20]. Наиболее изменчиво экспрессируемые гены в CMPs были подтверждены, как бимодально распределяемые, а образование иерархических кластеров этих генов выявило две популяции клеток внутри CMP компартмента, подтвердив, что эта коверианса отражает присутствие дискретных, последовательных транскрипционных программ внутри этой популяции. Анализ прогрессии клона расщепил эти CMP субпопуляции между MegE и лимфомиэлоидным плечами и идентифицировал CD55 как самый отличительный маркер для MegE-ассоцированных CMPs. Функциональный анлиз с использованием in vitro колонии-формирующего подхода и анализа восстановления in vivo показал, что судьбы MegE ограничиваются CD55+ компартментом внутри как MPP, так и CMP предшественников [18], в соответствии с вычисленными предсказаниями на основании данных экспрессии в одиночных клетках и подтверждения четкого разграничения MegE и лимфоидных судеб в пересмотренной модели гематопоэза. Эти данные подтвердили также, что ранее охарактеризованные мульти- и олигопотентные популяции предшественников фактически состоят из смеси клеток с по-разному ограниченной способностью к дифференцировке и это меняет наше мнение о природе детерминации в HSPCs. В целом это исследование иллюстрирует, как профиль экспрессии в одиночной клетке генов поверхностных маркеров может быть использован для идентификации новых клеточных промежуточных образований и путей детерминации, которые затем могут быть выделены и охарактеризованы с помощью функциональных подходов.
Single cell expression analysis defines a key role for GATA binding protein 2 (Gata2) in regulatory networks underpinning MegE versus lymphoid commitment
Сети регуляции генов могут быть сконструированы на базе экспериментов генетических нарушений, анализа корреляций экспрессии и данных по связыванию TF [21]. Однако, на уровне популяции маскируются корреляции из-за усредненной гетерогенной экспрессии индивидуальных клеток [22]. Данные по экспрессии в одиночных клетках поэтому представляют собой важный инструмент для обнаружения регуляторных взаимодействий и увеличивают статистическую силу потому, что ковариансы экспрессии могут быть измерены на многих сотнях одиночных клеток [23]. Анализ экспрессии интеграция коварианс в одиночных клетках вместе с опубликованными ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation and sequencing) данными связывания делают возможной конструирование регуляторной сети, контролирующей выбор MegE в противоположность лимфомиэлоидным судьбам, это позиционирует Gata2 в качестве центрального сильно взаимосвязанного узла в этой сети [18]. Анализ экспрессии в одиночных клетках в HSPCs от гетерозиготных по Gata2 мышей показал, что гаплонедостаточность Gata2 разрушает сеть, приводя к подавлению маркеров MegE и активации лимфомиэлоидных маркеров. Кроме того, Gata2 экспрессия высоко скоррелирована с программой MegE в HSCs, это коррелирует с экспрессией CD150 и это отражается в повышенной склонности CD150+ HSCs формировать колонии MegE in vitro, это согласуется с находками, что большинство CD150+ HSCs являются vWF+ и склонны давать тромбоциты [15]. Эти данные показали, что Gata2 является ключевым регулятором сегрегации MegE и лимфомиэлоидной судеб, и это составляет молекулярную основу механизмов, лежащих в основании исправленной клеточной дорожной карты гематопоэтической детерминации (Figure 2B). Это также иллюстрирует, как анализ одиночных клеток может быть использован, чтобы определить регуляторные связи между TFs и построить генетические сети, контролирующие детерминацию клонов.
Сходное исследование с использованием более ограниченного набора из 18 подобранных TFs, как известно, выполняющего важную регуляторную роль в гематопоэтической дифференцировке, были проанализированы сотни одиночных стволовых клеток и клеток предшественников и также был идентифицирован Gata2 в качестве ключевого игрока, регулирующего детерминацию HSCs в MegE судьбу [24]. Анализ коварианс в одиночных клетках скомбинированный с известной активностью связывания TF уже существующих ChIP-seq баз данных выявил новую регуляторную триаду с участием Gata2, Gfi1 (growth factor independent 1) и Gfi1b. Транскрипционный и трансгенный методы оценили предсказываемые взаимодействия и вместе с известными функциями этих TFs, подтверждено, что эта триада из TFs формирует связанную упреждающую петлю, контролирующую спецификацию HSCs в MegE или лимфомиэлоидный клон. Хотя количество проанализированных генов меньше, чем в более раннем исследовании [18], достигнутая статистическая сила по вычислению коварианс среди сотен индивидуальных одиночных клеток в популяциях с известным потенциалом, оказалась достаточной, чтобы сделать вывод о новых регуляторных взаимодействиях, регулирующих детерминацию клонов.
