Ophthalmic trigeminal (opV) плакоды являются областью эктодермы, расположенной дорсолатеральное по отношению к среднему мозгу и ростральнее заднего мозга. Клетки из opV плакоды отделяются и агрегируют в глубине мезенхимы, внося вклад, а нейроны opV ганглия (D'Amico-Martel and Noden,1983). Плакоды opV вносят вклад только в сенсорные нейроны ганглия, это делает их прекрасной моделью для изучения сенсорного нейрогенеза и нейрональной дифференцировки. Pax3 это самый ранний маркер, экспрессирующийся специфически в opV плакоде (Stark et al., 1997). Экспрессия мРНК Pax3 начинается в плакоде на ст. 4-х сомитов somite stage (ss), а сильная экспрессия белка обнаруживается в некоторых клетках, начиная со ст. 7 ss, предположительно непосредственно перед началом спецификации и детерминации нейрональной судьбы на ст. 8 ss (Baker et al., 1999). Т.к. клетки дифференцируются в течение продолжительного периода, они отсоединяются от эпителия и мигрируют, чтобы сконденсироваться с соседними клетками нервного гребня и сформировать ганглий. Во время этого процесса плакодные клетки экспрессируют дополнительные молекулярные маркеры, характерные для их будущей судьбы. Пока всё ещё в эктодерме, fibroblast growth factor receptor-4 (FGFR4) временно активируется и экспрессируются пронейральные маркеры Neurogenin2 (Ngn2) и Brn3a вместе с некоторыми компонентами сигнального пути Notch/Delta (Marcelle et al., 1994; Stark et al., 1997; Perez et al., 1999; Begbie et al.,2002; Lassiter et al., 2010). FGF, Wnt и Notch передача сигналов были оценены по их роли в дифференцировке сенсорных нейронов, используя в качестве модели opV плакоды эмбрионов кур (Lassiter et al., 2007, 2009, 2010; Canning et al., 2008). Pax3 экспрессируется в ранних плакодах и продолжает свою экспрессию в течение поздних стадий дифференцировки нейронов, он также был изучен в отношении его роли в сенсорном нейрогенезе opV. Было показано, что экспрессия Pax3 совпадает со спецификацией и детерминацией плакодных клеток opV, это указывает на возможную роль Pax3 в спецификации и детерминации плакодных клеток (Baker et al., 1999). Др. исследование продемонстрировало, что функциональный Pax3 необходим для нейрогенеза в opV ганглий, глазничный нерв уменьшен или отсутствует у Splotch мышей (Tremblay et al., 1995). Наконец, блокирование генов мишеней для Pax3 с помощью Pax3-Engrailed слитого белка предупреждает нейрогенез, тогда как эктопическая экспрессия Pax3, как было установлено, достаточна, чтобы активировать экспрессию ранних плакодных и пронейральных маркеров FGFR4 и Ngn2, но недостаточна для нейральной дифференцировки (Dude et al., 2009). Фактически помимо передачи сигналов Notch, подавление которой необходимо для нейрональной дифференцировки, Pax3 и др. молекулярные компоненты были описаны в opV плакоде как необходимые, но недостаточные для дифференцировки чувствительных нейронов.

Pax3 транскрипционный фактор состоит из N-терминального ингибирующего домена, консервативного paired domain (PD), консервативного octapeptide domain (OD), гомеодомена (HD) и C-терминального transactivation domain (TAD), богатого serine, threonine и proline (Fig. 1; Chalepakis et al., 1994a, 1994b; Seo et al., 1998; Barr et al., 1999). Pax3 экспрессируется в разного типа тканях. У ранних эмбрионов он экспрессируется в дорсальной части нервной трубки, дермомиотоме, в клетках мышечных предшественников конечностей, клетках нервного гребня и в тройничной плакоде (Goulding et al., 1991; Bober et al., 1994; Stark et al., 1997). Pax3 действует с помощью множественных отличающихся способов, зависящих от типа клеток, в которых он экспрессируется. Он необходим для нормального нейрогенеза и миогенеза, на что указывают аномалии этих тканей у мутантных Splotch мышей и при синдроме Waardenburg's у людей (Waardenburg, 1951; Auerbach, 1954; Epstein et al., 1991; Tassabehji et al., 1993). Pax3 функционально ассоциирует с событиями клеточной пролиферации, дифференцировки, позиционными характеристиками и миграцией (Epstein et al., 1993; Evans and Lillycrop, 1996; Maroto et al., 1997; Baker and Bronner-Fraser, 2000; Mayanil et al., 2001; Streit, 2004; Wu et al., 2008; Collins et al.,2009).

