Посещений:
CRISPR технологии



Регуляторы транскрипции и эпигенетические регуляторы

Next stop for the CRISPR revolution: RNA-guided epigenetic regulators
• Suhani Vora, Marcelle Tuttle,Jenny Cheng, George Church
The FEBS J. Volume 283, Issue 17 September 2016 Pages 3181–3193

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) proteins offer a breakthrough platform for cheap, programmable, and effective sequence-specific DNA targeting. The CRISPR-Cas system is naturally equipped for targeted DNA cutting through its native nuclease activity. As such, groups researching a broad spectrum of biological organisms have quickly adopted the technology with groundbreaking applications to genomic sequence editing in over 20 different species. However, the biological code of life is not only encoded in genetics but also in epigenetics as well. While genetic sequence editing is a powerful ability, we must also be able to edit and regulate transcriptional and epigenetic code. Taking inspiration from work on earlier sequence-specific targeting technologies such as zinc fingers (ZFs) and transcription activator-like effectors (TALEs), researchers quickly expanded the CRISPR-Cas toolbox to include transcriptional activation, repression, and epigenetic modification. In this review, we highlight advances that extend the CRISPR-Cas toolkit for transcriptional and epigenetic regulation

Antonia A. Dominguez, Wendell A. Lim & Lei S. Qi Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation// Nature Reviews Molecular Cell Biology 17,5-15 (2016)

The bacterial CRISPR-Cas9 system has emerged as a multifunctional platform for sequence-specific regulation of gene expression. This Review describes the development of technologies based on nuclease-deactivated Cas9, termed dCas9, for RNA-guided genomic transcription regulation, both by repression through CRISPR interference (CRISPRi) and by activation through CRISPR activation (CRISPRa). We highlight different uses in diverse organisms, including bacterial and eukaryotic cells, and summarize current applications of harnessing CRISPR-dCas9 for multiplexed, inducible gene regulation, genome-wide screens and cell fate engineering. We also provide a perspective on future developments of the technology and its applications in biomedical research and clinical studies.


Introduction: CRISPR-associated protein 9, the catalyst


Эпигенетика определяет какая часть генома открыта или закрыта для экспрессии. Многие фундаментальные биологические феномены регулируются с помощью транскрипции и эпигенетики скорее, чем на генетическом уровне. Напр., эпигенетика регулирует развитие организмов, позволяя небольшому количеству изогенных эмбриональных стволовых клеток делиться, дифференцироваться и специализироваться в различные ткани, составляющие тело человека. Инструменты, чтобы контролировать экспрессию генов и манипулировать с эпигенетическими маркерами, делают возможными передовые разработки этих процессов. Способность манипулировать с транскрипцией и с эпигенетическими состояниями по потребности станет открытой дверью к управлению дифференцировкой плюрипотентных стволовых клеток в специализированные типы тканей, чтобы установить причинно-следственные взаимоотношения между состоянием экспрессии и фенотипом и чтобы корретировать болезненные фенотипические отклонения на эпигенетическом уровне.
Многочисленные zinc fingers (ZFs) и transcriptional activator-like effectors (TALEs) были слиты с эффекторными доменами, чтобы запрограммировано находить мишень, м активировать, репрессировать или эпигенетически модифицировать эндогенные гены, закладывая основы для точной регулировки эпигенетического состояния [1-8]. К сожалению, неэффективная продукция средств доставки мешает распространенному использованию этих инструментов [1].
Недавно открытая, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas система предоставляет собой квантовый скачок к программируемому ДНК-связывающему инструменту. В природе, CRISPR-Cas система служит в качестве древнейшей и бактериальной иммунной системы [12-17]. Хотя было открыто 5 разных типов CRISPR-Cas систем к настоящему времени, типа II система используется почти исключительно благодаря небольшому количеству компонентов, необходимых для ДНК таргетинга [18]. Программируемый ДНК таргетинг с помощью типа II CRISPR-Cas системы нуждается только в трех компонентах: CRISPR-associated protein 9 (Cas9) нуклеазе, CRISPR РНК (crRNA) и в трансактивирующей crRNA (tracrRNA) [19-22].
Чтобы инициировать запрограммированное целенаправленное воздействие на ДНК (targeting), Cas9 соединяется с crRNA и tracrRNA в РНК-дуплекс. Первые 20 нуклеотидов в crRNA наводят Cas9, чтобы расщепить какую-либо комплементарную геномную последовательность, расположенную вблизи короткого protospacer adjacent motif (PAM) [23, 24]. Соответствующее слияние crRNA и tracrRNA дает химерную одиночную гид-РНК (single guide RNA (sgRNA)), которая достаточна, чтобы также нацеливать Cas9 [19].
Сиквенс-специфическая sgRNA конструируется быстро и легко [25], и осуществляется масштабное копирование, чтобы получить десятки тысяч sgRNA с помощью несложного процесса. Сегодня библиотека sgRNA целенаправленно находящих любой белок-кодирующий локус в геноме человека может быть сконструирована с помощью базирующегося на чипе синтеза олигонуклеотидов за приблизительно 5000 долларов в течение нескольких недель [25-27]. В качестве таковых два компонента Cas9 и sgRNA системы были приспособлены в качестве стандартного инструмента редактирования генома для широкого круга организмов [19, 28, 29].
Вследствие широко распространенной адаптации Cas9 в качестве программируемого инструмента для геномного редактирования, несколько групп, включая нашу собственную, мутировали остатки, используемые для расщепления ДНК, расположенные внутри каждого из двух нуклеазных доменов Cas9 [19, 30]. Мутации этих каталитических остатков сгенерировали с нулевой нуклеазной активностью 'dead' Cas9 (dCas9) вариант, потерявший свою способность расщеплять ДНК, сохранив при этом способность соединяться с ДНК сиквенс-специфическим способом. Слияние dCas9 белка с эффекторными доменами, такими как факторы, усиливающие транскрипцию, репрессорами и эпигенетическими модуляторами, сделало беспрецендентно легкими манипуляции с транскриптомом и эпигеномом эукариот.

