Канонические TGFβ и activins передают сигналы посредством Smad2 и Smad3 [57, 58], которые взаимодействуют с разными регуляторами транскрипции на ДНК и могут соединяться с разными сайтами [32, 58]. Хотя Smad2 и Smad3 имеют сходные функции в ряде контекстов [32, 59, 60], они вызывают разные и даже противоположные эффекты с др. контекстах [32, 61, 62]. Имеет ли это место в хряще, неизвестно. Анализ мышей Smad3-/- ранее показал, что Smad3 супрессирует гипертрофию хондроцитов [12]. Находка, что избыточная экспрессия Smad2 может блокировать ускоренное созревание хондроцитов, наблюдаемое в Smad3-/- хондроцитах, подтверждает, что Smad2 и Smad3 осуществляют, по крайней мере, некоторые сходные функции in vitro [33]. Ограничением является то, что глобальные Smad3 мутанты создают возможность, что некоторые аспекты фенотипических отклонений в Smad3 мутантной ростовой пластинке обусловлены эффектами на др. типы клеток, такие как надхрящница. Однако, прямые эффекты на хондроциты выглядят правдоподобными в исследованиях in vitro [63, 64] и мы также выявили непосредственные эффекты в Smad3-дефицитных хондроцитах новорожденных. Несмотря на это, потеря Smad2, по-видимому, оказывает более значительное влияние на хондроциты в не пролиферативной зоне ростовой пластинки во время эмбриогенеза, чем потеря Smad3.

Мы установили, что Smad2 и Smad3 важны для хондрогенеза in vivo, чтобы ингибировать пролиферацию и гипертрофию. Некоторые из нарушений пролиферации, созревания и экспрессии генов были выражены наиболее сильно у Smad2CKO;Smad3-/- двойных мутантов, чем одиночных мутантов, указывая, что Smads 2 и 3 выполняют сходные функции в ростовой пластинке. Это может быть обусловлено, по крайней мере, частично способностью Smads 2 и 3 репрессировать экспрессию Ihh . Повышенные уровни РНК Ihh RNA у мутантов коррелируют с повышенными уровнями белка Ihh и белка его непосредственной мишени Ptch1 в покоящейся зоне. Хотя измененные свойства матрикса у Smad2/3 мутантов могут вносить вклад в увеличение диффузии белка Ihh, скорее всего, повышенные уровни мРНК Ihh, наблюдаемые у этих мутантов, также ответственны за повышенные уровни белка Ihh в покоящейся зоне и повышенные уровни Ptch1 по всей ростовой пластинке. Соответственно ростовые пластинки мутантов удлиняются в середине беременности и на ст. P0. Это согласуется с предыдущим исследованием функции Ihh в ростовой пластинке, где истощение Ihh в пренатальном хряще вызывало потерю столбчатой структуры и карликовость [65]. Несмотря на более длинную ростовую пластинку на этих стадиях, двойные мутанты обнаруживали постнатальную карликовость. Это может быть объяснено увеличением скорости вступления хондроцитов покоящейся зоны в пролиферативную столбчатую фазу, приводящему к преждевременному истощению пула покоящихся хондроцитов и к неспособности поддерживать элонгацию ростовой пластинки на постнатальных стадиях. Специфическая роль Ihh в постнатальной карликовости у Smad2/3 двойных мутантов, неясна; постнатальная потеря Ihh в хрящах приводит к карликовости [66]. С одной стороны, Ihh может способствовать преждевременному окончательному гипертрофическому созреванию, которое д. приводить к карликовости, в клетках вне пределов PTHrP [67, 68]. Дополнительные исследования постнатальных стадий необходимы для выяснения механизма, лежащего в основе постнатальной карликовости у Smad2/3 мутантов. Мы полагаем, что прямые эффекты Smad2 и Smad3 на гены, регулирующие клеточный цикл, могут вносить вклад.

