Посещений: 
ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ Eph-ephrin
Роль в определении качественных особенностей сосудов
Membrane-mediated regulation of vascular identity. " Hashimoto, T., Tsuneki, M., Foster, T. R., Santana, J. M., Bai, H., Wang, M., Hu, H., Hanisch, J. J. and Dardik, A.  Birth Defect Res C, 2016. V. 108: 65–84. doi:10.1002/bdrc.21123
|
Vascular diseases span diverse pathology, but frequently arise from aberrant signaling attributed to specific membrane-associated molecules, particularly the Eph-ephrin family. Originally recognized as markers of embryonic vessel identity, Eph receptors and their membrane-associated ligands, ephrins, are now known to have a range of vital functions in vascular physiology. Interactions of Ephs with ephrins at cell-to-cell interfaces promote a variety of cellular responses such as repulsion, adhesion, attraction, and migration, and frequently occur during organ development, including vessel formation. Elaborate coordination of Eph- and ephrin-related signaling among different cell populations is required for proper formation of the embryonic vessel network. There is growing evidence supporting the idea that Eph and ephrin proteins also have postnatal interactions with a number of other membrane-associated signal transduction pathways, coordinating translation of environmental signals into cells. This article provides an overview of membrane-bound signaling mechanisms that define vascular identity in both the embryo and the adult, focusing on Eph- and ephrin-related signaling. We also discuss the role and clinical significance of this signaling system in normal organ development, neoplasms, and vascular pathologies.
|
Кровеносные сосуды являются первыми структурами, формируемые эмбрионами позвоночных. Диффузия, предоставляющая питательные вещества и кислород раннему эмбриону, с его ростом становится недостаточной. Поэтому развитие сосудистой сети является критическим для развивающегося эмбриона и важной для поддержания тканей и систем органов у взрослых. Артерии имеют более толстую стенку из гладкомышечных клеток и слоев эластина между эндотелием и адвентицией; вены более тонкие с немногими гладкомышечными клетками и слоями эластина. Лимфатические сосуды важны для поддержания гомеостаза интерстициальной жидкости, иммунной функции и для абсорбции пищевого жира (Stacker et al., 2014). Сформированная из эмбриональных вен (Yang and Oliver, 2014), лимфатическая система млекопитающих состоит из двух типов сосудов: лимфатических капилляров и лимфатических собирающих сосудов (Jurisic and Detmar, 2009). Лимфатические капилляры - это тонкостенные сосуды с одиночным слоем из перекрывающихся эндотелиальных клеток, слепо заканчивающиеся в тканевом пространстве, чтобы абсорбировать интерстициальную жидкость. Лимфатические собирающие сосуды с контрактильными свойствами, поддерживаемыми с помощью гладкомышечных клеток (SMCs), в своих просветах они имеют клапаны, облегчающие транспорт лимфы против гидростатического давления в торакальном протоке (Baluk et al., 2007; Lynch et al., 2007; Scallan et al., 2013; Yang and Oliver, 2014).
Артериальные и венозные эндотелиальные клетки генетически предетерминированы на ранних стадиях ангиогенеза, со дня эмбриогенеза Е 8.5, т.е. до функционального кровотока во время эмбрионального развития (Andres et al., 1994; Bennett et al., 1995; Bergemann et al., 1995; Wang et al., 1998). Эндотелиальные клетки в разветвляющихся кровеносных сосудах дифференцируются в артерии и вены одновременно с экспрессией ими некоторых тирозин киназ, действующих как отличающие клеточные детерминанты; в частности, межмембранные взаимодействия между ephrinB2 лигандами на артериях и EphB4 рецепторами на венах являются критическими и достаточными детерминантами эмбриональной сосудистой сети (Wang et al., 1998). Экспансия сосудистой сети с функциональной артериальной и венозной системами также управляется взаимодействием между EphB4 рецепторами и его лигандом ephrinB2 (Fig. 1A). С другой стороны, предшественники эндотелиальных лимфатических клеток первоначально специфицируются в эмбриональные вены (Yang and Oliver, 2014). Эти предшественники продолжают дифференцироваться и созревать по мере отпочкования их от вен и продукции ими разбросанных примитивных лимфатических мешков, из которых и происходит лимфатическая сеть (Yang and Oliver, 2014). EphrinB2 был идентифицирован как важный регулятор собирающих лимфатических сосудов и лимфатических клапанов (Makinen et al., 2005).
Figure 1.
Schematic showing (A) details of EphB4 and ephrinB2 structures, as well as (B) bidirectional signaling induced by EphB4-ephrinB2 binding. Panel (C) depicts pathways leading to selective EphB4 or ephrinB2 expression guiding arterial-venous differentiation. PBM, PDZ binding motif; SH2, SRC homology 2; RBD, receptor-binding domain; LBD, ligand-binding domain; CRD, cysteine-rich domain; Sushi, short consensus repeat (SCR); EGF, epithelial growth factor; FNIII, fibronectin III; SAM, sterile alpha motif (Pasquale, 2008; Boyd et al., 2014). Рецепторы erythropoietin-producing hepatocellular (Eph) составляют самое крупное из 14 подсемейств receptor tyrosine kinases (RTK), и стимулируются с помощью ассоциированных с мембраной лигандов семейства ephrin. Eph рецепторы экспрессируются во всех зародышевых слоях и играют очень сложную и критическую роль в эмбриональном развитии различных органов позвоночных. Помимо участия в развитии сосудов Ephs и ephrins важны для ведения аксонов, клеточной миграции и сегрегации, образования границ тканей и топографического картирования (Kullander and Klein, 2002; Klein, 2012). Ephrins могут быть подразделены на два подкласса в зависимости от их структурных характеристик: ephrinA лиганды закреплены на поверхности клеток посредством glycosylphosphatidylinositol (GPI)-якорей, тогда как лиганды ephrinB вставлены в плазматическую мембрану посредством трансмембранного региона, сопровождаемого законсервированным цитоплазматическим доменом (Adams et al., 1999). Соотв., Ephs могут быть подразделены на EphA и EphB подклассы, базируясь на сходстве их последовательностей и сродству связывания ephrins (Gale et al., 1996).
Взаимодействия между Ephs и ephrins способствую различным клеточным реакциям, включая отталкивание, привлечение, адгезию и миграцию. Реакция отталкивания важна для ведения и сортировки клеток (Pitulescu and Adams, 2014). Поэтому эта функция отталкивания передачи сигналов Eph и ephrin, как полагают, способствует формированию границ органов в развивающемся эмбрионе. Мигрирующие клетки, экспрессирующие Eph рецепторы, движутся прочь от клеток, экспрессирующих определенные ephrin лиганды (Drescher et al., 1995; Nakamoto et al., 1996), хотя в некоторых контекстах передача сигналов Eph и ephrin может способствовать адгезии клеток (Holmberg et al., 2000; Dravis et al., 2004). Напр., топографическое картирование, механизм с помощью которого окончания аксонов организуют сами себя в определенные области мишени, регулируется или с помощью отталкивания или адгезивных/привлекающих сил посредством передачи сигналов Eph-ephrin.