Repurposing Cas9 as a genetic Swiss Army knife


Вскоре после инициальных исследований, продемонстрировавших простоту и эффективность базирующегося на Cas9 геномного редактирования в клеточных линиях человека [20-22], несколько групп расширили Cas9 платформу с помощью РНК-гида геномного редактирования, чтобы включить активацию, репрессию и эпигенетические модификации - чтобы создать швейцарский армейский нож.

Evolution of robust second-generation Cas9-based activators


First-generation activators


Чтобы сделать возможной регуляцию эукариотического генома, прежде созданные транскрипционные активаторы были слиты с dCas9 ортологом из бактерий Streptococcus pyogenes (dSpCas9). Первоначальные исследования, описавшие слияние dSpCas9 с широко используемым VP64 активатором (4 тандемных повтора из вирусного herpes simplex белка 16, VP16), чтобы создать первое поколение dSpCas9-VP64 активатор (Fig. 1A). К сожалению, когда целенаправленно воздействовали на промоторы эндогенных генов, чтобы индуцировать экспрессию генов, то уровень индукции гена был очень умеренным и ниже, чем у эквивалентов базирующихся на TALE активаторов [5, 30-33]. Ряд этих исследований [30-32] показал настоятельную необходимость в множественном наведении, чтобы активировать интересующие гены, продемонстрировав дополнительные и синергичные эффекты активации генов с 10 гидами.

Figure 1. Timeline of Cas9 activator tool development. Representations of various Cas9 repressors ordered by publication date. (A) First generation of Cas9 activator engineered by fusing dCas9 with the VP64 activator, (four repeats of a fragment from herpes simplex virus protein 16, VP16). (B) Enhanced activators such as dCas9-VP160 use additional repeats of VP16 to achieve higher activation. (C) Second generation of Cas9 activators started with the SunCas9 tool. The method used a peptide array of epitopes to recruit multiple scFv-VP64 fusions. (D) The SAM system modified the sgRNA to include MS2 RNA aptamers that recruits MCP fused with p65 and HSF1 (heat shock factor 1). The recruited fusions induce high levels of expression. (E) dCas9-VPR is an alternative synergistic activator which consists of dCas9 fused to activators VP64, p65, and RTA. The three activators work together to increase activation. (F) Epigenetic effectors such as the fusion of dCas9 to p300 core acetylates H3K27 to activate gene expression when targeted toward promoters, proximal enhancers, and distal enhancers.

Однако, многие применения таких инструментов вирусной доставки in vivo и базирующиеся на библиотеках методы скрининга помогли существенно в осуществлении компактности и простоты использования одиночного гида на мишень. Поэтому стало императивом строить более сильные, более мощные активаторы, чтобы активировать гены, используя только одного гида.

Enhanced activators


Ключ к построению улучшенных активаторов покоится на наблюдении, что множественные домены слабых активаторов, сконцентрированных на одиночном локусе, значительно увеличивают уровень достигаемой экспрессии гена. Приняв во внимание преимущества этого наблюдения, многие группы стали сливать большие количества VP16 белковых повторов непосредственно с dCas9. Появились множественные усиливающие активаторные элементы, включая dSpCas9-VP160 (10 повторов VP16) [34], dSpCas9-VP192 (12 повторов VP16) [35] и VP64-dSpCas9-BFP-VP64 (4 повтора VP16 на N конце dSpCas9, и голубой флюоресцентный белок + более 4-х повторов VP16 на C конце) [36] (Fig. 1B).
Каждая технология создает высокую локальную концентрацию активационных доменов путем прямого навешивания их на dCas9, т.к. в противовес множественным гидам она сводит отдельные слабые активаторы вместе. Посредством этой стратегии, эти группы успешно уменьшили среднее количество гидов, необходимых, чтобы индуцировать сильную экспрессию генов.