Для нас интересно, что эктопическая экспрессия Pax3 в краниальной эктодерме может вызывать в клетках активацию некоторых ранних маркеров плакод opVs, но она недостаточна для отделения клеток и нейрональной дифференцировки (Dude et al., 2009). Поскольку мы тщательно оценили доступную литературу о функции Pax3, мы убедились, что дифференциальный сплайсинг Pax3 происходит в некоторых сценариях и что разные варианты обладают уникальными свойствами - некоторые действуют как активаторы транскрипции, а др. как репрессоры транскрипции (Chalepakis et al., 1994a; Kioussi et al., 1995; Vogan et al., 1996; Mayanil et al., 2001; Kwang et al., 2002; Relaix et al., 2003; Hsieh et al., 2006). Альтернативный сплайсинг Pax3 продуцирует потенциал множественных изоформ, которые могут стабилизировать связывание с субоптимальными последовательностями распознавания или распознавать специфические последовательности ДНК разных генов мишеней (Vogan and Gros, 1997). т.о., Pax3 потенциально регулирует экспрессию многих генов мишеней за счет разных ДНК-связывающих сайтов и такая регуляция может быть оптимизирована посредством альтернативного сплайсинга. Альтернативный сплайсинг Pax3 был охарактеризован в клетках человека и в эмбрионах мышей (Goulding et al., 1991; Barber et al., 1999), но не у кур. Изоформы Pax3 у человека и мыши или отсутствуют, или содержат больше экзонов или они укорочены, приводя в результате к отсутствию различных доменов в белке (Pritchard et al.,2003; Tsukamoto et al., 1994; Chalepakis et al., 1994a; Parker et al., 2004). Мы намерены определить: (1) присутствуют ли разные сплайс-варианты у ранних эмбрионов кур, (2) whether they were present specifically in the opV placode, and (3) влияют ли они на клеточную дифференцировку уникально по сравнению с др. при эктопической экспрессии в регионе opV плакоды.

Полученные данные показывают, что сплайс-варианты Pax3 присутствуют у ранних эмбрионов кур и в плакодной opV эктодерме во время раннего развития, при этом количественно экспрессия между сплайс-вариантами отличается во время оцениваемых стадий развития. Получена эктопическая экспрессия каждой изоформы внутри краниальной эктодермы и оценена нейрональная дифференцировка. Полученные данные подтверждают вариант Pax3V2 обладает уникальными свойствами по сравнению с др. вариантами, свойствами, которые позволяют специфицировать клетки, чтобы направить их на дифференцировку нейронов.

DIscussion

Некоторые последние публикации идентифицировали Pax3 в качестве существенного компонента во многих онтогенетических процессах, включая дифференцировку мышечных клеток (Tajbakhsh et al., 1997; Relaix et al., 2003; Bajard et al., 2006), миграцию клеток нервного гребня (Serbedzija and McMahon, 1997; Mansouri et al., 2001), жизнеспособность клеток сомитов (Borycki et al., 1999) и сенсорный нейрогенез opV (Baker et al., 1999; Dude et al., 2009). Dude et al. (2009) пришли к заключению, что активация генов мишеней для Pax3 необходима для сенсорного нейрогенеза в opV плакоде, и что некоторые специфичные для opV гены активируются в ответ на эктопическую экспрессию Pax3, но Pax3 не достаточен для дифференцировки нейронов. Дополнительные наблюдения, включая представленные здесь; показывают, что эктопическая экспрессия Pax3 в домене opV плакоды действительно ингибирует дифференцировку. Чтобы лучше понять, как Pax3 активирует важные гены мишени в opV плакоде и может ингибировать нейрогенез, мы попытались понять, действительно ли определенные изоформы Pax3 м. по-разному регулировать этот процесс.