Поскольку Eph рецепторы и ephrin лиганды закреплены на плазматической мембране, то вполне вероятно, что система Eph-ephrin функционирует во время межклеточных взаимодействий скорее, чем во время дально-действующих коммуникаций (Davis et al., 1994; Orioli and Klein, 1997; Adams et al., 1999). В этом контексте молекулы ephrin часто обнаруживаются в виде кластеров, обеспечивая тем самым более сильные стимулы для активации Eph рецептора (Davis et al., 1994) (Fig. 1B). Ephrin стимуляция рецепторов EphB4 посредством межклеточных контактов вызывает автофосфорилирование рецепторов, инициируя распространение разнообразных сигнальных каскадов ниже мембраны, характерных для тирозин-киназных рецепторов (Bae and Schlessinger, 2010). Передача нижестоящих сигналов от Eph рецепторов запутана, поскольку имеются разные сигнальные белки, содержащие домен Src homology 2 domain (SH2), который может взаимодействовать с двумя juxtamembrane остатками тирозина в цитоплазматическом домене Eph (Kalo and Pasquale, 1999). PI3K (Pandey et al., 1994), Src family kinase (Zisch et al., 1998), SLAP (Pandey et al., 1995), Grb2/10 (Stein et al., 1996), and PLCγ являются известными SH2-содержащими медиаторами передачи сигналов Eph.
Удивительно передача сигналов Eph-ephrin может быть двунаправленной. EphrinB2 действует как лиганд и одновременно как рецептор для EphB4; поэтому связывание и образование кластеров ephrins с Eph рецепторами может приводить к активации внутриклеточной передачи сигналов посредством как Eph рецептора (каноническая вперед направляемая передача сигналов), так и ephrin лиганда (обратная передача сигналов) (Holland et al., 1996; Bruckner et al., 1997; Kullander and Klein, 2002) (Fig. 1B). Обычно вперед направленная передача сигналов посредством Eph рецепторов генерирует отталкивающую клеточную реакцию для клеток, экспрессирующих ephrin, тогда как обратная передача сигналов посредством ephrin генерирует адгезивную реакцию (Kao et al., 2012). Эти реципрокные пути передачи сигналов между двумя типами сосудов, как полагают, являются критическими для ремоделирования эмбрионального ангиогенеза (Wang et al., 1998; Yancopoulos et al., 1998).
Хотя Ephs и ephrins впервые были распознаны как жизненно важные регуляторы развития эмбриональных сосудов, сегодня известно, что взаимодействия ephrinB2 и EphB4 остаются важными для ремоделирования и пластичности сосудов у взрослых (Gale et al., 2001; Kullander and Klein, 2002; Adams, 2003; Foo et al., 2006; Swift and Weinstein, 2009; Muto et al., 2010). Напр., процесс адаптации трансплантата вены к пост-хирургическому артериальному окружению характеризуется потерей венозного маркера EphB4, но без приобретения артериального маркера ephrinB2, это подтверждает пластичность качественных характеристик сосудов (Kudo et al., 2007). Паттерны экспрессии Eph и ephrin и последствия для ремоделирования сосудов могут быть фундаментально различны при др. клинически важных изменениях в ответ на гемодинамический ток, такой как нарушенный характер кровотока, обнаруживаемый в артериовенозных фистулах. Поскольку эти изменения ещё не были описаны, то возможно, что эти маркеры качественных особенностей сосудов продолжают играть критическую роль в сосудистой системе взрослых, при использовании трансляционного потенциала для сосудистых болезней и терапии у взрослых людей.
Лимфатическим сосудам уже были посвящены обзоры (Stacker et al., 2014; Yang and Oliver, 2014). Здесь мы сфокусируемся на доказательствах связей Ephs и ephrins с функциональной мембранной передачей сигналов и внутриклеточной сигнальной трансдукцией.
Arterial and Venous Identity from Development to Adulthood
Васкулогенез - это процесс формирования кровеносных сосудов de novo, которое впервые происходит во время самых ранних ст. эмбриогенеза. Васкулогенез начинается до начала сердцебиений; предшественники гемангиобластов из мезодермы мигрируют, агрегируют в виде кровяных островков и дифференцируются в эндотелиальные клетки, чтобы сформировать первые кровеносные сосуды (Risau and Flamme, 1995). Факторы, такие как vascular endothelial growth factors (VEGF), angiopoietins и basic fibroblast growth factor (bFGF), и рецепторы, такие как VEGF receptors, neuropilin1 и tie2, как полагают, служат главными медиаторами васкулогенеза (Moyon et al., 2001). Вследствие васкулогенеза артерии и вены дифференцируются, чтобы сформировать функциональную кровеносную систему. Этот вторичный процесс характеризуется разрастанием новых сосудов от предсуществующих и наз. ангиогенез. Эти отрастания или предсуществующие сосуды затем формируют петли и иерархические сети, приводя к образованию сосудистого ложа, поддерживающего функции жизнеспособности органов и тканей. В противоположность васкулогенезу, который в основном происходит во время эмбрионального развития, ангиогенез обычно является механизмом генерации новых сосудов у взрослых. Эти два механизма отличаются также от артериогенеза, формирования и созревания коллатеральных артерий для улучшения кровотока к областям гипоксии после закрытия артериального ствола у взрослых (Carmeliet, 2000; Simons and Eichmann, 2015).
Upstream Eph and Ephrin Signaling
Sonic Hedgehog-VEGF-Dll-Notch signaling
Sonic hedgehog (Shh) является транскрипционным фактором, первоначально открытым ка морфоген, участвующим в раннем формировании паттерна у развивающегося эмбриона, регулируя эпителиально-мезанхимные взаимодействия (Echelard et al., 1993; Chiang et al., 1996). Позднее была установлена важная роль Shh во время развития сосудов; эмбрионы, лишенные активности Shh, не способны обнаруживать артериальную дифференцировку (Lawson et al., 2001). В детерминированных в артерии эндотелиальных клетках Shh вызывает экспрессию VEGF (Lawson et al., 2002). Эмбрионы, лишенные активности Shh, неспособны экспрессировать VEGF внутри сомитов, а добавление экзогенного VEGF может восстанавливать экспрессию в сосудах ephrinB2. Shh способствует также ангиогенезу взрослых путем продукции комбинации ангиогенных факторов, включая VEGF, также, как и angiopoietins Ang1 и Ang2 (Pola et al., 2001). Итак, передача сигналов Shh-VEGF ответственна за индукцию артериальной дифференцировки предшественников эндотелиальных клеток при эмбриогенезе и у взрослых.
Члены семейства VEGF являются критическими регуляторами развития сосудов во время эмбриогенеза и строго активируют свои рецепторы на эндотелиальных клетках, способствуя росту кровеносных сосудов и сосудистой сети. 5 подтипов лигандов VEGF соединяются в виде перекрывающегося паттерна со своими тремя RTKs (VEGFR1-3), а также с ко-рецепторами, такими как neuropilins (Olsson et al., 2006). VEGFR1 регулирует миграцию моноцитов и макрофагов, тогда как VEGFR3 регулирует лимфангиогенез; VEGFR2 участвует во многих аспектах биологии эндотелиальных клеток, включая передачу сигналов формирования эмбриональных сосудов и регуляцию сосудистой проницаемости (Olsson et al., 2006).