Second-generation activators


Второго поколения активаторные инструменты позволили разработать несколько новых методов усиления потенции. Три параллельных метода включают: привлечение факторов активации в транс-положение относительно каркаса Cas9, чтобы избежать экспрессии длинных участков из повторяющихся белков, инсерция белок-связывающих RNA-aptamer шпилек в sgRNA, чтобы облегчить рекрутирование активатора в транс-положение, и использование гетерогенных активаторных доменов, чтобы более эффективно рекрутировать аппарат транскрипции.
Биологические сигналы часто умножаются за счет рекрутирования множественных эффекторных белков на место действия. SUperNova tagging (SunTag) система использует 10 повторов короткого эпитопа тэга, слитого непосредственно с dCas9 (SunCas9), что делает возможной экспрессию в транс положении и привлечение 10 одиночных цепочек вариабельных фрагментов (scFvs) , слитых с VP64 [37] (Fig. 1C). Как результат, одиночный гид способен индуцировать сильную экспрессию гена, активируя гены до 45х с помощью SunCas9 системы. Важно отметить, что показатели 'fold-activation' несовершенны, чтобы определить настоящий потенциал инструмента, т.к. способность активировать ген зависит от факторов, включая исходный уровень экспрессии гена и клеточной линии [38]. Следовательно, настоящие показатели потенциала относительной эффективности сравнимы с активатором золотого стандарта, dSpCas9-VP64. Демонстрация относительной эффективности SunCas9, обнаруживает 3х и 45х улучшение над dSpCas9-VP64, когда осуществляется целенаправленное воздействие на пару эндогенных генов, соотв. Параллельное исследование открыло фундаментальное правило о помещении SunCas9 sgRNA, при этом наиболее эффективные гиды для активации оптимально располагались между -400 и -50 парами оснований (bp) выше сайта старта транскрипции (transcriptional start site (TSS)) [39]. Альтернативно, стратегии, базирующиеся на РНК-аптамере, также были использованы для рекрутирования активаторов на sgRNA [30, 40, 41]. В самых ранних примерах стратегии, базирующейся на рекрутировании sgRNA, РНК шпильки от male-specific bacteriophage-2 (MS2) повторно сливались с 3' концом sgRNA. В тандеме, MS2 coat protein (MCP), который соединяется с каждой MS2 шпилькой как гомодимер, был слит с VP64 активирующим доменом. Когда модифицированный гид, MCP-VP64 слитый белок и dSpCas9 экспрессировались совместно, то Cas9 связывал декорированную sgRNA, которая в свою очередь рекрутировала MCP-VP64, чтобы активировать экспрессию намеченного гена [30].
Прогрессивная стратегия, базирующаяся на рекрутировании sgRNA, связана с системой synergistic activation mediator (SAM), инкорпорирующей две MS2 шпильки в предоставленные для экспозиции петли внутри sgRNA и слитый MCP в новый химерный активатор p65-HSF1 (p65 - это субъединица повсеместного комплекса транскрипционных факторов NF-kB, а HSF1 хитшоковый фактор 1, ответственный за транскрипцию генов в ответ на тепературный стресс). Химерные MCP-p65-HSF1 активаторы связывают каждую MS2 шпильку как набор гомодимеров, приводя в результате к 4-м копиям MCP-p65-HSF1, образующим каркас на SAM sgRNA, связанной с dSpCas9-VP64 (Fig. 1D) [40]. С помощью этой успешной стратегии рекрутирования одиночные гиды, как было установлено, успешно индуцируют высокие уровни экспрессии, при этом в среднем обнаруживалось 105х кратное увеличение по сравнению с активатором золотого стандарта dSpCas9-VP64. Подобно SunCas9 системе, оптимальный промежуток целенаправленного воздействия dSpCas9 SAM активатора находился между -200 и +1 bp относительно TSS.
В упрощенной, но всё ещё мощной системе, три отдельных домена активации были слиты тандемно непосредственно с dSpCas9. В природе активация транскрипции происходит с помощью множественных активирующих транскрипцию факторов, соединяющихся с промотором и энхансерами, окружающими ген, которые в свою очередь передают сигналы медиаторному комплексу, чтобы облегчить с помощью RNA polymerase II инициацию и элонгацию транскрипции. За счет использования набора из трех отличающихся трансактивационных доменов, VP64, p65 и Rta, каждый, как полагают, инициирует независимые контакты с медиатором, dSpCas9-VP64-p65-Rta (dSpCas9-VPR) система, как было установлено, работает в 20- 300 раз лучше, чем инструмент золотого стандарта dSpCas9-VP64 с четырьмя гидами [38] (Fig. 1E).

