Посещений:
ДЕТЕРМИНАЦИЯ НЕЙРАЛЬНОЙ СУДЬБЫ



Внутренние регуляторы

Intrinsic regulations in neural fate commitment
Ke Tang, Guangdun Peng, Yunbo Qiao, Lu Song, Naihe Jing
Development, Growth & Differentiation Volume 57, Issue 2 February 2015 Pages 109–120

Neural fate commitment is an early embryonic event that a group of cells in ectoderm, which do not ingress through primitive streak, acquire a neural fate but not epidermal or mesodermal lineages. Several extracellular signaling pathways initiated by the secreted proteins bone morphogenetic proteins (BMPs), fibroblast growth factors (FGFs), wingless/int class proteins (WNTs) and Nodal play essential roles in the specification of the neural plate. Accumulating evidence from the studies on mouse and pluripotent embryonic stem cells reveals that except for the extracellular signals, the intracellular molecules, including both transcriptional and epigenetic factors, participate in the modulation of neural fate commitment as well. In the review, we mainly focus on recent findings that the initiation of the nervous system is elaborately regulated by the intrinsic programs, which are mediated by transcriptional factors such as Sox2, Zfp521, Sip1 and Pou3f1, as well as epigenetic modifications, including histone methylation/demethylation, histone acetylation/deacetylation, and DNA methylation/demethylation. The discovery of the intrinsic regulatory machineries provides better understanding of the mechanisms by which the neural fate commitment is ensured by the cooperation between extracellular factors and intracellular molecules.
Детерминация нейральной судьбы является ранним эмбриональным событием, когда группа клеток эктодермы, которая не проникает черед первичную полоску, приобретает нейральную судьбу. Первоначальные наблюдения на амфибиях выявили, что трансплантированная дорсальная губа бластопор может индуцировать вторую ось на вентральной стороне эмбриона реципиента на ст. гаструляции, это указывает на инструктивные взаимодействия между дорсальной губой бластопора и окружающей эктодермой приводит к генерации нервной системы (Spemann 1921; Spemann & Mangold 1924). Доказательства, полученные на разных видах, подтверждают, что помимо дорсальной губы бластопора амфибий, щиток костистых рыб, Гензеновский узелок у птиц и млекопитающих также могут участвовать в индукции нервной пластинки в трансплантационных экспериментах, осуществленных на одних и тех же видах, а также на разных видах, это указывает, что механизмы, участвующие в предопределении нейральной судьбы эволюционно законсервированы у всех позвоночных (Waddington 1932, 1933, 1934, 1936; Oppenheimer 1936a,b; Kintner & Dodd 1991; Blum et al. 1992; Hatta & Takahashi 1996). Многие лаб. работают над идентификацией факторов, которые обеспечивают выбор нейральной судьбы. 20 лет назад первое молекулярное объяснение инициации нервной ткани предполагало, что во время гаструляции эктодермальные клетки автономно выбирают нервную судьбу, которая ингибирована с помощью bone morphogenetic proteins (BMPs) , особенно BMP4 (Hemmatibrivanlou & Melton 1997; Munoz-Sanjuan & Brivanlou 2002; De Robertis & Kuroda 2004; Stern 2005, 2006; Vonica & Brivanlou 2006). Несмотря на это проблемы инициации нервной системы не могут быть полностью решены с помощью передачи только сигналов BMP. Накапливаются доказательства на разных организмах, что др. секретируемые белки, такие как fibroblast growth factors (FGFs), wingless/int класса белки (WNTs) и Nodal, также ответственны за детерминацию нейральных судеб. Комбинация этих классических внеклеточных регуляторов нейральной индукции хорошо известна (Sasai & Derobertis 1997; Wilson & Edlund 2001; Munoz-Sanjuan & Brivanlou 2002; Stern 2005, 2006). Недавние исследования на мышах и на плюрипотентных эмбриональных стволовых клетках (ESCs) пролили новый свет на то. как внеклеточные сигнальные пути, особенно BMP и FGFпути, в содружестве с др., модулируют детерминацию нейрального клона.
Потеря функции Bmpr1a, который является единственным type I BMP рецептором, экспрессирующимся в эпибласте имплантированных эмбрионов мыши (Mishina et al. 1995), приводит к преждевременной нейральной дифференцировке эпибласта (Di-Gregorio et al. 2007). Путь передачи сигналов BMP выполняет сходные функции в дифференцировке нейронов мышиных ESCs in vitro (Finley et al. 1999; Tropepe et al. 2001). Одно из исследований мышиных ESCs и epiblast stem cells (EpiSCs) показало, что BMP4 выполняет разные роли на разных стадиях развития во время нейральной дифференцировки ESCs. BMP4 ограничивает генерацию, происходящих из ESC, EpiSCs (ESD-EpiSCs) посредством подавления передачи сигналов FGF-Erk в ESCs. BMP4 супрессирует переход от ESD-EpiSCs к клеткам нейральных предшественников (NPCs),и усиливает дифференцировку не нейрального клона, которая, по-видимому, достигается частично посредством активации Id генов (Zhang et al., 2010). Очевидно, что подавление BMP во время нейральной индукции законсервировано у мышей.
Гибель Fgf4-/- или Fgfr2-/- нулевых мышей перед или после имплантации не позволяет исследовать их функцию в раннем развитии (Feldman et al. 1995; Arman et al. 1998). Формирование оси, спецификация мезодермы, формирования паттерна нейроэктодермы нарушаются при расширении экспрессии маркеров передней нейроэктодермы у Fgf8-/- мутантов, которые погибают на ст. поздней гаструляции (Meyers et al. 1998; Sun et al. 1999), указывая, что передача сигналов FGF может негативно регулировать спецификацию нейральных клонов в ранних эмбрионах мыши in vivo. В mESCs in vitro подавление FGF/Erk приводит к нарушению детерминации нейральной судьбы (Stavridis et al. 2007). После удаления Leukemia inhibitory factor (LIF), Fgf4-/- mESCs становятся устойчивы к нейральной дифференцировке, также как и к дифференцировке в ответ на BMP4; вместо этого Fgf4-/- сохраняются в недифференцированном состоянии, сохраняя экспрессию маркера плюрипотентности Oct4 и способность к нейральной дифференцировке (Kunath et al. 2007). Если FGF4 добавляется в культуральную систему, то Fgf4-/- mESCs сохраняют способность к нейральной дифференцировке и дифференцировке в ответ на BMP. Erk2-/- ESCs воспроизводят Fgf4-/- ESCs, показывая, что интактный путь передачи сигналов FGF является обязывающим переключение передачи сигналов BMP с поддержания самообновления к обеспечению не нейральной дифференцировки (Kunath et al. 2007). В свою очередь, передача сигналов FGF не активно индуцирует выбор нейральной судьбы; напротив, она способствует выходу ESCs из нативного состояния и вступлению в состояние, в котором они готовы к нейральной дифференцировке под воздействием др. сигналов. Кроме того, передача сигналов FGF является критической для перехода от ESCs к эпибласту (Sterneckert et al. 2010), а также для поддержания плюрипотентности EpiSC (Brons et al. 2007; Tesar et al. 2007).
Исключая внешние пути, исследования in vivo и in vitro показали, что внутренне присущие сети, запрограммированные с помощью транскрипционных и эпигенетических факторов, участвуют также в регуляции приобретения нейральной судьбы.