Роль передачи сигналов VEGF-Dll-Notch в обеспечении дифференцировки артериального эндотелия хорошо известна (Lawson et al., 2001, 2002; Lanner et al., 2007). Соединение VEGF со своим гетеродимерным рецептором стимулирует путь Dll-Notch в эндотелии (Lawson et al., 2001, 2002). Градированная передача сигналов VEGF может влиять на экспрессию нижестоящих ephrinB2 и EphB4 (Lanner et al., 2007), подчеркивая роль Shh-VEGF как главного сигнала в сосудистой дифференцировке.
Передача сигналов VEGF регулирует также эндоцитоз, др. критический компонент передачи молекулярных сигналов. В эндотелии, ephrinB2 необходим для обеспечиваемого клатрином эндоцитоза VEGFR2, отвечающего за передачу сигналов с помощью своего лиганда VEGF (Pitulescu and Adams, 2014). Напротив, ephrinB2 противодействует клатрином-обеспечиваемому эндоцитозу platelet-derived growth factor (PDGF) receptor β в сосудистых SMCs, тем самым обеспечивается баланс активации PDGF с помощью разных путей сигнальной трансдукции (Pitulescu and Adams, 2014).
Система передачи сигналов Dll-Notch высоко законсервированный механизм, используемый многоклеточными организмами, чтобы контролировать клеточные судьбы посредством межклеточных взаимодействий (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). У позвоночных имеются 4 гетеродимерных, трансмембранных рецептора (Notch1-4) и 5 лигандов (Jagged1, Jagged2, Dll1, Dll3, and Dll4). Поскольку большинство Notch лигандов также являются трансмембранными белками, то рецепторы обычно запускаются только в случает непосредственного контакта с соседними клетками.
Путь передачи сигналов Notch важен для управления дифференцировкой артериальных эндотелиальных клеток, при этом лиганд Dll4 оказывается одним из первых идентифицированных специфичным для артерий маркером (Shutter et al., 2000). В отсутствие передачи сигналов Dll4 или Notch сосудистые эндотелиальные клетки обнаруживают гиперпролиферативный фенотип, ведущий к сосудистым аномалиям (Hellstr?m et al., 2007; Siekmann et al., 2013). Следовательно, судьба венозных клеток оказывается классическим самопроизвольным путем развития сосудов при отсутствии активации передачи сигналов Notch; позднее было предположено, что венозный путь не является самопроизвольным, а скорее находится под активным контролем chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2 (COUP-TFII), после супрессии передачи сигналов Notch (You et al., 2005). Лимфатическая судьба также регулируется с помощью COUP-TFII и Notch пути. Подавление активности Notch приводит к увеличению количества предшественников лимфатических эндотелиальных клеток, подтверждая, что передача сигналов Notch является негативным регулятором спецификации лимфатических эндотелиальных клеток (Murtomaki et al., 2013).
Многочисленные трансгенные исследования с использованием модельных организмов, таких как рыбки данио, выявили пространственно-временные детали, когда и где происходит активация Notch во время дифференцировки сосудистых эндотелиальных клеток. Поскольку активация Notch поддерживается в предназначенных для артерий эндотелиальных клетках во время эмбриогенеза (Quillien et al., 2014), некоторые Notch активированные клетки затем подавляют передачу сигналов Notch и участвуют в венозном ремоделировании. Т.о., Notch, по-видимому, активен во время инициации и поддержания артериальных характеристик во время эмбриогенеза.
Dll-Notch продолжает стимулировать путь приобретения артериальной судьбы в эмбриональных сосудистых клетках путем повышения экспрессии ephrinB2 с одновременной супрессией экспрессии EphB4; т.о., Dll-Notch предупреждают приобретение венозной судьбы (Siekmann and Lawson, 2007). Во время адаптации венозного трансплантата к артериальному окружению у крыс экспрессия и Dll4 и Notch4 подавляется и на устаревшем фоне, подтверждая, что Dll4-Notch путь может быть также активен при ремоделировании вен у взрослых (Kondo et al., 2011).
COUP-TFII
COUP-TFII является транскрипционным фактором, критическим для становления венозных качественных особенностей во время эмбрионального развития сосудов. COUP-TFII также известен NR2F2 (nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2), орфановый член сверхсемейства стероидных рецепторов; COUP-TFII обнаруживает разную экспрессию в разных тканях и служит выполнению разных функций при развитии органов, в биологи опухолей, дифференцировке стволовых клеток и в метаболизме липидов и глюкозы (Takamoto et al., 2005; Xu et al., 2008; Hu et al., 2013; Qin et al., 2013). COUP-TFII экспрессируется на высоком уровне в эндотелии эмбриональных и взрослых вен, но не в артериальных эндотелиальных клетках (You et al., 2005; Cui et al., 2015). Первичная венозная спецификация происходит под контролем этого транскрипционного фактора, путем супрессии передачи сигналов Notch (You et al., 2005). Предложена рабочая модель поддержания венозных характеристик: во время эмбриогенеза, COUP-TFII в венозном эндотелии подавляет VEGF и его ко-рецептор neuropilin1, предупреждая активацию пути Notch, тем самым устраняется супрессия экспрессии EphB4, без индукции экспрессии ephrinB2 (You et al., 2005; Fancher et al., 2008) (Fig. 1C).
COUP-TFII выполняет многообразные роли в регуляции некоторых патофизиологических функций в кровеносных сосудах взрослых, помимо своей роли артериально-венозной спецификации в эмбриональном развитии. Супрессия COUP-TFII в венозных эндотелиальных клетках облегчает переключение фенотипа в направлении proatherogenic и повышает чувствительность к эпителиально-мезенхимному переходу, приводя в последствии к остеогенезу и отложению кальция; в результате усиления воспаления и подавления антитромботических сигналов (Cui et al., 2015). Как член семейства ядерных рецепторов, активность COUP-TFII может регулироваться малыми молекулами (Kruse et al., 2008), которые могут оказаться привлекательными для фармакологического воздействия и поступательных использований для снижения neointimal гиперплазии и атеросклероза.
Functions of EphB4 and EphrinB2 During Vascular Development
Blood Vessel Sprouting
Разрастания (sprouting) кровеносных сосудов представлены двумя разными клеточными популяциями с отличающимся поведением: кончиковые клетки и клетки ствола. Роль кончиковых клеток в ангиогенезе впервые была описана у эмбрионов перепела (Kurz et al., 1996). Эндотелиальные кончиковые клетки перемещаются по безсосудистой ткани, за ними следуют клетки ствола (Siekmann et al., 2013). Следуя за кончиковыми клетками, клетки ствола формируют базу для разрастания и поддерживают связь с родительским сосудом, приводя в конечном счете к образованию иерархической сети, которая обеспечивает эффективное кровоснабжение ткани (Geudens and Gerhardt, 2011). Спецификация кончиковых клеток и клеток ствола находится под контролем передачи сигналов Dll-Notch (Potente et al., 2011). Недавнее исследование показало, что neuropilin-1 является критическим нижестоящим эффектором Notch в спецификации tip/stalk клеток во время ангиогенеза (Aspalter et al., 2015).