Linking lineage priming to mechanisms of commitment
Мультиклональный priming в мультипотентных клетках может позволить собрать сведения о состояниях перед детерминацией и тем самым поддержать гибкость относительно клонального потенциала. Выявление и идентификация клеток, подвергшихся детерминации концептуально и технологически проблематично. Однако, выделение клеток на любой из строн от границы детерминации более поддатливо обработке. Гематопоэтическая multipotential cell line (EML) растет в условиях, которые поддерживают её самообновление, состоящее из непрерывных клеточных состояний, при этом систематически отклоняющийся потенциал дифференцировки, который может быть установлен по дифференциальной экспрессии антигена cтволовых клеток, Sca1 (stem cell antigen 1, также известен как Ly6a). Базируясь на анализе популяционного уровня, эти мультипотентные клетки, как полагают, обратимо проходят через ряд клеточных состояний, включая глобальную активацию сцепленных с клонами программ, в то же время сохраняя способность к самообновлению [25]. Однако, анализ одиночных клеток выявил, что отделимые популяции из само-обновляющихся (CD34+Sca1lo) и детерминированных (CD34-Sca1lo) клеток объясняют поведение популяции Sca1lo [16]. qPCR анализ одиночных клеток выявил, что недетерминированные клетки обладают спорадической, независимой активацией сцепленных с клонами генов как для эритроидного, так и миэлоидного клонов, как и в предыдущих сообщениях о мультиклональном priming в мультипотентных клетках. Напротив, клетки, детерминированные в эритроидный клон, обнаруживают более связанную, но гетерогенную совместную экспрессию ранних эритроидных генов, но не генов, ассоциированных с терминальной эритроидной дифференцировкой. Детерминация д. происходить в отсутствие ключевых клональных регуляторов, таких как Gata1, и до активации транскриптомной эритроидной программы [16]. Эти данные подтверждают модель, в которой независимая активация регуляторных факторов запускает разные точки вступления в детерминацию, при этом любая из них может приводить к становлению скоординированной программы дифференцировки. Эта модель сходна с той, которая предположена, исходя из анализа экспрессии в одиночных клетках для клеток, подвергшихся клональному расхождению у ранних эмбрионов и во время клеточного репрограммирования, при котором первоначальная изменчивая, стохастическая экспрессия ключевых регуляторов предшествует становлению иерархической программы [26, 27]. Следовательно, анализ одиночных клеток может быть использован для идентификации маршрутов молекулярного вступления, используемых клетками для спецификации и определения детерминистических, иерархических регуляторных сетей, управляющих детерминацией.
Мультиклональный priming может делать клетки компетентными, чтобы детерминировать один из многих клональных путей. Репертуар экспрессирующихся генов, отражает непосредственный клональный выбор клеткой, подтверждая, что спецификация судьбы происходит перед детерминацией. Следовательно, чтобы быть детерминированной клетка д. противостоять дифференцировке в направлении альтернативного, близко родственного пути. При дифференцировке B клеток компетентность лимфоидного клона устанавливается в LMPPs, как это демонстрирует priming лимфоидного клона в этих клетках, поскольку детерминация происходит в субпопуляции CLPs [11, 28]. Транскрипционные основы детерминации B клеточного клона были исследованы с помощью анализа экспрессии ключевых B клеточных генов в одиночных клетках из субпопуляций с прогрессивным ограничением клонов из CLP компартмента, идентифицируемоего с помощью функционального подхода [28]. Мультиплексный RT-PCR одиночных CLPs показал, что ключевой для B клеток фактор спецификации Ebf1 (early B cell factor 1) активируется, по крайней