Интересно, что фенотип ростовой пластинки на постнатальной стадии у Smad2/3 двойных мутантов отличается от такового у мышей, лишенных type II TGFβ рецептора TβRII (Tgfbr2) в хряще [21]. TβRII необходим для ответной реакции на все TGFβs. Tgfbr2CKO мыши, которые были получены при использовании того же самого Col2a1-Cre аллеля, использованного здесь, обнаруживали дефекты формирования межпозвонковых дисков (IVD), но не наблюдались очевидные альтерации в дифференцировке хондроцитов в аксиальных или аппендикулярных элементах [21]. Очевидные дефекты, наблюдаемые при образовании IVD, не обнаруживались при рождении у Smad2/3 двойных мутантов, но имелись четкие дефекты тибиальных ростовых пластинках. Имеется несколько возможных объяснений этих различий. Потеря Tgfbr2 воздействует на канонический Smad2/3 и не канонический пути. Хотя осевые дефекты, наблюдаемые у новорожденных мышей Tgfbr2CKO, но не у новорожденных Smad2/3 двойных мутантов, могут отражать действие не канонических TGFβ путей. Более того, дефекты ростовой пластинки у новорожденных, наблюдаемые у Smad2/3 двойных мутантов, но не у Tgfbr2CKO мышей, могут отражать роль Smads 2 и 3 в передаче сигналов, обеспечиваемых лигандами, иными, чем TGFβs, такими как activins [69].

Наш анализ подтвердил, что Smads 2 и 3 могут регул ировать уровни РНК Ihh , соединяясь с разными элементами Ihh промотора. Кандидаты SBEs могут быть предсказаны в промоторных регионах многих генов, но эти мотивы широко распространены и большинство из них оккупируется R-Smads, если исследовать с использованием ChIP-chip/ChIP-seq [70]. Мы выявили три SBEs в проксимальной части промотора Ihh, которые связывают Smads 2 и 3. Эти сайты обеспечивают дифференциальное рекрутирование Smads 2 и 3, и дифференциальную ассоциацию с разными ко-репрессорами. S1 и S3 в промоторе Ihh обеспечивают большую репрессирующую активность TGFβ на экспрессию Ihh, чем это делает S2. Но пока последовательности промотора Ihh, регулирующие экспрессию Ihh в ростовой пластинке, не обнаружены; мутагенез in vivo необходим для их выявления. Однако, в проксимальной чати промотора и регионе энхансера нами выявлен наиболее сильно законсервированный регион среди 60 видов млекопитающих (S6 Fig), в этом регионе обеспечиваются Smad4 эффекты на экспрессию Ihh [35] , а также влияние множественных транскрипционных факторов на экспрессию Ihh в хондроцитах [38, 39, 50].

Наше исследование выявило, что Smad2 и Smad3 ассоциируют с ингибиторами транскрипции Hdac4, SnoN и Ski после стимуляции TGFβ . Hdac4 ингибирует активность Runx2 и экспрессию Ihh [49]; SnoN и Ski репрессируют активацию транскрипции Smad2 и Smad3 [51, 52]; SnoN и Ski также ингибируют Smad1/5/8 обеспечиваемую транскрипционную активность в ATDC5 клетках и в W-20-17 остеобластах [53, 55]. Исследование показало, что Smads 2 и 3 действуют, чтобы репрессировать активность промотора Ihh in vitro, это согласуется с повышенными уровнями РНК и белка Ihh, наблюдаемыми у Smad2CKO, Smad3-/- и Smad2/3двойных мутантных мышей in vivo; однако, они также показали, что хотя хондроциты, выделенные от Smad2/3 двойных мутантов, обнаруживают нарушения свой способности снижать уровни РНК Ihh в ответ на TGFβ, они также обнаруживают снижение базовых уровней мРНК Ihh по сравнению с контрольными клетками (Fig 4A). Причина понижения базовых уровней РНК Ihh в Smad2/3 хондроцитах in vitro неясна. Комбинированная потеря Smad2 и Smad3 может влиять на способность этих клеток вступать в дифференцировку in vitro. Важно учитывать, что изолированные хондроциты, поддерживаемые в отсутствие дополнительных факторов роста, условия, которые не воспроизводят интактную ростовую пластинку, не подходят для изучения непосредственной роли TGFβ. Необходимы дополнительные исследования, для выявления роли Smad2 и Smad3 а базовой экспрессии Ihh. Низкий уровень ассоциации Smad2 и Smad3 с S1 и S3 может быть необходим для поддержания базовой активности промотора Ihh. Доказывает это то, что базовые уровни активности промотора Ihh более низкие в M1 и M3 конструкциях промотора Ihh. Однако, также возможно, что эти мутации воздействуют на связывание др. факторов, которые необходимы для базовой активности промотора. Тем не менее сравнение эффектов TGFβ в противовес не ростовым факторам показало важность ингибирующих эффектов S1 и S3 на TGFβ.

Итак, наши исследования выявили роль Smad2 в ростовой пластинке новорожденных и показали, что Smad2 и Smad3 поддерживают пул покоящихся хондроцитов в ростовой пластинке.