Во время развития метанефрических почек эпителиальные клетки высоко пролиферирующих ureteric bud (UB) подвергаются морфогенезу ветвления и дифференцируются, чтобы сформировать древо функциональных собирающих канальцев почек. Эпителий UB состоит из эпителия UB верхушки и UB ствола. Верхушечные клетки UB являются стволовыми клетками, которые дают клетки ствола UB и также само-обновляются, чтобы создать больше верхушечных клеток UB вплоть до постнатального дня (P) 4-P6 у мышей (Shakya et al., 2005; Rumballe et al., 2011). Клетки ствола UB пролиферируют, чтобы сгенерировать больше клеток ствола UB (Shakya et al., 2005) и дифференцируются в эпителий собирающих канальцев, начиная примерно со ст. E15.5 (Marose et al., 2008). Т.о., эпителий UB верхушки и ствола представлен популяцией клеток предшественников для будущего эпителия собирающих канальцев развивающихся постоянных почек (metanephros). Эпителий собирающих канальцев представлен первоначально двумя типами клеток, принципиальными клетками и интеркалированными клетками, которые отличаются по структуре и функции (Bagnis et al., 2001). Система почечных собирающих канальцев играет критическую роль в регуляции воды в теле и в солевом гомеостазе и в кислотно-щелочном балансе. Следовательно, дифференцировка собственно собирающих канальцев из UB эпителиальных предшественников во время эмбрионального и плодного развития является жизненно важной для функции почек. Предыдущие экспериментальные доказательства показали, что β-catenin-обеспечиваемая передача сигналов в эпителии UB и Heregulin из мезенхимы вносит вклад в переход UB эпителиальных клеток предшественников в дифференцированные судьбы (Sakurai et al., 2005; Marose et al., 2008). Кроме того, передача сигналов Notch и транскрипционный фактор Foxi1 вносят вклад в выбор судеб UB эпителиальными клетками между принципиальными и интеркалируемыми клетками (Blomqvist et al., 2004; Jeong et al., 2009; Guo et al., 2014). Известна роль эпигенетических механизмов в выборе судеб UB эпителиальными клетками, т.к. потеря Dot1l, H3K79 methyl transferase, в принципиальных клетках приводит к их переходу в интеркалированные клетки (Wu et al., 2013).

Не кодирующие РНК, такие как микроРНК (miRNAs), известны как молекулярные реостаты для модулирования экспрессии их генов мишеней, чтобы способствовать выбору клеточной судьбы и клеточной дифференцировки (Wu et al., 2009). Фактически, miRNAs впервые были открыты благодаря гетерохронным мутациям у C. elegans, у которых lin-4 и let-7 miRNAs, как было установлено, регулируют время разных онтогенетических событий во время перехода от личиночной ко взрослой стадии червя (Ambros, 2011). Во взрослых или ткане-специфических стволовых клетках miRNAs, как было установлено, регулируют переход от сильно пролиферирующих и само-обновляющихся клеток предшественников к выбору судьбы терминально дифференцированных клеток в нескольких системах, включая и нервную ткань, скелетные и кардиальные мышечные ткани, кожу и эпителиальные клетки бронхиальных воздушных путей, а также гематопоэз (Fazi and Nervi, 2008; Gangaraju and Lin, 2009; Lize et al., 2011; Akerblom and Jakobsson, 2013; Follert et al., 2014; Ghosh et al., 2014; Johanson et al., 2014). Кроме того, значение пути miRNA для дифференцировки клеток было установлено на базе нарушений дифференцировки дефицитных по Dicer и DGCR8 embryonic stem (ES) клеток it и in vivo (Gangaraju and Lin, 2009; Chen et al., 2010) и дефектов дифференцировки и функции остеокластов при нарушении Dicer-регулируемого пути биогенеза miRNA (Sugatani and Hruska,2009). Нарушения регуляции miRNAs были также связаны с изменениями клеточных судеб, имеющими место при туморогенезе и инициации раковых опухолей (Chao et al., 2014; Morris et al., 2014).