Epigenetic activator


Помимо базирующейся на транскрипции активации экспрессии генов, получен инструмент Cas9-обеспечиваемого редактирования эпигенома, чтобы устанавливать активирующие метки. Каталитический histone acetyltransferase (HAT) стержневой домен человеческого E1A-ассоциированного белка p300 был слит с Cas9, чтобы катализировать добавление метки H3K27 ацетилирования, что делает возможной активацию экспрессии гена, если целенаправленно воздействует на промоторы, проксимальные энхансеры и дистальные энхансеры (Fig. 1F) [42]. dSpCas9-p300 стержневое слияние, как было продемонстрировано, является в 6 раз более мощным, чем активатор золотого стандарта dSpCas9-VP64, когда нацелен на промоторные регионы. Кроме того, dSpCas9-p300 вызывает в 5 до 270 раз более высокую экспрессию нижестоящих генов в locus control region (LCR) локуса B-globin человека, путем непосредственного ацетилирования дистальных энхансерных регионов. Будучи связанным с этими же самыми регионами, dSpCas9-VP64 оказывается неспособным влиять на транскрипцию, подчеркивает различие механизма активации, контролируемое эпигенетическим регулятором.

Development of first-generation Cas9 repressors


Introduction of CRISPR interference


В дополнение к использованию Cas9 также оказался пригоден для репрессии экспрессии генов у Escherichia coli и в клетках человека. Система, состоящая из dCas9 белка и sgRNA, была обозначена как CRISPR interference (CRISPRi). CRISPRi может замалчивать как инициацию транскрипции, так и элонгацию путем целенаправленного воздействия на -35 box промотора (только у бактерий) или на нижестоящие регионы самого гена (Fig. 2A) [43]. Несколько ключевых наблюдений было сделано в этом плодотворном исследовании: расположение sgRNA вдоль промотора или гена является критическим для эффективности и может контролировать исход транскрипции, использование множественных sgRNA делает возможным комбинаторное усиление регуляторного эффекта, а объединенные (multiplexed) гиды может быть использованы для облегчения репрессии многочисленных генов одновременно. Поскольку репрессивный эффект в этом исследовании был довольно драматичным в отношении репрессии бактериальных генов, только умеренное в 1.9 - 2.7 раза снижение экспрессии наблюдалось в желаемых генах клеток человека.

Figure 2. Timeline of Cas9 repressor tool development. Representations of various Cas9 repressors ordered by publication date. (A) CRISPRi consists of dCas9 (a nuclease-null Cas9) and an sgRNA. By targeting regions downstream of the TSS of a gene, CRISPRi can interfere with transcription to block gene expression. (B) dCas9-KRAB is a fusion of dCas9 and KRAB (Kruppel-associated box) which recruits chromatin modifying complexes to more efficiently silence transcription. (C) Epigenetic repressor, dNm-Cas9 fused to LSD1, silences genes by removing activating H3K4 methylation marks.



Stronger epigenetic repressors


В последующих исследованиях предприняты попытки улучшить репрессивный эффект CRISPRi в клетках человека путем слияния из Kruppel-associated box (KRAB) домена Kox1 с dCas9, чтобы рекрутировать хроматин модифицирующие комплексы и более эффективно замалчивать транскрипцию [33] (Fig. 2B). Слияние продемонстрировало 15-кратную репрессию интегрированного GFP репортера в HEK293T клетках, при этом dSpCas9-KRAB прекрасно интегрировались.
Геномная интеграция репрессора и гида облегчала долговременное молчание, при этом обнаружимой экспрессии GFP не обнаруживалось в 95% популяций после 14 дней. Однако, временная экспрессия репрессора не обнаруживалась, вызывая пробел в нашем понимании 'epigenetic' способности репрессора. Поскольку термин 'epigenetic' традиционно обозначает наследуемую, стабильную интеграцию репрессора, то это только подтверждает способность регулировать транскрипцию, поскольку инструмент активно экспрессируется в линии клеток мишеней. Данные по временной экспрессии должны прояснить, действительно ли репрессивные эпигенетические метки, вносимые с помощью dCas9-KRAB, устойчиво сохраняются и, следовательно, способны поддерживать долговременное транскрипционное молчание после того, как репрессор был удален. Исследование показало строгую корреляцию между dCas9 и базирующейся на dCas9-KRAB репрессией, показывая, что сила этого события связывания может быть лимитирующим фактором для всех обеспечиваемых CRISPRi репрессий.
В др. подходе 4 копии mSin3 домена (наз. SID4X) были слиты тандемно с каркасом dCas9 и было показано, что они репрессируют эндогенный ген SOX2 в клетках HEK293T более, чем в 2 раза, тогда как dCas9 не обнаруживал эффекта [4]. Большинство эндогенных мишеней, однако, д. быть протестировано с этим репрессором, чтобы определить его относительную эффективность и его эффективность по сравнению с уровнем слитого dSpCas9-KRAB. Однако, более сильные репрессоры, чем dSpCas9-KRAB слияние, скорее всего, будут найдены. Стратегии, использованные для обновления активатора безусловно приложимы к репрессорам; вообще-то dCas9 слияние с серией KRAB доменов или комбинация репрессивных доменов д. привести к более сильной репрессии.
Поскольку инструмент dSpCas9-KRAB базируется на локальной гетерохраматинизации [44], чтобы замалчивать экспрессию, альтернативные домены замалчивания генов - специфические энхансеры путем удаления специфических активирующих эпигенетических меток. Гистоновая деметилаза LSD1, слитая с небольшим ортологом dCas9 от Neisseria meningitis (dNmCas9), удаляет H3K4 активирующие метки метилирования, приводя к выходу из эксплуатации энхансера и к репрессии гена [45] (Fig. 2C). Работая специфически путем инактивации энхансера в противовес общей гетерохроматинизации, этот инструмент предоставляет новый уровень эпигенетического точного контроля состояния транскрипции.