Model of Pou3f1 gene function in the neural fate commitment. During gastrulation in the early mouse embryo, Pou3f1 promotes the neural fate commitment through dual actions, activating the neural lineage genes including Zfp521, Sox2, and Zic2 in the anterior ectoderm and inhibiting the external signaling pathways such as bone morphogenetic protein (BMP) signal from the extra-embryonic areas and wingless/int class protein (WNT) signal from the posterior embryo.

Transcriptional factors and neural fate commitment


Sox2, первый общий маркер нервной пластинки и кроме того ген Sox2 кодирует Sry-related HMG box транскрипционный фактор (Gubbay et al. 1990), он рассматривается как первый генеральный1 маркер инициации нервной ткани. Во время раннего развития мыши экспрессия Sox2 транскриптов обнаруживается сначала в некоторых клетках на ст. E2.5 морулы, в клетках внутренней клеточной массы (ICM) на ст. E3.5 и во всем эпибласте на ст. E6.5. Во время гаструляции экспрессия Sox2 ограничивается передней эктодермой, где возникает презумптивная нейроэктодерма на ст. E7.0-E8.0. Транскрипты Sox2 были изучены в головной складке и нервной трубке на ст. E8.5, и по всему головному мозгу и в нервной трубке на ст. E9.5. (Rex et al. 1997; Wood & Episkopou 1999; Avilion et al. 2003; Bylund et al. 2003; Graham et al. 2003; Uchikawa et al. 2003; Tanaka et al. 2004). In vitro, Sox2 экспрессируется первоначально в ESCs, и на самых ранних стадиях дифференцировки ESC в нейроны (Thomson et al. 2011). Профиль экспрессии гена Sox2 указывает на то, что он может играть важную роль в раннем нейральном развитии.
Sox2 гомозиготные мутанты погибают во время имплантации. Метод инъекции в бластоцист показал, что Sox2 выполняет клеточно автономную функцию в развитии клеток эпибласта (Avilion et al. 2003). На Sox2 геномном локусе идентифицировано более 23 энхансеров. N1 и N2 энхансеры являются критическими для процесса детерминации нейральной судьбы. У ранних эмбрионов мыши энхансер N2 обеспечивает экспрессию Sox2 в эпибласте и передней части нервной пластинки (Iwafuchi-Doi et al. 2011). У эмбрионов кур активация N1 энхансера происходит довольно поздно (Uchikawa et al. 2003). Tbx6 репрессирует активность энхансера N1 в клетках, приобретающих судьбу параксиальной мезодермы. Сохранение активности N1 энхансера превращает параксиальную мезодерму в нейральные клоны (Takemoto et al. 2011). В mESCs, Sox2 и др. транскрипционные факторы, такие как Oct4, Nanog, генерируют сложные регуляторные сети для поддержания плюрипотентного состояния (Boyer et al. 2005; Masui et al. 2007; Chen et al. 2008; Kim et al. 2008; Orkin & Hochedlinger 2011). Во время дифференцировки mESCs, экспрессия Oct4 увеличивается в клетках, приобретших мезодермальную судьбу, но снижается в клетках, приобретших качественные особенности нейроэктодермы. Напротив, экспрессия Sox2 усиливается в клетках, получивших нейральную судьбу и снижается в клетках, получивших мезодермальную судьбу. Sox2 может прежде всего способствовать дифференцировке в нейроэктодерму путем блокирования ключевых регуляторов, таких как Brachyury в развитии мезодермальных клонов (Thomson et al. 2011; Wang et al. 2012). Ясно, что Sox2 не только первый генеральный маркер нервной ткани, но и также властный регулятор гарантирующий нейральную судьбу.