Angiogenic Cell Migration and Axon Guidance
Градированное внеклеточное распределение VEGF-A руководит поведение кониковых клеток и клеток ствола (Hellstr?m et al., 2007). VEGF-A стимулирует эндотелиальные клетки дифференцироваться в кончиковые клетки. Однако, стоящая ниже передача сигналов Dll-Notch действует, чтобы ограничивать поисковое поведение кончиковых клеток. Поведение кончиковых клеток во время ангиогенеза сходно с таковым для ростовых конусов аксонов во время роста нейритов и они обладают некоторыми общими сигналами наведения, такими как Semaphorin-Plexin, Netrin-Unc и Slit-Robo лиганд-рецептор парами (Weinstein, 2005; Larrivee et al., 2009; Siekmann et al., 2013). Недавно, получение time-lapse изображений и отслеживание генетических клонов показали специфичность миграторного поведения кончиковых клеток во время регенеративного ангиогенеза в артериях (Xu et al., 2014). Предназначенные стать кончиковыми клетками из венозных эндотелиальных клеток, они изменяют направления своей миграции обратно в сосудистое сплетение. Такое поведение обеспечивается с помощью функции chemokine-receptor Cxcr4a-Cxcl12a (Xu et al., 2014).
Arterial/Venous Segregation
Белки Eph и ephrin экспрессирующиеся реципрокно во многих тканях во время развития. Исследования заднего мозга показали, что передача сигналов Eph-ephrin вносит вклад в формирование границ при развитии органов (Fraser et al., 1990; Guthrie et al., 1993; Xu et al., 1995, 1999). Эти функции обеспечиваются посредством регуляции актинового цитоскелета, функции кадгерина и интегрином-опосредуемой адгезии (Batlle and Wilkinson, 2012). Eph-ephrin контролирует динамику актинового цитоскелета, приводя к изменениям в форме клеток или реакции отталкивания (Klein, 2012). Интересно, что комплементарная экспрессия ephrinB и EphB достаточна, чтобы сегрегировать перемешивающиеся клетки, поддерживая четкие границы путем усиления адгезии внутри специфических регионов и путем отталкивания по линии границы (Batlle and Wilkinson, 2012).
Formation of the Vasculature Requires Eph-Ephrin Signaling
Передача сигналов EphB4-ephrinB2 необходима для образования первых двух осевых сосудов, дорсальной аорты и кардинальной вены. У эмбрионов рыбок данио ангиобласты первоначально формируют одиночный предшественник сосуда, который экспрессирует и ephrinB2 и EphB4. Вентральная миграция EphB4-позитивных эндотелиальных клеток приводит к отделению дорсальной аорты от кардинальной вены путем отталкивания от ephrinB2-позитивных клеток (Herbert et al., 2009). У мышей, кардинальная вена образуется путем отрастания (sprouting) EphB4-позитивных эндотелиальных клеток от ранней дорсальной аорты, которая содержит ephrinB2-позитивные, EphB4-позитивные и недетерминированные клетки предшественники (Pitulescu and Adams, 2014).
EphrinB2 и EphB4 экспрессируются реципрокно в артериях и венах желточного мешка эмбрионов мыши (Wang et al., 1998). Интересно, что артериальный маркер ephrinB2 экспрессируется также в собнаборе вен тканей новорожденного человека и при патологической артериолизации у взрослых (Diehl et al., 2005). Соотв., в пупочном канатике полностью сформированного плода человека, наблюдается экспрессия ephrinB2 в венах, а также в артериях, вместе с дополнительным артериальным маркером neuropilin1; экспрессия венозного маркера EphB4 наблюдается в венах, но в значительно меньше степени и в артериях (Fig. 2).
Figure 2.
Representative photomicrographs showing expression of the venous identity marker EphB4 and the arterial identity markers ephrinB2 and neuropilin1 in full term human umbilical cord artery and vein. Black arrowheads indicate positive signals. Scale bar 50 &nano;m. Генетическая делеция EphB4 или ephrinB2 приводит к некоторым существенным сердечно-сосудистым дефектам у мышей, включая нарушения ангиогенеза желточного мешка (Wang et al., 1998). Более того, данные in vivo показали, что делеция цитоплазматического хвоста ephrinB2 вызывает сходные эффекты в фенотипе мышей, как и при отсутствии целого белка, подтверждая, что цитоплазматический домен ephrinB2 необходим для ремоделирования в иерархическую сосудистую систему (Adams et al., 2001). Т.о., обратная передача сигналов ephrinB2 может быть необходима для ремоделирования эмбриональной сосудистой сети.
EphB4 and EphrinB2-Associated Signaling
Белки Eph и ephrin взаимодействуют с рядом др. лиганд/рецептор молекул на и под клеточной мембраной, регулируя трансформацию внешне-средовых сигналов под нужды развития органов. Эта регуляторная система функционирует совместно с др.; напр., эндотелий постнатальных сосудов также высвобождает некоторые растворимые цитокины, включая регуляторы ремоделирования внеклеточного матрикса и вазоактивные молекулы, регулирующие ремоделирование сосудистой стенки. Эти системы интегрируются, чтобы регулировать адаптацию сосудов к механическим стрессам, таким как кровоток, давление и натяжение (Rothuizen et al., 2013; Lu et al., 2014) (Fig. 3).
Figure 3.
Schematic showing signaling pathways downstream of EphB4 regulate vascular remodeling. MMP2/9, matrix metalloproteinase 2/9; Src, proto-oncogene tyrosine-kinase kinase; Cav1, caveolin1; PI3K, phosphatidylinositol-3-kinase, eNOS, endothelial nitric oxide synthase; PKG, cGMP-dependent protein kinase; MEK, mitogen-activated protein kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase; Erk, extracellular signal-regulated kinases.
Caveolin1
Caveolae and caveolin1.
Кавеолы являются бутылко-образными инвагинациями с диаметром в 60- 80 nm, которые располагаются вдоль плазматической мембраны (Bruns and Palade, 1968). Эти уникальные наноструктуры распознаются на поверхности многих типов клеток, включая эндотелиальные клетки, фибробласты и адипоциты. Кавеолы являются микро-доменами мембраны, богатыми холестерином и сфинголипидами, которые служат как сигнальные платформы для облегчения временной и пространственной локализации различных событий сигнальной трансдукции включая эндоцитоз, регуляцию липидов и ремоделирование сосудов. Конечно, различные сигнальные молекулы, включая Eph рецепторы, по-видимому, усиливают свою передачу сигналов путем локализации внутри кавеол (Rivera et al., 2009).