Perspective on the emergence of Cas9 epigenetic modifiers


Несмотря на успехи, достигнутые с помощью Cas9-based гистоновых модификаторов, не получено общей ДНК-модифицирующей деметилазы или метилтрансферазных эффектов с Cas9. Такие слияния работают, если слиты с TALEs, как в случае с TALE-Tet1 dioxygenase (обеспечивающей ключевую ступень деметилироания) и TALE-DNMTs (DNA метилтрансфераз) [7, 8]. Разработка таких инструментов является критической ступенью для расширения нашего Cas9 регуляторного инструментария.

Newly minted multi-mode Cas9 regulators


Недавно созданные инструменты делают возможной одновременную активацию и репрессию многих генов мишеней, используя одиночный белок Cas9 [41, 46, 47]. Два исследования описывают метод базирующийся на укороченных sgRNA, приводящий к конкурентной активации, репрессии и рассечению [46, 47]. Ранее было установлено, что mismatch-содержащие гиды делают возможным связывание, но предупреждают разрезание [48]. Это обусловлено конформационными изменениями Cas9. Если имеются приблизительно 6 или более несоответствий (mismatches) на 5' конце sgRNA, то Cas9 всё ещё может соединяться с сайтом мишенью, но не превращает его в активную конформацию, пригодную для разрезания мишени [49].
Сходным образом, sgRNA с укороченными нацеливающими (targeting) последовательностями из 14nt вместо 20nt устраняет способность Cas9 к разрезанию ДНК, хотя всё ещё позволяет соединяться с Cas9 дикого типа. Как результат она может добиваться активации, репрессии и мутаций во многих генах мишенях благодаря разворачиванию sgRNA разной длины для каждого сайта мишени. Напр., она может приводить в действие слитые дикого типа Cas9 с активатором, а в 14-nt укороченный гид целенаправленно воздействует на промотор гена, чтобы активировать экспрессию без разрезания. Одновременно, можно вызывать слияние нижестоящих TSS с укороченной sgRNA, позволяя такому слиянию действовать как заграждение для считывания с помощью RNA polymerase II без разрезания. Наконец, можно осуществить слияние с любым сайтом полной длины sgRNA, делая возможным разрезание. Это было продемонстрировано в работе с nuclease-positive SpCas9-VPR и с демонтированной версией SAM системы, использующей SpCas9 без VP64. Многообещающее использование этих инструментов расширило уже существующие дикого типа Cas9 мышиные модели [50, 51] и затруднило генерацию Cas9 клеточных линий со способностью приводить в действие активацию и репрессию транскрипции.

Major concerns


С наплывом инструментов для геномных пертурбаций для научного сообщества возникли проблемы. Основные проблемы связаны с относительным потенциалом каждого инструмента при сравнении один с др. или в различных контекстах хроматина, с потенциальными не целевыми эффектами, вызываемыми неспецифическим связыванием Cas9 и со способностью доставлять гены, кодирующие эти инструменты, с помощью обычно используемых вирусных векторов.

Strength


Хотя регуляторные инструменты были разработаны мощными и изощренными, слои контекстуальных факторов покрыли саваном действительную эффективность этих инструментов. Исследования, детализирующие разработку этих инструментов, использовали широкий набор тестовых клеточных линий, генов, sgRNA, и методов доставки, которые не могут быть сравнены. Чтобы эффективно применять эти инструменты с наилучшей отдачей, мы д. понять клеточные, геномные и позиционные контексты, в которых каждый из активаторов, репрессоров работает наилучшим образом. Напр., два недавних исследования выявили негативный эффект упакованного хроматина на способность Cas9 соединяться со специфическими геномными локусами [52, 53]. Дополнительные исследования эффектов упаковки хроматина на второе поколение Cas9 активаторов, а также эпигенетических репрессоров, д. облегчить понимание оптимальных условий, в которых используются эти эффекторы, и как наилучшие создаваемые инструменты будут преодолевать такие барьеры (такие как использование гистоновых модификаторов в комбинации с традиционными активаторами транскрипции). Более того, систематическое сравнение доступных инструментов д.б. особенно благоприятным в данное время, т.к. существует огромное перекрывание, приводящее к неясности, какой инструмент может быть приспособлен к данной определенной задаче или контексту [54].