Zfp521 is a crucial neural initiating nuclear factor


Ген Zfp521 , кодирующий ядерный белок цинковые пальчики (Warming et al. 2003; Bond et al. 2008), экспрессируется исключительно в передней части нейроэктодермы эмбрионов мышей во время гаструляции на ст. E7.5 и в нейроэктодерме ростральной части нервной трубки после гаструляции на ст. E8.0 (Kamiya et al. 2011). Zfp521 не экспрессируется в оригинальных ESCs, и его экспрессия активируется драматически во время нейральной дифференцировки ESCs в свободной от сыворотки культуре агрегатов, подобных эмбриоидным тельцам. Профиль экспрессии Zfp521 указывает на то, что он может играть критическую роль в инициации нейральной судьбы. Принудительная экспрессия Zfp521 усиливает нейральное превращение ESCs, и его способствующая нейральному развитию активность д. превосходить эффекты, ингибирующие нейральную судьбу, от BMP4. Напротив, нейральная дифференцировка дефицитных по Zfp521 mESCs нарушена. Метод совместного культивирования Zfp521-shRNA ESCs и контроля ESCs демонстрирует, что Zfp521 может регулировать нейральную дифференцировку клеточно-автономным способом. Ясно, что Zfp521 необходим и достаточен для нейрального превращения ESCs (Kamiya et al. 2011).
Эпибласт-подобные клетки, но не нейроэктодермальные клетки могут быть сгенерированы в дифференцирующихся истощенных по Zfp521 ESCs, подтверждая, что Zfp521 выполняет специфическую функцию по управлению переходом от эпибласта к нейроэктодерме. Метод Chromatin immunoprecipitation (ChIP) показал, что белок Zfp521 специфически концентрируется в геномных регионах специфичных для нейроэктодермы генах, таких как Sox1, Sox3 и Pax6. Zfp521 может быть скоординирован с ко-активатором p300, чтобы прямо активировать эти ранние нейроэктодермальные гены. Т.о., Zfp521 специфически инициирует прирожденный переход mESCs в NPCs (Kamiya et al. 2011).

SIP1 is essential for the neural fate initiation


Sip1, Smad-interacting protein 1, является одним из членов семейства ZFHX1 и обладает гомеодомен-подобным мотивом, двумя кластерами цинковых пальчиков и Smad-взаимодействующим доменом (Verschueren et al. 1999; Postigo et al. 2003). Sip1 может действовать как репрессор, ингибируя экспрессию таких генов, как E-cadherin и Brachyury путем связывания CACCT(G) сайта (Lerchner et al. 2000; Comijn et al. 2001). Sip1 может также взаимодействовать с активированными Smad1/2/3 белками, чтобы заблокировать пуи передачи сигналов BMP и ACTIVIN-NODAL. Как главная мишень для Churchill, Sip1 обеспечивает образование нервной пластинки у ранних эмбрионов кур (Sheng et al. 2003). Интересно, что некоторые, законсервированные сайты связывания Sip1 идентифицированы в энхансерах гена Sox2, указывая, что Sip1 возможно является вышестоящим регулятором гена Sox2 (Uchikawa et al. 2003).
Экспрессия SIP1 обнаруживается в плюрипотентных эмбриональных стволовых клетках человека (hESCs), и увеличивается постепенно вследствие нейральной дифференцировки. SIP1 экспрессия резко усиливается в ответ на подавление передачи сигналов ACTIVIN-NODAL с помощью SB431542 (Chng et al. 2010). Избыточная экспрессия SIP1 снижает экспрессию маркера плюрипотентности NANOG в hESCs, но увеличивает экспрессию ранних (GBX2 and HOXA1) и поздних (OLIG3, SOX1 and SIX1) нейральных маркеров. Кроме того, избыточная экспрессия SIP1 усиливает нейральную дифференцировку hESCs и mEpiSCs, подтверждая, что функция, способствующая нейральному развитию, SIP1 эволюционно законсервирована (Chng et al. 2010). Напротив, истощение SIP1 усиливает экспрессию NANOG в hESCs, и снижает базовые уровни ранних (GBX2, HOXA1) и поздних (OLIG3, SOX1) нейральных генов. Интересно, что во время нейральной дифференцировки hESCs, он экспрессируется позднее нейральных маркеров OLIO3, SOX1 и SIX1, которые снижаются драматически, указывая, что SIP1 необходим для поздней нейральной дифференцировки (Chng et al. 2010). SIP1 может обеспечивать нейральную судьбу путем блокировки сигнальных путей, которые способствуют прогрессу др. зародышевых слоёв, особенно мезэнтодермы и дефинитивной энтодермы (Chng et al. 2010).