Кавеолины были идентифицированы как основной компонент кавеол в 1990s (Rothberg et al., 1992; Tang et al., 1996). N и C концы кавеолина располагаются в цитоплазме, тогда как гидрофильный сегмент в 33 аминокислоты вставлен в плазматическую мембрану, образуя предположительной форму шпильки (Dupree et al., 1993). Среди трех изоформ caveolin (Cav1, Cav2 и Cav3), Cav1 является главным каркасным белком кавеол и необходим для сборки кавеол (Drab et al., 2001). Др. компоненты, такие как cavins и Pacsin2, также были распознаны как важные для формы и функции кавеол (Aboulaich et al., 2004; Hill et al., 2008; Hansen et al., 2011; Walser et al., 2012).
Изоформа Cav1 особенно многочисленна в эндотелиальных клетках и наиболее изучена. Cav1 регулирует различные эндотелиальные функции, включая трансцитоз, проницаемость, сосудистый тонус и ангиогенез (Frank et al., 2003; Woodman et al., 2003). В эндотелиальных клетках, Cav1 присутствует во всей васкулатуре, тогда как Cav3 обнаруживается в артериальных, но не венозных сосудах (Segal et al., 1999), обнаруживая разное распределение изоформ кавеолинов.
Caveolae as a mechano-sensor at membrane.
В целом, кавеолы многочисленны в клетках, подвергающихся механическим стрессам, таких как мышцы, фибробласты и эндотелиальные клетки (Nassoy and Lamaze, 2012; Parton and del Pozo, 2013). Клетки реагируют на острые механические стрессы разборкой и посторной сборкой кавеол (Sinha et al., 2011). Доставка и организация кавеол в этих процессах тонко регулируются с помощью регуляторов стрессовых волокон (Echarri and Del Pozo, 2015).
В эндотелиальных клетках Cav1 взаимодействует с большим количеством сигнальных молекул, которые участвуют в сдирающими стрессами обусловленной активации, включая G белки, тирозин киназы, GTPases, eNOS и некоторые компоненты пути MAPK (Smart et al., 1999; Gratton et al., 2004). Эти наблюдения показывают, что Cav1 и/или кавеолы служат в качестве кровотоком активируемых механических сенсоров в кровеносных сосудах. В частности, кавеолы ощущают течение поверхностью, обращенной в просвет, в эндотелиальных клетках; Cav1 нокаутные мыши обнаруживают нарушения регуляции сдирающих стрессов артериального диаметра, и эти эффекты восстанавливаются при повторной экспрессии эндотелиального Cav1 (Yu et al., 2006). Это четкое генетическое доказательство подтверждает важную роль Cav1 в механо-трансдукции гемодинамических сил в кровеносных сосудах. Интересно, что количество кавеол на клеточной поверхности увеличивается в адаптированных к кровотоку эндотелиальных клетках; , однако, продолжительное воздействие ламинарного сдирающего стресса изменяет распределение, но не экспрессию Cav1 внутри эндотелия in vitro (Rizzo et al., 2003), подтверждая пространственно-временную сложность экспрессии Cav1 в ответ на механические стрессы.
Это доказательство подтверждает, что эндотелиальные кавеолы являются эффективным средством модуляции передачи сигналов с клеточной поверхности, это происходит в условиях измененного кровотока. Однако, поскольку Cav1 имеет и другие функции, помимо каркасной внутри кавеол (Pol et al., 2004), то интерпретация результатов потери функции Cav1 д. производиться с осторожностью.
Cav1 tyrosine 14 phosphorylation.
Cav1 исходно был идентифицирован как главный фосфорилированный по тирозину субстрат для Src киназы, поскольку фосфорилирование по тирозину Cav1 по Y14 ассоциирует трансформацией вируса саркомы (Glenney, 1989; Glenney and Soppet, 1992). В раковых клетках фосфорилирование тирозина в Cav1 индуцирует биогенез кавеол посредством актин-зависимой механотрансдукции, вместе с инактивацией Cav1-супрессирующего транскрипционного фактора early growth response (Egr)-1 (Joshi et al., 2012). Фосфорилирование Cav1 происхтодит также в ответ на стимуляцию ростового фактора интегрином обусловленной механотрансдукции (Mastick et al., 1995; Kim et al., 2000; Lee et al., 2000; Fielding et al., 2004; Radel and Rizzo, 2005). Src-обеспечиваемое фосфорилирование Cav1 обязательно для трансактивации индуцируемого натяжением epidermal growth factor receptor (EGFR), это приводит к Akt фосфорилированию (Zhang et al., 2007). Эти данные указывают на то, что фосфорилирование Cav1 играет важную роль в адаптации клеток, подвергающихся механическим стрессам от кровотока или натяжения.
Interaction between Cav1 and Eph receptors.
Cav1 взаимодействует с несколькими рецепторными тирозин киназами. Семейство Eph RTKs транслоцируется на и располагается внутри кавеол в тесной близости от Cav1 (Couet et al., 1997; Yamamoto et al., 1998; Lajoie et al., 2007). Более конкретно EphB1 рецепторы располагаются в кавеолах и непосредственно взаимодействуют с Cav1 после стимуляции лигандом; Cav1 обеспечивает нижестоящую ERK передачу сигналов EphB1 рецептора (Vihanto et al., 2006). Более того, EphA2 также взаимодействует с Cav1.
В изолированных эндотелиальных клетках дикого типа стимуляция передачи сигналов EphB4 приводит к повышению фосфорилирования Cav, миграции эндотелиальных клеток и продукции nitric oxide (NO) production (Muto et al., 2011). Однако, эти эффекты были снижены в эндотелиальных клетках, происходящих от гетерозиготных EphB4 мышей. Это наблюдение показывает, что Cav1 является нижестоящим медиатором передачи сигналов EphB4, регулируя, по крайней мере, функции эндотелиальных клеток in vitro. В мышиных моделях венозных трансплантатов элиминация Cav1 устраняет истончение венозного трансплантата в ответ на стимуляцию EphB4, подтверждая, что Cav1 является критическим медиатором функции EphB4 in vivo (Muto et al., 2011). Как таковой, Cav1 является важным нижестоящим медиатором передачи сигналов EphB4 in vitro и in vivo .
Interaction with eNOS.
Структура белка eNOS облегчает двойное ацилирование, нацеленное на цитоплазматический аспект комплекса Гольджи и на плазмалеммные кавеолы (Sessa et al., 1995; Garcia-Cardena et al., 1996). Исследования с помощью иммуно-преципитации показали, что вблизи всех eNOS в эндотелиальных клетках собираются Cav1 (Feron et al., 1996). На одной стороне кавеолы, Cav1 каркасный домен служит в качестве эндогенного негативного регулятора функции eNOS (Bernatchez et al., 2011). В частности, phenylalanine 92 (F92) является критическим для этого ингибирующего действия Cav1 на eNOS. Активность eNOS подавляется в условиях покоя реципрокным способом путем взаимодействия с Cav1, приводя к более низкой базовой продукции NO (Garc?a-Carde?a et al., 1997; Ju et al., 1997; Michel et al., 1997). Поскольку целенаправленное вмешательство в ингибирующее действие Cav1 усиливает высвобождение NO (Bernatchez et al., 2011), то такая специфическая стратегия может быть ценной для сердечно-сосудистых болезней, характеризующихся дефицитом NO.
