Многослойная уротелиальная выстилка мочевого пузыря является высоко специализированным эпителием, который создает водонепроницаемый барьер для токсических метаболитов в моче. Дифференцированные поверхностные клетки выстилают поверхность уротелия и покрыты толстыми uroplakin бляшками (plaques), которые взаимодействуют, чтобы сформировать "asymmetric unit membrane" (AUM), эффективный барьер для проницаемости через клетки (Hicks, 1975; Hu et al., 2002; Min et al., 2003). Уникальные соединительные комплексы, расположенные в месте соприкосновения апикальной и латеральной мембраны, образуют зону присоединения между соседними клетками и ограничивают транспорт в промежутках между клетками (Acharya et al., 2004; Kreft et al., 2005; Khandelwal et al., 2009; Bryan and Tselepsis, 2010). После индуцированного с помощью UPEC повреждения уротелия функции барьера временно нарушается до тех пор, пока не сформируется новый, полностью дифференцированный поверхностный слой клеток (Wood et al., 2012; Shin et al., 2011). Пролиферация уротелиальных клеток может быть драматически усилена в отличие от обычного покойного состояния.

Имеются противоречивые доказательства относительно расположения клеток предшественников, отвечающих за восстановление уротелия после повреждения. Отсутствие специфических маркеров эпителиальных стволовых клеток делает затруднительной идентификацию клеток предшественников в эпителиальных тканях. Вплоть до недавнего времени было общепринятым, что гомеостатическое поддержание и репарация уротелия является результатом пролиферации K5-BCs с последующей дифференцировкой в поверхностные клетки. Доказательства, подтверждающие эту гипотезу получены в наблюдениях с использованием моделей повреждение-репарация, в которых- пролиферирующие уротелиальные клетки наблюдались преимущественно в базальном слое уротелия после повреждения (Romih et al., 2001; Messier and Leblond,1960; Mysorekar et al., 2009). Недавние исследования по картированию судеб, однако, показали, что слой промежуточных клеток содержит популяцию клеток предшественников, ответственных за восполнение слоя поверхностных клеток после повреждения (Gandhi et al., 2013).

Первоначальной целью исследования было сравнить и противопоставить паттерн пролиферации уротелия развивающегося мочевого пузыря, во время гомеостаза у взрослых и после повреждения уротелия у взрослых, чтобы определить, действительно ли повреждение уротелия пробуждает усиление пролиферативной активности K5-BC, наблюдаемой во время гомеостаза или в качественно отличающихся реакциях. Наш анализ пролиферации во время гомеостатических условий в нормальном мочевом пузыре взрослых согласуется с предыдущими доказательствами, что митотический индекс чрезвычайно низок и большая часть пролиферации происходит внутри K5-BCs (Romih et al., 2001; Messier and Leblond, 1960; Martin, 1972). После повреждения, однако, мы установили, что и K5-BCs и промежуточные клетки вносят вклад в регенерацию уротелия. Такое распределение пролиферативной активности совсем отлично от ограниченной пролиферации K5-BC клеток, наблюдаемой в нормальном мочевом пузыре взрослых, и воспроизводит пролиферативный паттерн, наблюдаемый во время раннего пренатального развития уротелия.

Удивительна пролиферативная реакция слоя промежуточных клеток приводит нас к гипотезе, что слой промежуточных клеток обладает популяцией клеток предшественников, которые поставляются в ответ на повреждения. Использовали методологию LRC в сочетании с клинически важной моделью индукции с помощью UPEC повреждений уротелия, использованной ранее для изучения картирования судеб Shin et al. (2011) и Gandhi et al. (2013). Мы установили, что клетки 5-BC слоя и клетки промежуточного слоя обладают популяцией медленно делящихся LRCs, которые обладают способностью пролиферировать в ответна диффузные повреждения уротелиальных клеток. Мы полагаем, что имеющаяся популяция клеток предшественников в промежуточном слое клеток позволяет уротелию быстро усилить пролиферацию, чтобы быстро восстановить образующий барьер слой поверхностных клеток.

Интересно, что наши результаты примиряют предыдущие конфликтующие доказательства относительно расположения LRCs в уротелии мочевого пузыря. Kurzrock et al. (2008) первоначально установили, что если клетки пролиферативного уротелия были мечены BrdU в 6 недельном возрасте, то LRCs обнаруживались исключительно в слое базальных клеток. Мы сделали сходное наблюдение, когда 2-недельные мыши получали BrdU. Однако использовался преимущественно LRC протокол с наворожёнными животными, чтобы метить клетки предшественники, которые делились во время развития ткани (Bickenbach and Chism, 1998; Duvilli? et al., 2003; Chan and Gargett,2006). Т.о., др. группа (Zhang et al., 2012) повторила эти исследования, используя 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) у новорожденных (P1) крыс. Хотя исследователи не специфицировали слои уротелия, внутри которых располагались LRCs, они сообщили, что LRCs были "случайно" распределены в уротелии взрослых крыс и подтвердили, что их результаты отличаются от предыдущего исследования, в котором "отмечалось преимущественно мечение уротелиальных базальных клеток." Эти находки сходны с нашими результатами, когда мыши получали BrdU на ст. P1. Тщательный анализ пролиферации уротелия в разное время развития привел к открытию, что расположение LRCs зависит от времени мечения в ходе развития.