Pou3f1, a dual regulator in the neural fate commitment


Pou3f1, также известен как Oct6, Tst1 или SCIP, кодирует POU доменовый транскрипционный фактор и принадлежит к подсемейству POU III (Monuki et al. 1989; Xi et al. 1989; Meijer et al. 1990; Suzuki et al. 1990). Экспрессия Pou3f1 обнаруживается по всему эпибласту эмбрионов мышей на ст. E5.5. На ст. E6.5 и E7.0, экспрессия Pou3f1 ограничивается передней частью эмбриона, где возникает нейроэктодерма. Экспрессия Pou3f1 ограничивается передней частью нейроэктодермы на ст. E7.5 и E8.0, и легко обнаруживается в переднем мозге и среднем мозге на ст. E9.5 (Xi et al. 1989; Zwart et al. 1996; Iwafuchi-Doi et al. 2012; Zhu et al. 2014). В клеточной культуре in vitro ген Pou3f1 экспрессируется недифференцированными ESCs (Scholer et al. 1989; Meijer et al. 1990; Zhu et al. 2014). Экспрессия Pou3f1 достоверно увеличивается во время нейральной дифференцировки плюрипотентных ESCs (Zhu et al. 2014). Кроме того, обработка RA быстро активирует экспрессию Pou3f1в P19 клеточных агрегатах (Meijer et al. 1990; Zhu et al. 2014). Экспрессия Pou3f1 высокая в недифференцированных EpiSCs, и постепенно снижается на 1 и 2 день в NPC (Iwafuchi-Doi et al. 2012). Такие паттерны экспрессии Pou3f1 показывают, что он может играть важную роль во время раннего нейрального развития.
Детерминация нейральной судьбы нарушается при нейральной дифференцировке в дефицитных по Pou3f1 ESCs. Напротив, избыточная экспрессия Pou3f1 способствует нейральной дифференцировке ESCs, особенно нейральному переходу от эпибласта к клеткам нейральных предшественников, клеточно автономным способом. Метод инъекции в бластоцист показал, что Pou3f1-дефицитные ESCs неспособны интегрироваться в нейроэктодерму химерных эмбрионов, но где с избыточной экспрессией Pou3f1 ESCs преимущественно включаются в нейроэктодерму. Т.о., Pou3f1необходим и достаточен для детерминации нейральной судьбы плюрипотентных стволовых клеток in vivo и in vitro (Zhu et al. 2014).
Геномный ChIP-seq и RNA-seq подходы показали, что Pou3f1 может связывать и активировать экспрессию генов, связанных с нейронами, таких как Sox2, Zfp521, Zic1, Zic2. Pou3f1 концентрируется на N2 энхансерном регионе гена Sox2, чтобы способствовать экспрессии гена (Zhu et al. 2014). Соотв., принудительная экспрессия Pou3f1 в EpiSCs также приводит к повышению экспрессии нескольких нейральных генов, включая Sox1, Sip1, Otx1, Hesx1, Pax6 и Gbx2 (Iwafuchi-Doi et al. 2012). В бессывороточной культуре агрегатов, подобных эмбриоидным тельцам, экспрессия Pou3f1 не изменяется ни при избыточнорй экспрессии, ни при истощении Zfp521. Тем не менее, принудительная экспрессия Pou3f1 в ESCs усиливает экспрессию Zfp521 и ранние нейроэктодермальные маркерные гены при дифференцировке нейронов, чего не происходит в присутствии BMP4 или в Zfp521-истощенных ESCs. Ясно, что нейтрализующая активность Pou3f1 от Zfp521 (Kamiya et al. 2011). Кроме того, Pou3f1 ингибирует пути передачи сигналов BMP и WNT путем ослабления транскрипции их нижестоящих генов эффекторов, таких как Id1, Id2, Msx1, Msx2 из пути BMP и Wnt3, Axin2, Dkk1, Myc из пути WNT. Т.о., ген Pou3f1 выполняет двойную функцию усиливать нейральную дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток путем активации внутренне прирожденных сетей, способствующих нейральному развитию, и блокировать внешние, ингибирующие нейральное развитие, сигналы (Zhu et al. 2014) (Fig. 1).

Figure 1. Model of Pou3f1 gene function in the neural fate commitment. During gastrulation in the early mouse embryo, Pou3f1 promotes the neural fate commitment through dual actions, activating the neural lineage genes including Zfp521, Sox2, and Zic2 in the anterior ectoderm and inhibiting the external signaling pathways such as bone morphogenetic protein (BMP) signal from the extra-embryonic areas and wingless/int class protein (WNT) signal from the posterior embryo.

Transcription factor regulatory networks in the neural fate commitment


Sox2, Zfp521, Sip1 и Pou3f1, а также многие др. транскрипционные факторы создают регуляторные сети, обеспечивающие выбор нейральной судьбы. В процессе перехода от EpiESCs к NPCs факторы Zic2/3, Otx2, Sox2 и Pou5f1 могут поддерживать плюрипотентное состояние эпибласта путем поддержки экспрессии Fgf5 и Eomes. Zic2/3, Otx2 и Pou5f1/3f1 факторы блокируют развитие мезодермальных клонов путем репрессии T. Zic2/3 и Sox2 факторы ингибируют детерминацию энтодермальной судьбы путем репрессии Sox17 и Eomes. Otx2 супрессирует образование задней части нервной пластинки, репрессируя Nkx1.2, Gbx2 и Sox1 (Iwafuchi-Doi et al. 2012). Кроме того, Sox2, как и Sox1 и Sox3, могут кооперироваться др. с др., чтобы управлять инициацией выбора нейральнрой судьбыво время раннего развития эмбрионов мышей (Graham et al. 2003). В hESCs, факторы SMAD2, NANOG и OCT4 ингибируют экспрессию SIP1, тогда как SOX2 способствует экспрессии SIP1 (Chng et al. 2010). При нейральной дифференцировке из mESCs, Pou3f1 действует как вышестоящий регулятор Sox2 и Zfp521 (Kamiya et al. 2011; Zhu et al. 2014). Brn2, другой POU III транскрипционный фактор может частично компенсировать истощение Pou3f1 (Zhu et al. 2014). Ясно, что во время инициации нервной ткани множественные транскрипционные факторы контролируют один другого, чтобы активировать экспрессию нейральных эктодермальных генов, но чтобы ингибировать экспрессию гена плюрипотентности и генов не нейральных клонов. Генерация in vivo или in vitro моделей с помощью геномного редактирования множественных генов расширяет наше понимание механизмов, участвующих детерминации нервной судьбы.