Interaction with TGF-β signaling.
Cav1 является также важным негативным регулятором передачи сигналов TGF-β (Razani et al., 2001). Передача сигналов TGF-β обычно выполняет важную роль в клеточной дифференцировке, при этом приобретение окончательного фенотипа часто зависит от прекращения передачи сигналов TGF-β (Moses and Serra, 1996). Caveolins, включая Cav1, часто экспрессируются в окончательно дифференцированных клетках в чувствительных к TGF-β клонах (Scherer et al., 1997). Следовательно, супрессирующая с помощью Cav1's регуляция передачи сигналов TGF-β может быть важным механизмом для контролируемого ходя онтогенетических событий в органах, включая сосуды (Razani et al., 2001).
TGF-β участвует в патологических процессах в сосудах взрослых. TGF-β является мощным стимулятором отложения внеклеточного матрикса во время ранних стадий адаптации венозного трансплантата; усиление передачи сигналов TGF-β способствует расширению прогрессивной фибротической neointimal гиперплазии (Jiang et al., 2009). Передача сигналов TGF-β является также принципиальным путем регуляции эндотелиально-мезенхимного перехода, важного компонента ремоделирования венозного трансплантата у мышей и возможно у человека (Cooley et al., 2014). Однако, известно недостаточно о том, может ли Cav1 ослаблять чувствительное к TGF-β патологическое ремоделирование сосудов.
Phenotype of Cav1-/- mice.
Генетическая делеция Cav1 приводит к полной потере кавеол у мышей. Фенотип таких мышей характеризуется сердечными и легочными аномалиями, нарушениями липидного метаболизма и и дисфункцией eNOS (Drab et al., 2001; Razani and Lisanti, 2001), подчеркивая важность функции Cav1 в жизни взрослых. Однако, полная потеря кавеол не является летальной. Cav1 нокаутные мыши даже плодовиты и выглядят в основном нормальными. Эти наблюдения подтверждают, что если существуют компенсаторные пути, то они не находятся внутри кавеол, поскольку Cav1 необходим для сборки кавеол (Parton, 2001). Недавнее исследование сообщило о делеции Cav1 у грызунов и выявило удивительное предотвращение возникновения аневризмы абдоминальной аорты у Ang II-BAPN co-infusion модели (Takayanagi et al., 2014), подтвердив активное участие Cav1 в сосудистой патологии взрослых.
Akt
Путь PI3K-Akt выполняет критическую роль в регуляции разных клеточных функций, таких как клеточная жизнеспособность, пролиферация и метаболизм. PI3K является потенциальным партнером по связыванию Eph рецептора, поскольку субъединица p85 обладает C-терминальным SH2 доменом, который способен взаимодействовать с Eph рецепторами; в частности, PI3K соединяется с EphA2 рецептором (Pandey et al., 1994).
Steinle et al. (2002) описали, что стимуляция EphB4 с помощью специфического лиганда ephrinB2/Fc усиливает миграцию и пролиферацию микрососудистых эндотелиальных клеток человека. Эти эффекты подавляются в присутствии PI3K или Akt-ингибиторов, подтверждая, что путь PI3K-Akt играет одну из центральных ролей в передаче сигналов EphB4 в эндотелиальных клетках и при ремоделировании сосудов.
eNOS
eNOS-производимый NO играет важную роль во многих физиологических и патологических сердечно-сосудистых событиях (Forstermann and Sessa, 2012). Многие исследования показали, что EphB4 регулирует высвобождение NO в эндотелиальных клетках. При стимуляции ephrinB2/Fc увеличиваются фосфорилирование eNOS и продукция NO в эндотелиальных клетках человека (Wong et al., 2014), тогда как мышиные эндотелиальные клетки, происходящие от гетерозиготных по EphB4 мышей, высвобождают меньше NO по сравнению с диким типом (EphB4+/+) эндотелиальных клеток (Jadlowiec et al., 2013).
Мы показали, что eNOS, скорее всего, является важным нижестоящим медиатором передачи сигналов EphB4, которая возникает во время венозной адаптации к артериальному окружению (Wang et al., 2015). Стимуляция EphB4 с помощью мономерного ephrinB2/Fc или собранного в кластеры ephrinB2/Fc приводит к увеличению фосфорилирования eNOS, продукции NOи клеточной миграции in vitro; эти эффекты устранялись в присутствии ингибитора eNOS. Это подтверждает. что EphB4 регулирует функции эндотелиальных клеток с помощью фосфорилирования eNOS . В мышиной модели венозных трансплантатов, потеря EphB4 во время адаптации венозного трансплантата ассоциировала с повышением активности eNOS aи адаптивным истончение стенки венозного трансплантата (Wang et al., 2015).
Противоречивым наблюдением является то, что EphB4 стимулирует фосфорилирование eNOS in vitro, в то время как уменьшает ассоциацию EphB4 с повышенной активностью eNOS в венозных трансплантатах in vivo. Возможно, что имеются разные медиаторы, участвующие в регуляции пути EphB4-eNOS in vivo, это влечет за собой более сложную смесь разных клеточных популяций и взаимодействий по сравнению с изолированными эндотелиальными клетками in vitro. Напр., известно, что активность eNOS приводит к продукции NO, это, в сою очередь, позволяет индуцировать активацию Src. Т.к. Src стимулирует фосфорилирование Cav1, то повышение взаимодействия eNOS-Cav1 негативно регулирует фосфорилирование eNOS (Chen et al., 2012). Др. потенциальный медиатор, Ephexin (Eph-interacting exchange protein), фактор обмена гуанинового нуклеотида для Rho GTPases, который был идентифицирован в качестве белка, взаимодействующего с Eph-рецептором при двугибридном скрининге у дрожжей. Eph рецепторы модулируют активность Ephexin и приводят к активации Rho киназы (Shamah et al., 2001). Однако, Rho киназа может непосредственно супрессировать eNOS (Sugimoto et al., 2007), или может негативно регулировать активность eNOS посредством Akt (Ming et al., 2002). Итак, eNOS играет важную роль в качестве эффектора передачи сигналов EphB4, подчеркивая, что путь EphB4-eNOS является потенциальной привлекательной мишенью для терапевтических манипуляций по ремоделированию сосудов.