мере, ограничиваясь CLPs с потенциалом B/natural killer (NK)/T клеток, и почти все бипотентные B/NK CLPs экспрессируют Ebf1, указывая тем самым, что Ebf1 недостаточен для ограничения B клеточного клона. Pax5 (paired box 5) экспрессируется совместно с Ebf1 в немногих недетерминированных бипотентных B/NK CLPs, но оба ко-экспрессируются почти во всех CLPs после детерминации B клеточного клона, что сопровождается активацией многих других В клеточных генов. Следовательно, очевидно, что Pax5 может быть детерминистическим фактором для детерминации В клеток, но он не обязателен для спецификации В клеточного клона - которая активируется с помощью Ebf1 до экспрессии Pax5. Анализ генной экспрессии и потенциалов дифференцировки одиночных Pax5 мутантных pro-B клеток подтвердил, что эти клетки специфицированы, поскольку они экспрессируют гены В клеточных клонов. Однако, они всё ещё одновременно экспрессируют гены миэлоидного и Т клонов и неспособны потерять потенциал дифференцировки в эти типы клеток [29]. Следовательно, Ebf1 инициирует спецификацию B клеток, тогда как Pax5 действует позднее, чтобы управлять детерминацией и предотвращать экспрессию альтернативных сцепленных с клоном генов. Более того, Pax5 сотрудничает с Ebf1, чтобы активировать программу В клеток. Этот механизм может представлять собой ключевой принцип, позволяющий разделять эти два процесса: (i) спецификацию клона, которая начинается в мультипотентных предшественниках с клонального priming, и (ii) детерминацию, которая ограничивает клетки выбором одиночной судьбы. Такое молекулярное разделение взаимосвязанных процессов может обеспечить поддержание гибкости при выборе решений, обеспечивая эффективность дифференцировки.
Многие вопросы остаются относительно природы и значения мультиклонального priming, не в последнюю очередь это связано с тем, является дли низкий уровень экспрессии связанных с клонами генов функциональным или он только отражает текучую транскрипцию с primed хроматинового окружения, которое само по себе необходимо для поддержания потенциала мультиклональной дифференцировки. Связанное с этим и отсутствие ясности, отражает ли уровень РНК экспрессию белка на уровне одиночной клетки и представляет ли наблюдаемая экспрессия на уровне одиночной клетки 'snapshot' динамически флюктуирующей экспрессии или стабильное состояние. Более того, как мультиклональный priming затрагивается внешними и внутренними регуляторами и клеточными процессами, такими как, состояние метаболизма и клеточное деление, ещё не исследовано. Комбинации генов, экспрессирующихся в мультипотентных стволовых и клетках предшественников, по-видимому, варьируют между клетками, приводя таким образом к общераспространенному предположению, что мультиклональный priming может иметь стохастическое происхождение. Однако, существует образующая арку регуляция priming, поскольку только клон-ассоциированные гены согласуются с непосредственным функциональным потенциалом, который клетки экспрессируют. Присутствие открытого хроматина в мультипотентных клетках в локусах primed (активированных) генов, таких как β-globin, IgH, CD3δ и myeloperoxidase подтверждает наличие эпигенетического компонента в контроле мультиклонального priming [30-32]. Более того, недавние исследования эпигенетического профилирования установили, что энхансеры, ассоциированные с клон-специфичными генами, активированы в мультипотентных гематопоэтических предшественниках до экспрессии этих генов в детерминированных клетках [33, 34]. Следовательно, современные данные приводят нас к предположению, что варьирующая экспрессия ассоциированных с клонами генов в мультипотентных клетках отражает присутствие организации primed хроматина, которая предопределяет компетентность к спецификации клонов и генерирует субстрат для детерминации.