Specificity


Хотя off-target мутации могут появляться по всему геному [30, 55], off-target активация или репрессия транскрипции могут возникать лишь в небольшой фракции генома [39, 53]. Гид off-target может лишь случайным образом навести Cas9 приземление в 1000-bp регион, окружающий TSS гена, чтобы индуцировать или репрессировать транскрипцию. Однако, многие исследователи используют опубликованные off-target guide-scoring алгоритмы, чтобы разработать 'specific guides', когда используют Cas9 для пертурбаций транскрипции [55-58]. Наиболее специфические гиды вряд ли наиболее мощные [57]. Небольшие промежутки для целенаправленного воздействия инструментов, регулирующих транскрипцию, не предоставляют возможности действовать большому количеству гидов, которые помогли бы делать мощный и 'специфический' выбор. Следовательно, отторжение гидов в пользу усиления 'специфичности' может в конечном итоге оказаться непригодным для использования этих инструментов, хотя ясно, что отторгаемые гиды действительно вызывают настоящие off-target транскрипционные эффекты. Было бы более приемлемо, если бы guide-scoring алгоритмы были модифицированы так, чтобы различать между активностями, сцепленными с разрезанием, связыванием, при определении, будет ли гид приводить к off-target эффекту.

Delivery


Для доставки в соматические ткани у взрослых модельных животных adeno-associated virus (AAV) особенно привлекателен. AAV вектора обладают относительно низкой иммуногенностью, минимальным риском интеграции в геном хозяина и широким спектром ткане-специфических серотипов [59-61]. К сожалению, полезная нагрузка для AAV составляет приблизительно 4.5 kb, тогда как SpCas9 длиной в 4.2 kb, оставляет достаточно пространства для малых регуляторных элементов и требует использования дополнительного вектора для доставки sgRNA экспрессионной кассеты [62]. Идеально было бы, чтобы второго поколения активаторы, репрессоры и эпигенетические эффекторы также доставлялись для in vivo пертурбаций экспрессии генов. Эта цель более трудная, чем доставка только Cas9, из-за необходимого дополнительного пространства для регуляторных эффекторов. Необходимо, чтобы более мелкие ортологи, такие как в 3.2 kb SaCas9 и St1Cas9 ортологи, включались при построении инструментов транскрипционных и эпигенетических эффекторов, чтобы сделать возможной адаптацию для применения in vivo [51, 63]. Наконец, любая система с раздельным управлением д. быть разработана (с регуляторными частями распределенными между несколькими AAVs, и совместно доставляться для сборки in vivo) или необходимы минималистские решения для разработки компактных одиночных векторных систем.

Current and future applications


Были использованы регуляторы для деконструкции генетических сетей, которые обеспечивают устойчивость фенотипов, обеспечивают клеточную дифференцировку путем активации эндогенных генов, активируют латентные HIV геномы, чтобы улучшить эффективность противо-ретровирусной терапии и индуцировать морфологические фенотипические отклонения in vivo.

Screening for resistance phenotypes


Богатое разнообразие эпигенетических регуляторных инструментов с привлечением Cas9, в комбинации с экономной продукцией коротких олигонуклеотидов, чтобы синтезировать десятки тысяч sgRNA, благоприятствуют скорости и глубине проведения на геномной шкале функционального скрининга. Поскольку скрининг на геномной шкале нуждается в ручном труде и времени, то величина данных и потенциал ответов на важные биологические вопросы являются соблазнительными для исследователей.
Кстати, только три геномных скрининга были опубликованы с Cas9 активаторами и репрессорами, два из которых были проведены как части одного и того же исследования [39, 40]. Первоначальные два скрининга были проведены с dCas9-KRAB репрессором и с dCas9-SunTag активатором. Скрининги включали потерю функции (CRISPRi) для генов, которые обеспечивали чувствительность к холерно-дифтерийному слитому токсину, и скрининг на избыточность функции [CRISPR activation (CRISPRa)] для генов, которые отвечали за резистентность к тому же самому токсину. Эти скрининги продемонстрировали ключевое преимущество Cas9-based скрининга. Чтобы по-настоящему понять генетические сети, необходимо понять эффекты как усиления, так и подавления каждого специфического гена. Cas9 транскрипционная технология позволяет нам легко исследовать обе функции, тем самым понять сети регуляторных генов на глубоком уровне. Хотя информация от этих скринингов нуждается в конструктивном разделении библиотек для CRISPRa и CRISPRi скринингов, обеспечиваемых разными позициями gRNA, что необходимо для максимального эффекта.