Epigenetic regulations and neural fate commitment


Изучение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток in vivo и in vitro продемонстрировало, что эпигенетическая регуляция также играет императивную роль в детерминации нейральной судьбы. Эпигенетические модификации гистонов или ДНК контролируют состояние хроматина, которое определяет, будет ли ДНК доступна для транскрипционных факторов или нет. В процессе перехода от ESCs к нейральным клонам гены плюрипотентности становятся недоступными для транскрипционных факторов, и их экспрессия выключается. Напротив, гены нейрального развития становятся доступными для транскрипционных факторов, и их экспрессия включается, что в свою очередь обеспечивает выбор нейральной судьбы. Динамические изменениях конформации хроматина достигаются с помощью метилирования гистонов, такиех как H3K4me3, H3K27m3, H3k9me3, метилирования/деметилирования ДНК и ацетилирования/деацетилирования гистонов (Hsieh et al. 2004; Hsieh & Gage 2005; Hirabayashi & Gotoh 2010; Coskun et al. 2012; Roidl & Hacker 2014).

The bivalent state in pluripotent ESCs


Плюрипотентные ESCs остаются в недифференцированном состоянии. В ESCs, экспрессия генов ключевых регуляторов, связанных с детерминацией клонов, замалчивается или поддерживается на низких уровнях. В отличие от постоянного молчания в дифференцированных клетках, молчание этих генов в ESCs обратимо, и может быть ослаблено с помощью соотв. онтогенетических сигналов. Метилирование лизина гистонов регулирует транскрипцию генов, а также репликацию и рекомбинацию (Zhang & Reinberg 2001). Лизиновые остатки гистонов H3 и H4 могут быть моно-, ди- и триметилированы. H3K27me3 и H3K4me3 ассоциированы с репрессией генов и с активацией генов, соотв. Комбинация H3K27me3 и H3K4me3 рассматривается как метка бивалентного хроматина, гены которого готовы для транскрипционной активации после дифференцировки плюрипотентных ESCs (Azuara et al. 2006; Bernstein et al. 2006).

H3K27 methylation


H3K27me3 концентрируется на ключевых онтогенетических генах, которые замалчиваются в плюрипотентных ESCs (Boyer et al. 2006; Bracken et al. 2006; Lee et al. 2006). Во время перехода от ESCs к NPCs, H3K27me3 теряется с промоторов большинства генов нейральных клонов, это приводит к активации генов (Bernstein et al. 2006; Dahl et al. 2007; Mikkelsen et al. 2007; Pasini et al. 2007). H3K27 метилирование осуществляется с помощью KMT6A или KMT6B (Cao & Zhang 2004). Как специфическая для H3K27 метилтрансфераза, KMT6A выполняет важную функцию в обновлении, поддержании и дифференцировке ESCs (Lee et al. 2007; Sher et al. 2008). mESCs поддерживаются в недифференцированном состоянии в присутствии цитокина leukemia inhibitor factor (LIF). После исчезновения LIF, ретиноевая кислота (RA) может вызывать нейральную дифференцировку mESCs (Ross et al. 2000; Glaser & Brustle 2005). Высокие уровни H3K27me3 и PRC2, включая KMT6A связывание, обнаруживаются в недифференцированных ESCs. Глобальное снижение H3K27me3 и потеря KMT6A белка и мРНК обнаруживаются в дифференцирующихся ESCs спустя 3 дня после воздействия RA, причем это связано с активацией экспрессии Nestin. Напротив, динамическая, быстрая потеря H3K27me3 и связывания KMT6A лишь спустя несколько часов после воздействия RA, оценивается по чувствительным к RA генам, таким как Hoxa1 (Lee et al. 2007). Дальнейшие исследования показали, что потеря H3K27me3 репрессивной метки и др. множественных гистоновых модификаций, включая H3K4me3 и ацетилирование гистонов H3 и H4, необходима, чтобы активировать Hoxa1 (Lee et al. 2007). KDM6A, KDM6B, KDM7A и KDM7Cучаствуют в деметилировании H3K27me3. По сравнению с др. генами деметилаз лизана, Kdm6b обнаруживает наивысшую активность на 8-й день, при этом происходит снижение почти к базовому уровню на 26-й день нейральной дифференцировки mESCs (Burgold et al. 2008), указывая, что Kdm6b может участвовать в начальной нейральной детерминации. В самом деле, shRNAs обусловленный нокдаун Kdm6b приводит к нарушению перехода от ESCs к NPCs в ходе нейральной дифференцировки, что сопровождается неспособностью к активации генов нейральных маркеров, включая Pax6, Nestin и Sox1. Метод ChIP-qPCR демонстрирует, чтоt Pax6, Nestin и Sox1 являются непосредственными мишенями для KDM6B. Даже еслди гены мишени для KDM6B обнаруживают отличающиеся паттерны метилирования H3K27 и профили экспрессии, KDM6B всё же необходим для выбора нейральной судьбы путем регуляции их экспрессии (Burgold et al. 2008).