ERK1/2
Путь передачи сигналов MAPK ERK стоит ниже VEGF и связан с пролиферацией и миграцией клеток. ERK является нижестоящим медиатором EphB4, поскольку стимуляция ephrinB2/Fc в микроваскулярных эндотелиальных клетках человека вызывает фосфорилирование ERK1/2 (Steinle et al., 2002). Однако, также известно, что EphB4 трансдуцирует ephrinB2 сигнал посредством разных нижестоящих эффекторных молекул, чтобы позитивно или негативно регулировать путь ERK в разных типах клеток, отражая сложность передачи сигналов EphB4 (Xiao et al., 2012). ERK обеспечивает EphB4-регулируемую эндотелиальную пролиферацию; однако, эта активация MAPK, скорее всего, не зависит от Ras, поскольку ингибирование Ras не снижало вызываемой ephrinB2/Fc клеточной пролиферации (Steinle et al., 2002). Кроме того, EphB4-зависимое содействие в миграции эндотелиальных клеток не ослабляется при ингибировании ERK, подтверждая, что ERK не участвует в EphB4-обеспечиваемой миграции (Steinle et al., 2002).
Примечательно, что путь передачи сигналов ERK является частью пути сигнальной трансдукции EphB4 не только в эндотелиальных клетках, но и также в печеночных сателлитных клетках. EphB4 стимулирует продукцию VEGF и привлечение синусоидальных эндотелиальных клеток посредством пути ERK, и этот эффект является независимым от Akt (Das et al., 2010). Сходные пути могут существовать в разных типах клеток, напр., активация EphB4 приводит к подавлению пути Ras-MAPK-ERK в сосудистых эндотелиальных клетках человека, тогда как оно вызывает активацию того же самого пути в клетках рака груди (Xiao et al., 2012).
Others
Многие члены семейства Src киназ являются многообещающими нижестоящими кандидатами передачи сигналов Eph в нервной системе. Активация EphB4 с помощью экзогенного лиганда в сосудистых эндотелиальных клетках может вызывать фосфорилирование Src. Src ответственна за EphB4-регулируемую миграцию эндотелиальных клеток, но не пролиферацию (Steinle et al., 2002).
EphB4-обеспечиваемая регуляция миграции эндотелиальных клеток использует также MMP2 и MMP9. Т.к. эти MMPs вызывают деградацию коллагена базальной мембраны, то активация MMP2/9, скорее всего, усиливает миграцию эндотелиальных клеток (Steinle et al., 2002). EphB4 может регулировать фосфорилирование MMP2/9 посредством Akt сигнального пути, т.к. EphB4 может активировать Akt, и активность Akt коррелирует с активацией MMP2/9 (Kim et al., 2001; Park et al., 2001).
Pericyte Dynamics During Vascular Development
Помимо эндотелиальных клеток, перициты и сосудистые SMC являются важными компонентами сосудистой системы. В отличие от эндотелиальных клеток эти пристеночные клетки мезенхимного происхождения. Перициты являются periendothelial поддерживающими клетками, которые удлиняются вокруг эндотелиальных клетки функционально участвуют в стабилизации и созревании разрастающихся сосудов во время ангиогенеза (Stapor et al., 2014). Они были описаны в 1873 фр. физиологом Charles Marie-Benjamin Rouget и с тех пор были известны как "Rouget's cells," позднее переименованы в "pericytes" в 1923 (Zimmermann, 1923). Расположенные вдоль базальной мембраны, перициты взаимодействуют с эндотелиальными клетками, чтобы регулировать диаметр капилляров (Gerhardt and Betsholtz, 2003). Эндотелиальные клетки рекрутируют перициты посредством передачи паракринных сигналов PDGF-B/PDGFR-β во время разрастания капилляров (Hellstrom et al., 1999; Lindblom et al., 2003).
У взрослых SMC в артериях и венах помогают сосудам противостоять радиальным силовым воздействиям кровотока и выполняют специфическую функцию сокращения, что позволяет обеспечивать сосудистый тонус, чтобы регулировать диаметр сосудов, кровяное давление и распределение крови (Owens et al., 2004). Потеря или фенотипические изменения SMC участвуют в патогенезе болезней человека, таких как образование аневризм, атеросклероз, системная гипертензия и рак (Slavin and Gonzalez-Vitale, 1976; Owens et al., 2004).
Экспрессия ephrinB2 предопределяет генетические различия между артериями и венами не только в эндотелиальных клетках, но и в пристеночных клетках на поздних ст. эмбриогенеза и взрослых (Gale et al., 2001; Shin et al., 2001), дальнейшим подтверждением роли ephrinB2 служит образование артериального медиального слоя. Эти наблюдения подтверждают также разные механизмы, регулирующие время начала экспрессии ephrinB2 в эндотелиальных клетках и в пристеночных клетках мезенхимного происхождения. Передача сигналов Notch также критически участвует в развитии SMC, помимо её роли в артериальной дифференцировке эндотелиальных клеток (Simons and Eichmann, 2015).
Перициты постоянно распознаются как потенциальные мишени для про- и анти-ангиогенной терапии. Однако, исследования перицитов затруднены из-за отсутствия стандартизированного и эффективного метода выделения этих клеток. Maier et al. (2010) предложили новый метод культивирования перицитов из плаценты человека.
Membrane Signaling in Human Vascular Physiology and Pathophysiology
Vein Graft Adaptation
Трансплантаты вен остаются золотым стандартом, используемым хирургами для лечения тяжелых болезней закупорки артерий. Воздействие на венозный трансплантат артериального давления, кровотока и напряжения кислорода приводит к адаптивному ремоделированию венозной ткани, а именно, к утолщению венозной стенки и дилятации просвета. Процесс ремоделирования это сложный баланс пролиферации и миграции клеток, запрограммированной клеточной гибели и изменений внеклеточного матрикса. Эти события контролируются хорошо скоординированными сигнальными путями, активируемыми, по крайней мере, частично с помощью воздействия на венозный эндотелий повышенного сдирающего стресса, вызываемого артериальным кровотоком (Mitra et al., 2006).
Скмейство Eph RTK является критическим сигнальным путем, участвующим в ремоделировании трансплантата вены. Исследования на человеке показали, что экспрессия венозного детерминанта, EphB4, снижается в трансплантате вены по сравнению с нативными венами (Kudo et al., 2007) (Fig. 4). Исследования Ex vivo вен saphenous человека подтвердили, что повышенный сдирающий стресс приводит к потере экспрессии EphB4 (Berard et al., 2013; Model et al., 2014). Адаптация трансплантата вены у модельных животных также происходит и обнаруживает сходное снижение экспрессии EphB4 в трансплантатах вен (Mitra et al., 2006; Kudo et al., 2007; Muto et al., 2011).
Figure 4.
Representative photomicrographs showing immunoreactivity of EphB4 (green) and smooth muscle actin (SMA) (red), 3 weeks after vein graft placement in aged rats; counterstained with DAPI (blue). White arrowheads indicate positive signals for EphB4. Scale bar 50 µm. Экспрессия и активность в венозном трансплантате EphB4 у модельных грызунов обнаруживают, что EphB4 является активным медиатором ремоделирования трансплантатов вен. siRNA подход подтвердил, что снижение экспрессии EphB4 ассоциирует с увеличением толщины стенки венозного трансплантата, подтверждая, что EphB4 является ингибитором утолщения стенки (Kudo et al., 2007). Непосредственная стимуляция EphB4 рецепторов с использованием специфического лиганда ephrinB2/Fc приводит к удержанию экспрессии EphB4и утончению стенки венозного трансплантата (Muto et al., 2011). Сходные находки были также продемонстрированы с помощью избыточной экспрессии EphB4 рецепторов с использованием вирусного вектора; напротив, снижение передачи сигналов EphB4 у гет ерозиготных по EphB4 мышей ассоциировало с утолщением стенки трансплантататвены (Muto et al., 2011).