Одна изоформа, Pax3V1, содержит делецию, которая захватывает часть paired домена и весь домен octapeptide. Домен paired необходим и достаточен для связывания ДНК (Treisman et al., 1991), хотя C-концевая область этого домена, по-видимому, не существенна, поскольку мутации в этом регионе не влияют на связывание ДНК (Apuzzo et al., 2004). Домен octapeptide у Pax5, как было установлено, связывает ко-репрессор, указывая тем самым, что домен octapeptide участвует в межбелковых взаимодействиях (Eberhard et al., 2000). Замещение Pax3 неспецифическим доменом линкерного региона Pax3 показало, что линкерный регион также важен для взаимодействия между paired доменом и гомеодоменом (Fortin et al., 1998). Несмотря на доказательства, что этот регион д. играть важную роль в функционировании Pax3, эктопическая экспрессия Pax3V1 (который имеет частичную делецию в paired домене и полную делецию octapeptide домена) даёт сходные результаты с теми, что наблюдаются после эктопической экспрессии flPax3, где Pax3V1+ клетки остаются в эктодерме и не экспрессируют маркера дифференцировки Islet1. Мы ожидали, что функциональные различия между изоформами Pax3V1 и Pax3V2 обусловлены частичной делецией домена paired и полной делецией домена octapeptide в Pax3V1; однако, этого не наблюдалось, в результате наше внимание сфокусировалось на функции др. Pax3 изоформы.

Вторая изоформа, Pax3V2, содержит частичную делецию в C-терминальном регионе гомеодомена и крупную делецию трансактивационного домена. Гомеодомен распознает ДНК и содержит остатки, которые взаимодействуют с ДНК (Birrane et al., 2009). Трансактивационный домен важен, но недостаточен для транскрипционной активности (Lechner and Dressler, 1996) и он участвует в межбелковых взаимодействиях с различными кофакторами (Eberhard et al., 2000; Murakami et al., 2006). Эксперименты с эктопической экспрессией с использованием изоформы Pax3V2 показали, что даже несмотря на большое количество оставшихся в эктодерме клеток Pax3V2+, значительно больше их отделяются от эктодермы, чем клетки Pax3 или Pax3V1, и мигрирующие клетки были обычно Islet1+. Однако, когда изоформа Pax3V2 экспрессировалась эктопически в компетентной эктодерме каудальной части плакоды opV, экспрессия Islet1 не усиливалась, демонстрируя, что изоформа Pax3V2 недостаточна для сенсорного нейрогенеза. Эти результаты указывают, что изоформа Pax3V2 является пермиссивной молекулой для сенсорного нейрогенеза в opV плакоде. Последующие эксперименты в условиях, поддерживающих нейрогенез (за счет блокирования передачи сигналов Notch с помощью DAPT) также подтвердили эту гипотезу, т.к. столько же намеченных клеток экспрессируют Islet1 у эмбрионов Pax3V2, что и у flPax3 или Pax3V1 эмбрионов. Можно предположить, что Pax3V2 является нефункциональным. Присутствие этой изоформы как в эмбрионах в целом, так и плакодной кДНК, выявляется с помощью нашей PCR стратегии и демонстрирует, что она появляется довольно в большом количестве и, скорее всего, функционирует определённым способом в клетке. Сходная изоформа существует у млекопитающих (Pritchard et al., 2003; Parker et al., 2004). Описан метод тестирования этой изоформы, который показал, что частичная делеция TAD инактивирует транскрипцию генов мишеней для Pax3 (Pritchard et al., 2003), тогда как др. показали, что трансактивационный домен участвует в межбелковых взаимодействиях, важных для регуляции генов (Murakami et al., 2006; Hsieh et al., 2006). Если Pax3V2 действует как репрессор транскрипции, то единственная возможная модель в opV плакоде то, что индивидуальные клетки, подвергающиеся дифференцировке, временно активируют Pax3V2 на достаточных уровнях, чтобы инактивировать определенные Pax3 мишени, разрешив тем самым дифференцировку. Однако, это маловероятный сценарий для известных мишеней, поскольку эктопическая экспрессия flPax3 приводит к активации FGFR4 и Ngn2. Собственно баланс экспрессии Pax изоформ, скорее всего, имеет место, однако, из-за эктопической экспрессии flPax3 также нарушается развитие в отической плакоде, экспрессирующей Pax2 (Dude et al., 2009). Исходя из этих данных, мы далее протестировали гипотезу, что уровни экспрессии Pax3V2 увеличиваются по отношению к экспрессии flPax3, когда индивидуальные клетки сдвигаются в направлении дифференцировки. Использована стратегия количественного PCR и мы наблюдали устойчивое увеличение экспрессии и flPax3 и Pax3V2 в эктодерме на ст. 6-8 ss, до 10-15 ss и до 20-25 ss, что сопровождалось достоверным снижением на 32-37 ss. В целом различия между flPax3 и Pax3V2 были одинаковы во время этих стадий, при этом flPax3 было в 1.4 - 1.9 раз больше. После воздействия DAPT, различия в целом опять были сходны, при этом концентрации обоих вариантов увеличивались. Следовательно, количественный PCR показал, что flPax3 и Pax3V2 не меняют свои относительные уровни экспрессии в ходе стадии дифференцировки opV плакоды, указывая, что тканевые изменения в экспрессии сплайс-вариантов не объясняют перехода клеток к дифференцированному состоянию. Остается вопрос, действительно ли индивидуальные клетки временно модулируют относительную экспрессию сплайс-вариантов в критические моменты дифференцировки, так после экспрессии FGFR4 и Ngn2 и перед активацией Islet1. Как было предположено выше, правильное модулирование относительных уровней изоформ Pax3 в индивидуальных клетках может быть важным. Анализ qPCR индивидуальных клеток сможет выявить временные изменения, однако, чтобы идентифицировать клетки на соотв. стадии дифференцировки необходим специфический инструмент на сегодня недоступный. Наблюдение, что экспрессия Pax3 возрастает после ингибирования Notch может быть важным, особенно в свете опубликованных результатов, показавших, что в клетках миогенных предшественников активация Notch-1, как было установлено усиливает экспрессию белка Pax3, а избыточная экспрессия