H3K4 methylation


H3K4 метилирование (me-, di-и tri-methylation) часто обнаруживаются в промоторном регионе или в точках старта транскрипции транскрибируемых генов, и оно важно для рекрутирования RNA polymerase и транскрипционных факторов для активации генов. Деметилирование H3K4me3 приводит к репрессии транскрипции генов мишеней (Sims et al. 2003; Szutorisz et al. 2005). Метилирование H3K4 осуществляется с помощью KMT2A, KMT2B, KMT2C, KMT2D, KMT2E, KMT2F, KMT2G, KMT2H, KMT3D, KMT3E и KMT7. Деметилирование H3K4 катализируется с помощью KDM1A, KDM1B, KDM5A, KDM5B, KDM5C и KDM5D. KDM5B, специфическая деметилаза метилированных гистонов H3 по lysine 4, экспрессируются на высоком уровне в эпибласте мыши на ст. E5.5 (Frankenberg et al. 2007) и регулирует ход G0-to-G1 клеточного цикла посредством checkpoint генов клеточного цикла (Yamane et al. 2007). Временная избыточная экспрессия Kdm5b приводит к драматическому снижению H3K4me3 в mESCs. Экспрессия генов Egr1, BMI1 и p27, участвующих в контроле клеточного цикла и детерминации клеточных клонов, существенно снижена. Концентрация H3K4me3 на их промоторах снижена; напротив, рекрутирование KDM5B усилено, показывая. что Egr1, BMI1 и p27 являются непосредственными мишенями KDM5B. Постоянная избыточная экспрессия Kdm5b в ESCs (mESCsKDM5b) обнаруживает сходный процент Oct4-позитивных клеток как в контрольных ESCs, но при этом наблюдается более высокая скорость митозов. mESCKDM5b могут дифференцироваться в нейросферы (NSKDM5b). Но по сравнению с контролем, пролиферация NSKDM5b увеличивается в два раза, и процесс репликации NSKDM5b продолжается в виде роста в суспензии. Экспрессия Nanog также достоверно выше в mESCsKDM5b, возможно из-за репрессии экспрессии Tcf3, это подавляет экспрессию Nanog. Ясно, что KDM5B может ингибировать экспрессию регуляторных генов, таких как Tcf3, BMI1, Egr1 и p27, чтобы модулировать пролиферацию и дифференцировку ESCs (Dey et al. 2008). Кроме того, KDM5B главным образом располагается в местах старта транскрипции генов, связанных с развитием, чтобы обеспечить переход от ESCs к NPCs (Schmitz et al. 2011). Интересно, что регуляция транскрипции с помощью KDM5C зависит от локусов, связывающих геномные элементы. Белок KDM5C деметилазы обнаруживается в мышиных ESCs и NPCs. ChIP-seq исследование KDM5C, H3K4me1 или H3K4me3 выявило, что пики KDM5C перекрываются с регионами высоких, промежуточных и низких уровней H3K4me3. Регионы с высокими H3K4me3 расположены вблизи TSS, соответствующих активным промоторам, при этом наблюдаются высокие уровни сигналов H3K27ac и global run-on sequencing (GRO-seq). Напротив, регионы с промежуточными или низкими уровнями H3K4me3 являются позитивными по H3K4me1 с низкими, но достоверными H3K27ac или GRO-seq сигналами (Outchkourov et al. 2013). Нокдаун Kdm5c приводит к локальному увеличению H3K4me3 и снижению H3K4me1 модификаций, но не глобальных уровней H3K4me3. Гены, ассоциированные с сайтами связывания KDM5C в промоторах с высоким H3K4me3, в основном усиливают свою активность. Тем не менее, гены, содержащие пики Kdm5c с промежуточными- и низкими-H3K4me3 энхансерными элементами в основном снижают сою активность. Исследование активности промоторов и энхансеров в ESCs с помощью двух luciferase репортеров, pGL3-basic для активности промоторов и pPou5F1 для активности энхансеров. Данные по Luciferase подтверждают, что KDM5C ингибирует транскрипцию генов на промоторах, но стимулирует экспрессию генов с помощью энхансеров путем балансирования состояний метилирования Histone H3K4 (Outchkourov et al. 2013). Во время перехода от mESCs к NPCs, связывание KDM5C в регионах энхансеров теряется, указывая, что Kdm5c может участвовать в регуляции детерминации нейральной судьбы (Outchkourov et al. 2013). Механизмы пока неясны.