Cellular differentiation


Ранние исследования продемонстрировали потенциал dSpCas9-VP64 активаторов по активации онтогенетически значимых генов, таких как SOX17 для управляемой дифференцировки в энтодермальный клон, и OCT4 для непосредственного репрограммирования соматических клеток в плюрипотентное состояние [64, 65]. К сожалению, первого поколения dSpCas9-VP64 инструмент был лишен необходимой потенции, чтобы индуцировать высокие уровни экспрессии регуляторного фактора и запускать репрограммирование клеток [36, 38, 65]. Тогда как результат улучшенных и второго поколения активаторов, предоставил первые примеры CRISPR-Cas9 обеспечиваемого репрограммирования и дифференцировки клеток. Когда целенаправленно воздействовали на Myod1 в фибробластах мыши, то улучшенный VP64-dSpCas9-BFP-VP64 активатор направлял клеточное репрограммирование в миоциты [36]. Кроме того, наша группа использовала второго поколения dSpCas9-VPR активатор для активации главных регуляторов нейрональных клонов NEUROD1 и NEUROG2 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs,) и дифференцировки их в клетки нейронов.
Поскольку улучшенные активаторы делают возможным вполне пригодное клеточное репрограммирование путем индукции главных транскрипционных факторов, в действительности большинство протоколов репрограммирования нуждаются в экспрессии множественных генов. Мультиплексная активаци генов д. быть идеальной для репрограммирования. Однако, большинство генов непослушно базирующейся на Cas9 активаторе индукции, делая процесс использования инструментов наугад. Как упоминалось, основной проблемой для этих инструментов является необходимость четкого понимания, почему активаторы работаю хорошо в определенном геномном контексте и противоположны в других, необходимо создание инструментов, которые универсально подходили бы для регуляции транскрипции.

Human therapeutics


Особое возбуждение в связи с Cas9 было связано с его предсказуемой ролью в быстрой и эффективной разработке генной терапии. Однако, в отличие от Cas9-based стратегий, которые базируются на нуклеазной активности, Cas9 транскрипционные регуляторы добавили преимущества, которые связаны с незначительным риском внесения мутаций в геном хозяина, предоставляя тем самым получение потенциально обратимых, кратковременных или долговременных эпигенетических модификаций.
Несмотря на огромный потенциал для терапевтического применения Cas9 регуляторов, очень немного исследований опубликовано по этому вопросу. Пример возможного терапевтического применения включает использование в качестве вспомогательного средства для анти-ретровирусной терапии при лечении HIV [66, 67]. Современные анти-ретровирусные режимы предупреждают распространение вирусной инфекции с помощью целенаправленного воздействия на энзимы, необходимые HIV для завершения его жизненного цикла проникновения, интеграции, сборки и почкования. Однако, фракция интегрированных вирусов остается транскрипционно молчащей в геноме хозяина, уклоняясь от целенаправленного воздействия как анти-ретровирусных лекарств, так и иммунной системы. Попытки дозированного воздействия химических ингибиторов эпигенетических факторов, чтобы предупредить молчание потенциально широко распространенных побочных эффектов на остальной геном, и оказалось в целом довольно неэффективным в клинических испытаниях. В альтернативной стратегии, программируемые Cas9 активаторы были использованы для специфически индуцируемой экспрессии латентного HIV генома [66, 67]. Активация молчащих HIV геномов может позволить использование давно разыскиваемой целебной терапии в клетках, обладающих латентными ретровирусами латентных геномов, форсируя экспрессию вирусных генов у них присутствующих, делая их затем чувствительными к анти-ретровирусным лекарствам и позволяя очиститься с помощью иммунной системы.
Более того, использование Cas9-based транскрипционных эффекторов делает возможным быстрый скрининг регуляторных элементов, которые могут быть подвергнуты целенаправленному воздействию для высоко специфической активации латентных HIV-1 вирусных геномов, и тем самым создается многообещающий подход на молекулярной биологии базирующаяся анти-ретровирусная стратегия [66, 67].
Помимо такого использования ни коем случае не был предложен подход, базирующийся на Cas9 регуляторах, терапевтического использования. Тем не менее некоторые приложения, такие как активация терапевтических генов, противораковых генов и генов гаплонедостаточности или репрессии онкогенов, генов, обеспечивающих устойчивость к противораковым лекарствам и доминантно негативным генам, все они давали улучшения от применения этих инструментов. Все они могут подвергаться целенаправленному воздействию без необходимости поиска низко-молекулярных лекарств и без проблем распространенных побочных эффектов.

In vivo applications


Пока только одно применение Cas9-based регуляции было произведено, чтобы индуцировать фенотипические изменения in vivo. dSpCas9-VPR активатор был применен для активации гена Wingless у Drosophila, изменяя структуру развития крыловых дисков у личинок [68]. Имеются многообещающие новые пути для исследований. Недавно создан Cas9 мыши [50]; учитывая способность модифицированной SAM системы, чтобы проводить в действие редактирование, активацию и репрессию генома, с помощью дикого типа Cas9, очень возможно, что эти мыши будут использованы для проведения исследований по регуляции транскрипции [46, 50]. Дополнительные подходы in vivo ожидаются вскорости.