Notch ингибитора, Numb, снижает экспрессию Pax3 (Conboy and Rando, 2002). Мы полагаем, что экспрессия Pax3стоит выше большинства др. событий и определенно предшествует любым изменениям в регуляции Notch, поскольку предыдущая работа показала, что Pax3 регулирует эффекторный для Notch ген Hes1 (Nakazaki et al., 2008; Ichi et al., 2011). Результат, описанный здесь, показывает, что в opV плакоде, ингибирование Notch действует или усиливая экспрессию Pax3 или добавляя больше Pax3-экспрессирующих плакодных клеток к пулу. Предположение, что Notch может активировать Pax3, является новым интересным открытием в сложной сети регуляторных генов, контролирующих сенсорный нейрогенез. Данное исследование охарактеризовало 4 Pax3 сплайс-варианта, экспрессирующихся в opV плакоде эмбрионов кур вовремя нейрональной дифференцировки. Две из этих изоформ, flPax3 и Pax3V1, обусловливают неспособность нейрональной дифференцировки, когда они эктопически экспрессируются в плакодной эктодерме, тогда как третья изоформа, Pax3V2, делала возможным нейрогенез. Четвертый сплайс-вариант экспрессируется лишь на очень низком уровне в opV плакоде. При проверке уровней экспрессии с помощью qPCR, flPax3 был обнаружен, экспрессирующимся приблизительно в 1.4- 1.9 раз выше, чем Pax3V2 во время всего развития плакоды, при этом не получено доказательств сдвига в соотношении экспрессии в какой-либо момент времени. Однако, этот подход был осуществлен в отношении мРНК, изолированной из всего плакодного домена, но это не отражает того, что может происходить в индивидуальных клетках. Следовательно, мы не можем исключить возможности, что кратковременный сдвиг в соотношении экспрессии сплайс-вариантов происходит в начале нейрогенеза.

Характеристика каждого такого события, скорее всего, нуждается в маркере для живых клеток для оценки быстрых событий отделения/дифференцировки, что сопровождалось бы PCR одиночных клеток или нужен др. метод детекции специфических сплайс-вариантов на уровне одиночной клетки. FGFR4, как было установлено, временно активируется в отделяющихся клетках у эмбрионов кур и перепела (Stark et al., 1997), так что возможно, что FGFR4 репортер мог бы служить этой цели. Наблюдение, что экспрессия Pax3 усиливается после ингибирования Notch это новое наблюдение и его необходимо исследовать далее в отношении возможной двойной роли Pax3; экспрессируемого рано для одной цели и активируемого перед нейрональной дифференцировкой (в ответ на снижение передачи клеточных сигналов Notch) для др. цели. Мы полагаем: (1) flPax3 и Pax3V1 изоформы ингибируют нейрональную дифференцировку; (2) изоформа Pax3V2 позволяет происходить нейрональной дифференцировке; (3) относительные уровни экспрессии сплайс-форм в основном сохраняются, когда измеряются в целом эмбрионе или в домене тройничной плакоды на нескольких стадиях; и (4) экспрессия Pax3 в целом возрастает в ответ на ингибирование Notch.