H3K9 methylation


Как и H3K27me3, H3K9me3 также является меткой подавления гена. Метилирование H3K9 осуществляется с помощью KMT1A, KMT1B, KMT1C, KMT1D, KMT1E, KMT1F и KMT8A. Деметилирование H3K9 катализируется с помощью KDM1A, KDM1B, KDM3A, KDM3B, KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D, KDM7A, KDM7B и KDM7C. H3K9 не связан с бивалентным состоянием ESCs. Ди- и триметилирование H3K9 обнаруживаются в плюрипотентных генах и генах не нейральных клонов во время дифференцировки hESCs в NPCs, указывая, что метилирование H3K9 приводит к молчанию этих генов (Golebiewska et al. 2009). KDM4C может деметилировать H3K9me3, чтобы активировать экспрессию генов (Wissmann et al. 2007). Экспрессия Kdm7a повышена на ранней стадии нейральной дифференцировки mESC. Процесс перехода ESCs к NPCs нарушен в дефицитных по Kdm7a ESCs, тогда как избыточная экспрессия Kdm7a способствует нейральной дифференцировке. В истощенных по Kdm7a ESCs, H3K27me2 и H3K9me2 концентрируются на сайтах старта транскрипции гена FGF4, где имеются KDM7A связывающие регионы, показывающие, что KDM7A является двойной специфичности гистоновой деметилазой (Huang et al. 2010b). У ранних эмбрионов кур in vivo Kdm7a преимущественно экспрессируется в клетках эпибласта. Соотв., избыточная экспрессия Kdm7a у эмбрионов кур приводит увеличению нервной ткани, тогда как образование нервной пластинки нарушается при истощении Kdm7a (Huang et al. 2010a). Ингибирование KDM7 ортологов у рыбок данио вызывает дефекты развития головного мозга (Tsukada et al. 2010). Ясно, что экспрессия и функция Kdm7a эволюционо законесервирована в раннем нейральном развитии.

DNA methylation/demethylation


Метилирование ДНК является критическим для геномного импринтинга, инактивации Х хромосом, регуляции экспрессии генов, а также для эпигенетической модуляции. Профиль метилирования ДНК является динамично ремоделируемым во время развития нервной системы млекопитающих (Lister et al. 2013). Метилирование ДНК катализируется с помощью DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNMT3A и DNMT3B по цитозиновым остаткам в CpG динуклеотидах (Li 2002). Метилирование ДНК обычно связано с репрессией генов, которое осуществляется благодаря блокированию связывания транскрипционных факторов на ДНК (Marin-Husstege et al. 2002; Hockly et al. 2003; Hao et al. 2004; Hsieh et al. 2004). У мышей экспрессия Dnmt3a обнаруживается в эмбриональной эктодерме и на низких уровнях в мезодермальных клетках на ст. E7.5, и обнаруживается повсеместно в сомитах и вентральной части эмбриона на ст. E8.5 и E9.5. Экспрессия Dnmt3b осуществляется на высоком уровне в эмбриональной эктодерме, нейральной эктодерме и хориональной эктодерме на ст. E7.5, и обнаруживается в переднем мозге и глазах на ст. E8.5 и E9.5 (Okano et al. 1999). Однако, ранняя смертность у Dnmt1-/- или Dnmt3a-/-;Dnmt3b-/- нулевых мыше препятствует изучению механизма того, как DNA methyltransferases участвуют в регуляции детерминации неральной судьбы (Li et al. 1992; Okano et al. 1999).
Деметилирование ДНК ассоциировано с активацией генов (Reik 2007). Статус метилирования ДНК является динамичным в ходе развития (Barreto et al. 2007; Reik 2007; Rai et al. 2008). Во время перехода от ESCs к нейральным клонам CpGs некоторых геномных локусов, таких как neural related distal regulatory elements, деметилированы, тогда как CpGs большинства не нейральных генов метилированы (Mohn et al. 2008). Ten to 11 translocation (Tet) белков участвуют в геномных динамичных изменениях метилирования ДНК. У млекопитающих имеются три Tet белка, Tet1, Tet2 и Tet3. Tet белки катализируют переход 5mCк 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) посредством реакций окисления (Tahiliani et al. 2009; Ito et al. 2010, 2011; He et al. 2011; Koh et al. 2011). Уровень 5hmC, высокий в mESCs, драматически снижается на ранних ст. дифференцировки и увеличивается в полностью дифференцированных клетках (Kriaucionis & Heintz 2009; Tahiliani et al. 2009; Szwagierczak et al. 2010), это подтверждает, что модулирование метилирования ДНК также является динамичным. 5hmC и Tet1 концентрируются на промоторах сбалансированных генов в ESCs in vitro (Wu et al. 2011a,b). Экспрессия Tet1 обнаруживается у одноклеточных эмбрионов и частая в клетках внутренней клеточной массы (Ito et al. 2010). В дефицитных по Tet1 плюрипотентных mESCs, дифференцировке трофэктодермы способствует усиленная экспрессия ключевых генов трофэктодермы Cdx2, Eomes, Hand1 и Elf5, тогда как нейроэктодерма редуцируется, что сопровождается снижением экспрессии генов нейральных клонов Pax6 и NeuroD2 (Ito et al. 2010; Ficz et al. 2011; Koh et al. 2011; Williams et al. 2011; Xu et al. 2011; Dawlaty et al. 2013). In vivo, hmCG обогащены активными геномными локусами в головном мозге плодных и взрослых мышей (Lister et al. 2013). Tet1 участвует в эпигенетической регуляции пролиферации neural stem cells (NSCs) у взрослых (Zhang et al. 2013), а также в модуляции синаптической пластичности и снижении памяти (Rudenko et al. 2013). Генерация NPCs на Tet1-/- нулевом фоне и раннее образование трех зародышевых листков у Tet1-/-;Tet2-/- мышей, по-видимому, происходит нормально, возможно из-за функциональной компенсации между тремя Tet генами (Dawlaty et al. 2011, 2013). Потеря функции гена Tet3 у мышей блокирует активацию отцовских генов и приводит к неспособности раннего развития (Gu et al. 2011).