Во время раннего пренатального развития, когда уротелий описывается как состоящий из трех слоёв (Erman et al., 2006), клетки быстро делятся во всех слоях уротелия. Это было обнаружено в предыдущих исследованиях (Castillo-Martin et al., 2010; Erman et al., 2001) и подтверждено в нашем исследовании. Пролиферирующие клетки обладают фенотипом или базальных или промежуточных клеток, как показывает позитивное или негативное окрашивание на Krt5 и отсутствие окрашивания на Krt20. Базируясь на недавней работе Gandhi et al. (2013), эти пролиферирующие клетки могут также содержать популяцию временных клеток предшественников Foxa2+/P63+/Shh+/Upk+/ Krt5- (P клетки), присутствующие только вовремя пренатального развития уротелия. С помощью пульсового мечения пролиферирующих клеток с помощью BrdU и отслеживания их у взрослых, мы установили, что многие из этих клеток инкорпорируются в и сохраняются в слое поверхностных клеток у взрослых. Мы подозреваем, что эти поверхностные LRCs окончательно дифференцированы, т.к. поверхностный слой клеток был сброшен после инокуляции в мочевой пузырь бактерий.

Как сообщалось ранее, мы установили, что пролиферация промежуточных клеток драматически снижается постнатально, при этом пролиферация ограничивается почти исключительно слоем клеток K5-BC после ст. P7 (Castillo-Martin, et al., 2010; Erman et al., 2001). Соотв., мы установили, что генерация LRCs во время постнатального развития следует этом паттерну. LRCs, сгенерированные на ст. P1, обнаруживались во всех слоях клеток уротелия взрослых, LRCs, сгенерированные на ст. P7, обнаруживались распределенными внутри K5-BC и промежуточного слоёв клеток у взрослых, а LRCs, сгенерированные на ст. P14, обнаруживались почти исключительно в слое клеток K5-BC у взрослых. Значение этих находок заключается в том, что онтогенез уротелия сложный, зависимый от времени процесс с разными популяциями клеток, пролиферирующими в разные моменты времени в ходе развития. Идентификация популяций клеток предшественников с помощью LRC методологии зависит от того, в какое время в ходе развития осуществлено мечение. Наши данные выявили уникальный временной онтогенез развития уротелия, в котором популяция клеток предшественников изменяется от пренатального к постнатальному периоду и от развития к взрослому состоянию.

BrdU мечение на ст. P7 демонстрирует, что LRCs, генерируемые в это время сохраняются в K5-BCs и промежуточном слоях клеток вплоть до 4. мес. возраста. Чтобы определить, были ли эти клетки окончательно дифференцированы в противовес митотически молчащим клеткам с пролиферативным потенциалом, мы отслеживали их судьбы после повреждений уротелия, вызванных бактериями. Мы установили, что субпопуляция LRCs внутри K5-BCs и промежуточных клеток пролиферирует в ответ на повреждение и что некоторые из этих клеток инкорпорируются во вновь развитый слой поверхностных клеток. Необходимо дальнейшее картирование судеб, чтобы определить: (1) действительно ли LRCs из K5-BC слоя, промежуточного слоя клеток или обоих инкорпорируются в слой поверхностных клеток; и (2) действительно ли LRCs представлены субпопуляцией медленно делящихся клеток предшественников со способностью к самообновлению.

Понимание расположения и функции клеток предшественников в уротелии мочевого пузыря имеет важное значение для понимания патогенеза хронических заболеваний уротелия у людей и для разработки новых регенеративных подходов к лечению у этой популяции пациентов. Результаты данного исследования закладывают основу для будущих исследований, нацеленных на идентификацию биомаркеров этой популяции клеток предшественников и факторов, которые позволят субпопуляции клеток сохранять способность к пролиферации и дифференцировке.

Итак, мы продемонстрировали, что регенерация уротелия после диффузных повреждений воспроизводит паттерн, характерный для развития уротелия, базирующийся на мощной пролиферации K5-BCs и промежуточных клеток. Метку содержащие клетки присутствуют в K5-BC и промежуточном слоях клеток в ответ на индуцированные бактериями повреждения и инкорпорируются во вновь образуемый поверхностный слой. Наши данные подтверждают, что и K5-BC и промежуточный слои клеток содержат популяции клеток предшественников, которые вносят вклад в регенерацию уротелия после повреждения.