Важно помнить, что интегральная роль priming для мультипотентности в целом поставлена под вопрос при анализе ESCs, растущих в условиях с двумя ингибиторами (2i), оптимальными для поддержания плюрипотентности [35]. Профилирование экспрессии выявляет низкий уровень экспрессии сцепленных с клонами генов при 2i по сравнению с ростом в сыворотке. Однако, анализ расположения РНК полимеразы демонстрирует, что многие онтогене6тические гены находятся в конфигурации паузы, при этом полимераза находится на промоторе [14]. Более того, экспрессия сцепленных с клонами генов наблюдается в ESCs, растущих в условиях, более подходящих для дифференцировки [14, 36], и, следовательно, скорее всего, что протекающая (leaky) транскрипция с этих генов в паузе лежит в основе их экспрессии в primed плюрипотентных клетках. Было бы интересно исследовать, действительно ли priming в HSCs возникает в результате стохастической элонгации находящейся в паузе polymerase на генах, сцепленных с клонами. l
Clonal tracking studies challenge the stem cell concept
Классическая и пересмотренная модели гематопоэза (Figure 2A,B), обе базируются на концепции, что клеточные судьбы прогрессивно ограничиваются иерархическим способом благодаря последовательным бифуркациям. Классическая и пересмотренная модель отличаются уровнем, на котором происходит ограничение между лимфоидным и миэлоидным клоном, но в обеих моделях самообновление и детерминация разделены, так что мультипотентность теряется только после выхода из компартмента само-обновляющихся стволовых клеток. Однако, исследования трансплантаций одиночных клеток показали, что индивидуальные HSCs обладают отличающимися склонностями к стабильным миэлоидному и лимфоидному клонам, указывая на функциональную гетерогенность в наиболее очищенном компартменте HSC [37, 38]. Новый мультиклональный репортер мыши недавно был использован, чтобы одновременно отслеживать тромбоциты и эритроидные клетки помимо миэлоидных и лимфоидных клеток, происходящих из одиночных трансплантированных HSCs. Это исследование установило, что большое количество клеток в наиболее примитивном компартменте HSC (CD150+CD41-CD34-c-Kit+Sca1+Lin-) испытывает миэлоидную детерминацию, так что они оказываются ограниченными клонами Meg, myeloid или MegE (24%, 24% и 7% из трансплантированных мышей, соотв.), но имели долговременное самообновление и способность к приживлению трансплантата (признак стволовых клеток) [39]. Важно, что 64% myeloid-restricted progenitors (MyRPs) воспроизводили миэлоидный и Meg клоны в течение более 8 недель в противоположность классическим MPP и LMPPs, которые не обнаруживали способности к долговременному самообновлению. Более того, трансплантации парных дочерних клеток продемонстрировали, что эти MyRPs возникают непосредственно из HSCs расположенных выше традиционных детерминированных предшественников. Итак, существенная пропорция MegE и миэлоидных клеток может происходить благодаря этому миэлоидному обходному пути, а не из классических мультипотентных предшественников (Figure 2C), при этом возможно, что пониженная способность к приживлению трансплантата у MPPs и LMPPs может быть результатом недооценки их вклада в измерения, базирующиеся на трансплантациях. MyRPs были преимущественно CD150+, и могут быть эквивалентными vWf+ platelet-primed HSCs, описанными ранее [15,18], которые также содержатся в CD150+ LT-HSC компартменте. Дифференциальная экспрессия SLAM маркера CD150 и др. маркеров семейства SLAM помимо CD41 обогащена в biased подтипах HSCs [39, 40, 41], но анализ экспрессии одиночных клеток необходим для идентификации специфических маркеров клеточной поверхности, чтобы ещё больше обогатить и охарактеризовать как biased, так и клонально ограниченные HSCs.
Исследования по клональному отслеживанию функции HSC базируются на трансплантациях облученным реципиентам, чтобы оценить клональный потенциал и свойства самообновления, но myeloablative реконструкция может не отражать нормальную функцию HSC во время гомеостатического устойчивого гематопоэза. Недавно in vivo отслеживание клонов HSPCs [42] предоставило новую информацию по гематопоэзу. Использование индуцибельной Sleeping Beauty transposase для штрихового кода HSPCs in situ, был проанализирован клональный репертуар в потомстве гранулоцитов, B и T клеток с помощью объединенного next-generation секвенирования мест уникальных инсерций во многих временных точках в течение года после мечения. Этот продолжительный анализ выявил, что в противоположность отслеживанию клонов на базе трансплантаций, при котором небольшие количества происходящих из HSC клонов отвечали за большинство гематопоэтических исходов [43], многие тысячи долго живущих предшественников успешно рекрутируются, чтобы продуцировать зрелые кровяные клетки в устойчивых состояниях. Основной сдвиг paradigm может поэтому быть необходим в гематопоэтической области, поскольку эта работа подтвердила, что фенотипические HSCs, как установлено с помощью трансплантаций, вносят минимальный вклад в гомеостатический гематопоэз. Напротив, большая часть продукции крови управляется преимущественно с помощью последовательного рекрутирования и пролиферации долго живущих мультипотентных и миэлоидных предшественников, подтверждая, что регуляция гематопоэтической детерминации может быть более сложной, чем это полагали. Дальнейший анализ этой модели необходим для определения, когда и как генерируются эти предшественники и действительно ли канонические HSCs рекрутируются во время старения или стрессов. Более того, эти находки ставят важные вопросы о клеточном происхождении экспрессируемых инициальных мутаций при гематологическом озлокачествлении и возникают ли эти мутации в и нарушают функцию долго живущих предшественников скорее, чем классически определяемых HSCs.