Роль одного из семейств miRNA, семейства let-7, в обеспечении клеточной дифференцировки была широко изучена на нескольких органных системах (Bussing et al., 2008; Roush and Slack, 2008; Ambros, 2011; Sokol, 2012; Bao et al., 2013; Copley and Eaves,2013; Meza-Sosa et al., 2014). Консервативная роль let-7 семейства miRNAs заключается в супрессии ранних регуляторов клеточных судеб и в содействии клеточной дифференцировке по ходу развития. miRNA let-7 не обнаруживается в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека, а уровни её экспрессии увеличиваются во время дифференцировки. Одной из мишеней для let-7 является Lin28 (Ambros, 2011), которая также действовала критически в гетерохронном пути C. elegans, она была использована в качестве репрограммирующего фактора, чтобы направлять развитие из induced pluripotent stem cells (iPSCs) (Yu et al., 2007). Более того, во время репрограммирования дифференцированных клеток в iPSCs, базирующийся на let-7 путь, как оказалось, противодействует активности репрограммирующих факторов, способствуя генов дифференцировки (Worringer et al., 2014). Члены семейства let-7, как было установлено, также играют критическую роль в спецификации клонов во время нейрональной дифференцировки в развивающемся головном мозге эмбрионов мыши (Wulczyn et al., 2007; Meza-Sosa et al., 2014) и участвуют в качестве ключевых регуляторов перехода от ранних к поздним предшественникам сетчатки (La Torre et al., 2013). В эритроидных клетках человека и гематопоэтических органах Lin28b-обеспечиваемая супрессия let-7 регулирует онтогенетический переход от плода ко взрослому состоянию эритробластов (Lee et al., 2013). Также у мышей во взрослых фибробластах let-7 miRNAs супрессирует экспрессию онтогенетических программ средины беременности, представляющих период между плюрипотентным состоянием на ст. E3.5 и дифференцировкой на ст. E10.5 (Gurtan et al., 2013). Исследования показали. что нарушения регуляции let-7-обусловленной экспресси и генов приводят к инициации рака и туморогенезу (Boyerinas et al., 2010).

В наших предыдущих исследованиях со специфическим для UB Dicer мутантными мышами (Dicer UB mutants), мы продемонстрировали критическую роль miRNAs из UB клона для морфогенеза ветвления UB и контроля размеров и дифференцировки собирающих канальцев (Nagalakshmi et al., 2011). В данном исследовании мы попытались определить miRNA-регулируемые изменения транскрипции у Dicer UB мутантов. Был идентифицирован новый феномен miRNA-обеспечиваемого временного ограничения экспрессии генов в UB эпителии во время развития почек. Кроме того, мы подтвердили и расширили наши предыдущие находки, что Dicer-обеспечиваемые miRNA-регулируемые пути являются критическими для перехода от раннего к позднему выбору клеточных судеб в UB эпителии, что делает возможной нормальную дифференцировку собирающих канальцев. Более того, мы идентифицировали паттерн временной экспрессии let-7 семейства miRNAs в UB эпителии, который обратным образом коррелирует сс таковой некоторых ранних UB генов, включая их предполагаемые гены мишени.

miRNAs регулируют мириады биологических процессов в живых организмах. Критические регуляторные функции miRNAs в развитии почек и при болезнях занижены экспериментальными доказательствами присутствия miRNA-обеспечиваемой регуляции генов в почках, также как и дефектными фенотипами почек, наблюдаемыми в некоторых исследованиях, при которых путь глобального биогенеза miRNA или экспрессия индивидуальных miRNAs нарушены. Наш ранний фенотипический анализ Dicer UB мутантов выявил значение miRNA-регулируемых путей в UB ветвления и детерминации размеров собирающих канальцев и терминальной дифференцировки (Nagalakshmi et al., 2011). Данное исследование ещё больше подтвердило и расширило возможности Dicer-зависимых miRNAs в регуляции судеб UB эпителиальных клеток во время онтогенеза. Подчеркивается зависимый от miRNA паттерн временной экспрессии ранних UB генов в UB эпителии во время эмбрионального развития и участие let-7 семейства miRNAs в этой регуляции.

Наш биоинформационный и in situ гибридизационный анализ показали, что во время развития UB, группа генов, которые мы обозначили как ранние UB гены, присутствует в UB эпителии на ранних стадиях (Fig. 1). Сходные временные изменения в UB эпителии были описаны перед активностью канонических Wnt (Jho et al., 2002; Maretto et al., 2003; Iglesias et al., 2007) и экспрессией Sall4 (Toyoda et al., 2013) в развивающемся теле UB. Данное исследование показало, что это не редкий феномен в развитии UB; скорее всего, экспрессия значительной группы генов замалчивается позднее в эмбриональном развитии UB. Очевидно, что ряд ранних UB генов, скорее всего, крупнее чем представленный в Table 1, т.к. наш анализ сконцентрирован только на генах, чья экспрессия усиливается в 1.5 раза и больше после потери Dicer. Вполне возможно, что временная экспрессия некоторых ранних UB генов не находится под контролем зависимых от Dicer miRNAs. Кроме того, не все ранние UB гены, чья экспрессия во времени регулируется с помощью Dicer-зависимых miRNAs усиливают свою активность , по крайней мере, в 1.5-раза у Dicer мутантов, вызывая комплекс изменений в UB эпителии в результате потери более сотни miRNAs, когда Dicer удаляется. В самом деле, экспрессия Sall4 и канонического Wnt считывают данные Lef1 и Axin2, которые экспрессируются только в раннем UB эпителии, и где они снижаются в Dicer мутантных UBs.