Histone acetylation/deacetylation


Ацетилирование гистонового лизина возможно наиболее охарактеризованная модификация гистонов, в ней участвуют две группы энзимов, histone acetyltransferases, HATs, и histone deacetylases, HDACs. Ацетилирование гистонов обеспечивается с помощью HATs , это ослабляет взаимодействие между гистонами и ДНК, так что транскрипционные факторы могут достигать ДНК, чтобы активировать экспрессию генов. Деацетилирование катализируется с помощью HDACs, оно усиливает ассоциацию между гистонами и ДНК и предупреждает связывание транскрипционных факторов, это приводит к репрессии генов (Jenuwein & Allis 2001). CBP и p300 ацетилируют гистоны, а также негистоновые белки. Нулевые по CBP и p300 генам мутантные мыши погибают на ранних эмбриональных стадиях. с дефектами ЦНС (Yao et al. 1998; Tanaka et al. 2000). У млекопитающих HDACs подразделяются на 4 класса: cкласс 1 HDACs (HDAC1-3 и HDAC8), класс 2 (HDAC4-7, HDAC9 и HDAC10), класс 3 (sirtuins) и класс 4 (HDAC11). HDAC1 и HDAC2 наиболее изученные HDACs. У мышей экспрессия в ядре HDAC1 белка обнаруживается на 4-клеточной, 8-клеточной ст. и ст. морулы и бластоциста и экспрессия транскриптов HDAC1 высокая на ст. головной складки и нейральной складки на ст. E8.5. HDAC1-нулевые мутантные мыши погибают до ст. E10.5 с тяжелыми дефектами ЦНС (Lagger et al. 2002). HDAC1 и HDAC2 участвуют в регуляции дифференцировки олигодендроцитов и в формировании синапсов (Akhtar et al. 2009; Ye et al. 2009; Chen et al. 2011; Jacob et al. 2011). Установлено. что ингибирование деацетилирования гистонов способствует дифференцировке human pluripotent stem cells (hPSCs) в NPCs. Воздействие HDAC ингибитора (HDACi) дает больше NPCs за счет усиления экспрессии маркеров нейроэктодермы, а также спецификации нейроэктодермы, а класса I HDACs выполняют важные роли в генерации NPC. shRNAs обусловленный нокдаун гена продемонстрировал, что HDAC3, но не HDAC1 или HDAC2 участвует в дифференцировке NPC путем формирования регуляторного комплекса с SMRT (Yang et al. 2014). Однако, вклад ацетилирования/деацетилирования гистонов в инициацию нервной ткани не был детально изучен.

Perspectives


Детерминация нейральной судьбы сложное, динамичное и последовательное событие, контролируемое в пространстве и времени. Инициация нервной пластинки определяется с помощью как внеклеточных сигналов, таких как BMPs, FGFs, NODAL, и WNT, так и внутриклеточных молекул, включая транскрипционные и эпигенетические факторы. Внешняя регуляция детерминации нервной судьбы изучается давно, а внутренние модуляции, особенно эпигенетические модификации гистонов и ДНК, нейральной индукции находится в центре внимания. Детальные молекулярные механизмы того, как внешние регуляторы и внетренние модуляции взаимодействуют др. с др., чтобы программировать детерминацию неральной судьбы только начинают выясняться.
Успехи секвенирования одиночных клеток и биоинформатика предоставляют информацию не только о профиле генной экспрессии, но и также об инструктивных взаимодействиях между внеклеточными и внутриклеточными сетями. Разработка подходов (micro-ChIP), ChIP-seq, DNA modification и др. техник предоставляет новые доказательства регуляции генов на разных уровнях, таких как рекрутирование транскрипционных факторов и эпигенетических факторов, модификации гистоновых белков и метилирование ДНК. Всё это делает возможным анализ генной экспрессии и регуляции генов в одиночной клетке у ранних эмбрионов in situ.
Инициация нервной ткани достигается за счет кооперации многих генов, внеклеточных сигналов, внутриклеточных факторов и эпигенетических молекул. В последнее время создано большое количество животных моделей для изучения функций генов in vivo. Потребуется много времени и значительные усилия для получения двойных или тройных генных нокаутов для преодоления перекрываемости функции генов. С первого сообщения в 2012 (Jinek et al. 2012), система CRISPR/Cas9 стала успешно использоваться для генерации истощения множественных генов в ESCs in vitro и у мышей in vivo (Wang et al. 2013), это демонстрирует простой, быстрый и эффективный подход к созданию мышиных моделей с помощью геномного редактирования многих генов. Более того, система CRISPR/Cas9 разрушает ограничения на использование эмбриональных стволовых клеток, указывая. что точное редактирование генов, возможно, сможет быть достигнуто у любого организма. В самом деле, первые twin cynomolgus обезьяны с искусственными мутациями были получены с помощью Cas9 системы (Niu et al. 2014). CRISPR/Cas9 обеспечиваемое геномное редактирование нейральных генов у мышиных моделей и создание модельных приматов расширит наши знания о детерминации нейральной судьбы, что в дальнейшем будет использовано для лечения болезней нейрального развития, таких как нарушения спектра аутизма, шизофрения и депрессии.