Future application: screening for long noncoding RNA


Только 1% генома млекопитающих обладает белок-кодирующим потенциалом, тогда как 70-90% транскрибируется в определенные моменты развития, продуцируя крупный и неизведанный транскриптом длинных некодирующих РНК (lncRNA) [69]. Многие lncRNA, как полагают, выполняют цис-регуляторные роли, такие как рекрутирование Polycomb репрессивных комплексов или антисмысловую регуляцию соседних генов [69]. Избыточная экспрессия lncRNA с обычных экзогенных cDNA-based векторов не способна воспроизвести потенциал цис-регуляторных биологических функций, прирожденно кодируемых с помощью физической локализации экспрессии внутри хроматина.
Cas9-based эпигенетические регуляторы, однако, преодолевают это узкое горлышко путем изменения экспрессии непосредственно с нативного локуса генов мишеней. TТ.о., с установлением, что lncRNA являются столь же важными, как и белок кодирующие гены в геноме человека [70], стали необходимыми Cas9-based эпигенетические регуляторы, чтобы приводить в смятение в скринингах избыточной функции и потери функции, чтобы открыть полный диапазон регуляторных функций, выполняемых этими плохо изученными генами.

Future application: transcriptional and epigenetic gene therapy


Имеется несколько болезней, которые существенно поддерживают преимущества Cas9 транскрипционных регуляторов. Болезни такие как Prader-Willi и Angelman Syndrome вызываются патогенетическими делециями одного из родительских аллелей, тогда как др. полностью функциональный аллель молчит из-за геномного импринтинга (процесс, с помощью которого определенные аллели замалчиваются, зависит от того от какого родителя он унаследован). В этих случаях возможно, что Cas9-based активаторы могут активировать экспрессию с молчащего аллеля, осуществляя экспрессию с полностью интактной копии отсутствующего гена.
Сходным образом, многие моногенные болезни может быть излечены посредством умеренной избыточной экспрессии компенсаторных генов. Напр., Duchenne muscular dystrophy (DMD) является X-сцепленной болезнью, вызываемой мутациями в белке дистрофина. Патогенные мутации нарушают белок дистрофина, который ответственен за закрепления клеточного актинового цитоскелета на внеклеточном матриксе в мышцах. Поскольку дистрофин располагается на X хромосоме, то только пациенты мужского пола имеют одиночную копию дистрофина; если эта копия мутантна, то функциональный дистрофин недоступен и мышечная ткань теряет свою целостность, вызывая мышечную слабость и атрофию. В результате пациенты имеют трудности с ходьбой, дыханием и др. ежедневной активностью. Сегодня отсутствует не комерческая терапия для DMD, но предвидятся методы лечения, включая прямое редактирование геномных мутаций в дистрофине для коррекции фатальных последствий [71, 72].
Альтернативный подход, который уже проверяется в клинических испытаниях, это активация паралога дистрофина, utrophin, который может дополнить функцию мутантного дистрофина [73]. При клинических испытаниях небольшой молекулой обеспечиваемая активация экспрессии обнаруживает умеренную эффективность; прямая активация экспрессии эндогенного utrophinс помощью CRISPR активаторов может решить этот вопрос. Активаторы могут доставляться с помощью AAV в мышечную ткань, как в случае с Glybera (единственная разрешенная генотерапия в Западном мире, использующая доставку терапевтического гена для лечения дефицита липопротеин липазы) [74]. Поскольку такой метод не может быть постоянно лечебным, поскольку активатор не может стабильно интегрироваться в геном клеток мишеней, это всё равно более безопасно, чем Cas9-based геномное редактирование, страдающее значительными побочными эффектами, которые необратимы. Подобная Glybera, терапия может доставляться посредством локальных инъекций ген-терапевтических вирусов, а преимущественно относительно более долговременная экспрессия в мышечной ткани не несет риска устойчивой интеграции [74].
Расширяя этот пример, многие моногенные болезненные гены имеют компенсаторные генетические паралоги, которые могут быть активированы с помощью сходных терапевтических подходов. Высоко программируемая природа Cas9 регуляторных инструментов может позволить разработать терапии для одиночных болезней, чтобы затем быть перепрофилированной для др. болезней, которые могут лечиться путем активации или супрессии естественно кодируемых благоприятных генов.

Concluding remarks


Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and Cas9 based tools have filled the need for an efficient, programmable, user-friendly platform for genome editing as well as epigenetic regulation. As such, the field is moving at a rapid pace and quickly uncovering novel ways to adapt the system, as well as the rules for maximizing the efficacy of these tools. These tools have opened up the possibilities of rapid large-scale genome-wide screens for both gain of function and loss of function perturbations, mapping out functional networks with unprecedented depth and precision. While several aspects of CRISPR-based transcriptional and epigenetic regulators remain to be characterized, such as relative strengths of these tools, exact level of off-target activity, and ability to deliver these tools in vivo-we foresee many exciting applications such as probing of new classes of noncoding gene functions by regulating expression at endogenous loci, and applications to new paradigms of human gene therapy.