Итак, отслеживание клонов и анализ трансплантаций одиночных клеток подтвердил модель градированной детерминации, согласно которой спектр наследуемых клон-ограниченных и клон-biased клеток присутствует как в HSC, так и MPP популяциях, хотя и до некоторой степени иерархически организованным образом, и подтверждает, что модели детерминации канонических последовательных бифуркаций в гематопоэтической иерархии (Figure 2A,B) д. быть пересмотрены. Пока неясно, действительно ли гематопоэз осуществляется в результате упорядоченной последовательности прогрессивно ограничиваемых промежуточных состояний, таких как CMPs и CLPs (Figure 2A),или действительно ли большинство миэлоидных, мегакариоцитарных и эритроидных клеток продуцируется непосредственно из клон-ограниченных HSCs в модели myeloid bypass (Figure 2C) [39]. Недавние исследования ставят под сомнение идею, что HSCs являются обязательно мультипотентными, и было предположено, что операционное определение стволовых клеток д. быть пересмотрено и что способность клеток к самообновлению может восстанавливаться, по крайней мере, в одном клоне у реципиентов, по крайней мере, 16 недель [44]. Более того, природа долго живущих предшественников подкрепляет устойчивое состояние гематопоэза [42], а их онтогенез пока исследуется и может потребоваться дальнейший пересмотр дорожной карты гематопоэза.
Concluding remarks
Functional single cell analyses of HSCs have underscored the importance of studying cell fate decisions at the level of individual cells because population level studies cannot discriminate between a homogeneous set of multipotential self-renewing cells and a mixture of cells with varying degrees of lineage bias and self-renewal capacity. These studies have revealed extensive heterogeneity in classically defined HSC and MPP compartments, and have shown that many cell behaviors are not yet prospectively isolatable by known surface markers, although heritable lineage biases exist within defined subsets. Elucidating the molecular basis of cellular decision-making during lineage commitment will therefore require the analysis of gene expression programs and epigenetic regulation at the single cell level.
Original single cell expression studies used multiplex RT-PCR to measure a few genes per cell [3, 7, 11], but increased multiplexing with microfluidic based qPCR profiling has increased throughput to allow tens to hundreds of genes to be analyzed across many hundreds of cells [18]. However, these methods still require the user to select the set of genes to be analyzed, and this inevitably introduces a significant bias into the data obtained and as such limits the conclusions that may be drawn from these studies. Whole-transcriptome profiling of single cells is therefore necessary for unbiased interrogation of the regulatory networks controlling commitment, and a variety of robust single cell RNA-seq protocols have recently been developed [45, 46, 47, 48]. Discerning biological variation from technical noise is still an issue for low expressed genes owing to the low sensitivity of single cell transcriptomic sequencing approaches, but the use of spike-ins and improved molecular barcoding strategies has improved quantification [48, 49]. Two recent pioneering studies used single cell RNA-seq to identify subsets of dendritic cell types in the spleen and bone marrow, as well as the networks controlling differential responses to pathogens [20, 50, 51]. These studies have illustrated that single cell RNA-seq can be used to identify novel cell types and developmental states within a population using methods such as hierarchical clustering and principal component analysis (PCA). Identification of multimodal variation in single cell expression data can be useful to identify genes associated with discrete cell types or cell states within these populations. Gene sets that discriminate between these different cell states can then be mined for functional pathways to aid in identifying the biological basis for the differences between the cells. Furthermore, each single cell is treated as an individual sample, and the large number of cells analyzed enables covariance to be used to construct gene regulatory networks from the data. The different cell types may then be prospectively isolated based on markers identified in these gene sets, allowing functional studies and perturbation experiments to validate predicted regulatory interactions. These studies elegantly showed that the effect of extrinsic signals on the regulatory networks in individual cells can be highly heterogeneous and dynamic [20, 50, 51] Applying transcriptome-wide single cell RNA-seq to hematopoietic stem and progenitor cells will be crucial for understanding the considerable molecular and functional heterogeneity in these cells and to delineate the mechanisms controlling lineage commitment.