Наша in situ гибридизация 4-х случано отобранных ранних UB генов показала, что имеются два разных временных паттерна. В то время как экспрессия Cthrc1, Hapln1 и Lin28b в UB эпителии начинается, чтобы затем стать необнаружимой, начиная с E14.5, экспрессия Ptprz1 в UB только начинает обнаруживаться на ст. E11.5. Интересно, что Sall4 имеет временной паттерн экспрессии, сходный с таковым Ptprz1, он сильно экспрессируется в UB эпителии с E11.5, но очень слабо экспрессируется на ст. E12.5 и его экспрессия не обнаруживается на ст. E13.5 (Toyoda et al., 2013). Эти данные строго подтверждают, что регуляция временной экспрессии ранних UB генов сложная и, скорее всего, использует разные молекулярные игроки и механизмы.

ToppGene анализ использовался для сравнения генов на ст. E15.5 у Dicer UB мутантов, подавляемых в 1.5-раза или более по данным профилирования GUDMAP транскрипции из коллекции популяций WT почечных клеток разных стадий развития. Подавляемые транскрипты у Dicer мутантов обогащены для генов, экспрессирующихся на ст. E15.5 в медуллярных собирающих канальцах, единственные представители дифференцирующихся собиращих канальцев в GUDMAP базе данных. Следовательно, наш анализ всего транскриптома выявил четкий дефект в дифференцировке собирающих канальцев от UB предшественников при удалении Dicer.

Как же зависимые от Dicer miRNAs регулируют изменения судеб UB эпителиальных клеток и способствуют дифференцировке в собирающие канальцы? Обратная корреляция паттерна временной экспрессии let-7 семейства miRNAs и их предполагаемых ранних UB генов мишеней в норме и в Dicer мутантном UB эпителии согласуется с моделью, что let-7 miRNAs супрессируют экспрессию своих предполагаемых генов мишеней и потенциально некоторых др. ранних UB генов вторично в UB эпителии на более поздних стадиях развития (Fig. 6). Семейство let-7 miRNAs связано с прогрессией во времени развития и клеточной дифференцировкой у многоклеточных организмов и типах ткани (Bussing et al., 2008; Roush and Slack, 2008; Ambros, 2011; Sokol, 2012; Bao et al., 2013; Copley and Eaves, 2013; Meza-Sosa et al., 2014). В почках let-7 miRNA участвует в принятии выбора между самообновлением и дифференцировкой предшественников нефронов (Urbach et al.,2014). Возможно, что let-7 семейство miRNAs необходимо для собственно дифференцировки UB эпителия в собирающие канальцы, путем супрессии ранних UB генов на поздних стадиях развития, непосредственно и/или посредством let-7 miRNA генов мишеней (Fig. 6). Т.о., в отсутствие let-7 семейства miRNAs, как и в случае Dicer UB мутантов, экспрессия ранних UB генов не может быть репрессирована в UB эпителии на более поздних стадиях, тем самым поддерживается UB эпителий в раннем состоянии, которое препятствует дифференцировке собирающих канальцев. Кроме того, усиление экспрессии ранних UB генов, включая некоторые мишени для let-7, во время ранних стадий UB развития (Fig. 1; Table 4) может также мешать нормальному паттерну ветвления, как это наблюдается у Dicer мутантов (Figs. 2, 3), как и в случае конституитивной активации передачи сигналов Wnt/β-catenin в UB эпителии (Marose et al., 2008).



Figure 6. A summary and a model for let-7 family miRNA-regulated gene expression in UB epithelial cell fate changes promoting collecting duct differentiation. A: During UB epithelial development, the let-7 family of miRNAs exhibits a temporally regulated gene expression pattern which is inversely correlated with the temporal expression pattern of putative early UBlet-7 target genes. This temporal expression pattern of the let-7 family miRNAs and their targets is altered in the Dicer mutant UB epithelium, where the expression of the let-7 family miRNAs is disrupted, and the expression of early let-7 targets persists in the later stages of UB epithelial morphogenesis.B: During normal kidney development, the expression of early UB genes at early developmental stages defines the undifferentiated UB epithelium and inhibits the expression of late genes (collecting duct differentiation genes). At later developmental stages, the let-7 family miRNAs, directly or through their target genes, inhibit the expression of some of the early UB genes, thereby facilitating the expression of late genes in the UB epithelium, and this late gene expression defines the collecting duct fate.

Механизмы, которые поддерживают эпителиальные клетки уретрического зачатка в состоянии предшественников и которые способствуют им дифференцироваться в собирающие канальцы, изучены слабо. Heregulin из мезенхимы, как было установлено, способствует дифференцировке собирающих канальцев в культуре почек (Sakurai et al., 2005), а передача сигналов Wnt/β catenin в UB эпителии способствует и поддерживает его в состоянии предшественников (Marose et al., 2008). Наше исследование подтвердило, наличие и др. слоя регуляции, оперирующей на уровне miRNAs, участвующего в выборе судьбы клеток во время развития UB эпителия. Будущие работы установят роль let-7 семейства miRNAs в дифференцировке UB эпителия и молекулярные регуляторы, участвующие в этом процессе, что позволить в будущем понять механизмы, с помощью которых осуществляется переход UB эпителиальных клеток от состояния предшественников к дифференцированному состоянию.