More widespread uptake of methods for time-lapse imaging of single cells expressing reporters for particular candidate regulators will be necessary to determine whether the priming of lineage-affiliated genes in HSPCs before commitment reflects stochastic, dynamic expression states or static expression associated with a pre-committed state [52]. Moreover, fluctuations in RNA levels as a result of transcriptional bursting may not be reflected in the protein levels owing to the different half-lives of mRNA and protein molecules [53]. Medium throughput analysis of protein levels can be performed on single cells using mass cytometry [54], but it will ultimately be desirable to measure protein and RNA levels in the same cell. This may be achieved for small numbers of genes in fixed cells using RNA-FISH combined with antibody staining [55], but ideally methods for RNA and protein measurements that do not destroy the cell of interest will be necessary to relate gene expression with cell behavior. These measurements will require transcriptional and translational reporters to be combined in single-molecule imaging and quantification experiments.
So far, in the hematopoietic system single cell analysis of the expression of multiple genes across many single cells has identified promiscuous, uncoordinated expression of lineage-affiliated regulators in multipotential cells preceding the coalescence of coherent transcriptome-wide programs in committed cells. Gene expression results from permissive chromatin conformations and TF occupancy at regulatory elements, and therefore mapping TF binding and histone modifications in single cells will be necessary to understand the underlying basis for phenomena such as multilineage priming. Single cell epigenomic analysis is not yet feasible although very small cell number ChIP has been described recently [34]. iChIP uses barcoding to tag individual samples before performing ChIP on pooled chromatin, and can be used to map histone modifications in as few as 500 primary cells. This and other analyses revealed that enhancers associated with lineage-specific genes are already activated in uncommitted progenitors before the expression of those genes in committed cells [33, 34], suggesting an epigenetic basis for multilineage priming. We propose that multilineage priming reflects an underlying primed epigenetic state that defines the competency of the cell to differentiate into a particular lineage, and facilitates the ability of key intrinsic or extrinsic cues to trigger lineage commitment. Commitment would therefore require alternative lineage programs to be extinguished through repression or decommissioning of their associated enhancers, alongside further activation and reinforcement of enhancers at active lineage-affiliated genes.
Figure 2 Revising the road map for lineage commitment in the hematopoietic system. Lineage commitment pathways have been proposed based on the prospective isolation of lineage-restricted progenitor populations and assessment of their lineage potential through reconstitution of irradiated recipients and/or in vitro differentiation assays. (A) The classical model posits that stem cells and multipotent progenitors reside at the apex of the hierarchy with restriction to MegE, lymphoid, or myeloid fates occurring in downstream progenitors that have lost self-renewal capacity. Common myeloid progenitors (CMP) and common lymphoid progenitors (CLP), therefore, represented the first lineage restriction point in the lineage tree. (B) The classical roadmap was revised once it was discovered that the MPP compartment contains lymphomyeloid-restricted progenitors (LMPPs) that have lost MegE potential. Recently, HSCs with potent MegE potential but little or no lymphoid potential have been identified, suggesting that MegE commitment may occur in HSCs and represents the first branchpoint in the lineage tree (indicated by broken arrow). In both the classical model and the revised model self-renewal capacity and multipotentiality are tightly linked in apical HSCs residing at the top of the hierarchy. (C) Myeloid bypass model: multilineage clonal tracking of single HSCs has suggested a myeloid bypass model in which megakaryocyte- and myeloid-restricted progenitors are generated in the most primitive HSC compartment which are capable of long-term self-renewal and reconstitution of restricted myeloid lineages. This model is significantly different to the earlier models (A,B) because it suggests that self-renewal and multipotentiality can be uncoupled. Abbreviations: c-Kit, c-Kit proto-oncogene; Ery, erythroid; Flt, FMS-like tyrosine kinase 3; G/M, granulocyte/monocyte; GMP, granulocyte/monocyte progenitor; HSC, hematopoietic stem cell; KLS, Kit+, Lin-, Sca1+; Lin- cells, cells negative for lineage markers; Meg, megakaryocyte; MegE, megakaryocyte/erythroid; MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor; MPP, multipotent progenitor; MyRP, myeloid-restricted progenitor; Sca, stem cell antigen 1.