Модель венозного трансплантата мыши также предоставляет доказательства передачи сигналов через Cav1 как важную для EphB4-обеспечиваемой адаптации трансплантатов вен (Muto et al., 2011). Cav1 снижается в трансплантатах вен по сравнению с нативными венами, аналогично снижению экспрессии EphB4. Повышенная экспрессия или активность EphB4 приводит к усилению фосфорилирования Cav1, тогда как снижение EphB4 приводит к снижению фосфорилирования Cav1. Трансплантаты вен, происходящие от Cav1 нокаутных мышей имеют уменьшенную толщину стенки и они нечувствительны к специфической стимуляции EphB4, подтверждая, что Cav1 является важным компонентом передачи сигналов EphB4 во время ремоделирования трансплантата вены (Muto et al., 2011).
Продукция NO, также нижестоящего медиатора EphB4-зависимого ремоделирования венозного трансплантата, снижена (Muto et al., 2011; Wang et al., 2015). В трансплантатах вен с пониженной активностью EphB4, обнаруживается снижение фосфорилирования eNOS (Jadlowiec et al., 2013). NO является известным регулятором толщины стенки венозного трансплантата (Kibbe et al., 2001) , а животные модели, лишенные eNOS обнаруживают подавление ремоделирования (Wang et al., 2015).
Ростовые факторы, стоящие выше пути Eph-ephrin также влияют на адаптацию венозного трансплантата. Среди них VEGF особенно важен (Hayashi et al., 2005). Мышиные модели адаптации венозных трансплантатов обнаруживают временное увеличение экспрессии VEGF-A, а затем её подавление (Kudo et al., 2007). Последствия временного повышения VEGF-A в венозных трансплантатах остаются неясными, т.к. повышение VEGF-A ассоциирует с повышенной пролиферацией и гиперплазией интимы в некоторых исследованиях (Kudo et al., 2007), и, как было установлено, является защитным при ингибировании гиперплазии интимы венозного трансплантата у модельных кроликов (Luo et al., 1998).
В то время как качественные особенности вен, определяемые экспрессией EphB4, теряются во время адаптации венозных трансплантатов, артериальные характеристики не появляются. У человека и крыс венозные трансплантаты не приобретают артериальных маркеров ephrinB2, Dll4 или Notch4 (Kudo et al., 2007), хотя в недавнем сообщении утверждалось, что Dll4 в макрофагах способствует возникновению повреждений в венозных трансплантатах (Koga et al., 2015). Эти результаты подтверждают, что хотя венозный трансплантат делается толще и ремоделируется в артериальных условиях, вена не трансформируется в артериальный сосуд; венозный трансплантат не имеет ни "arterial", ни "venous" характеристик.
Семейство mitogen activated protein kinase (MAPK) способствует клеточной пролиферации, дифференцировке и подвижности, а передача сигналов MAPK усиливается во время ремоделирования трансплантата вены. Множественные исследования продемонстрировали, что ингибирование MAPK в венозных трансплантатах животных приводит к снижению гиперплазии интимы (Zhao et al., 2014; Evans et al., 2015). Путь phosphatidyl-inositol 3-kinase-Akt (PI3K-Akt) также модулирует ремодулирование трансплантата вены; активация PI3k-Akt способствует выживанию клеток и белковому синтезу путем активации нижестоящих сигналов, включая белок mammalian target of rapamycin (mTOR) (Mitra et al., 2006).
Функциональные последствия активации этих сигнальных путей, скорее всего, приводят к активации SMC (Muto et al., 2007); поэтому наблюдается повышенное отложение и миграция SMC из окружения венозного трансплантата в интиму, хотя потенциальные источники этих SMC спорны. Предложены рабочие модели иные, чем дифференцировка in situ, включая миграцию и транс-дифференцировку адвентициальных фибробластов, моноцитов/макрофагов, а также циркулирующих в крови стволовых клеток (Welt and Rogers, 2002; Muto et al., 2007). Околососудистые фибробласты также могут превращаться в миофибробласты, SMC-подобные клетки, которые обладают миграторной и синтетической способностью (Shi et al., 1996, 1997). Эти активированные SMC ассоциируют с повышенным отложением внеклеточного матрикса и вкладом в утолщение новой интимы (Westerband et al., 2001; Siow et al., 2003; Mitra et al., 2006).
После того как вена хирургически имплантируется в артериальные условия, то факторы, которые регулируют и отличают благоприятное адаптивное ремоделирование от патологического ремоделирования, остаются плохо изученными (Lu et al., 2014; Owens et al., 2015). Наружное ремоделирование и утолщение стенки являются важными для созревания и функции венозного трансплантата, тогда как избыточное утолщение приводит к гиперплазии новой интимы и остается ведущей причиной отторжения трансплантируемой вены (Collins et al., 2012). Паталогическая гиперплазия новой интимы, как полагают, вызывается повреждениями эндотелия в результате хирургических манипуляций, ишемии и повышенного сдирающего стресса от артериального кровотока. Раньше после имплантации трансплантата тромбоциты прилипали к областям повреждения эндотелия и высвобождали воспалительные цитокины, включая PDGF, TGF-β, цитокины, такие как IL-1, IL-6 и IL-8, и тромбин (Ishiwata et al., 1997; Muto et al., 2010; Collins et al., 2012; Lu et al., 2014). Затем рекрутировались и активировались лейкоциты, способствуя в дальнейшем воспалительному ответу (Owens et al., 2015). В конечном итоге SMC становятся более подвижными и рекрутируются в области эндотелиальных повреждений. Это в результате увеличивает клеточную пролиферацию и отложение внеклеточного матрикса в этих метах. Эти события ослабляют восстановление интактного эндотелия, подчеркивая важность повреждений эндотелия как пускового механизма патологического ремоделирования (Mitra et al., 2006).
Placenta, Bone, and Cancer
EphrinB2 и EphB4 также обнаруживаются в тканях, таких как плацента, кости и в опухолях (Table 1).
Table 1. Effects of EphB4 and ephrinB2 in Cancer, Bone, and Placental Physiology
Source (Cell line) Findings References
Cancers
Breast Cancer
(MCF10-B4) EphB4 overexpression enhances migration, invasion,
and colony formation; ephrinB2 reverses these effects via a forward
signaling pathway Rutkowski et al., 2012
Prostate Cancer
(PC3, PC3M, DU145, ALVA31, LAPC-4, LNCaP, CWR22R)
(22Rv1) EphB4 expression is high in PC3 and higher in its metastatic
form, PC3M
EphB4 overexpression enhances migration, invasion, and colony formation;
ephrinB2 reverses these effects via a forward signaling pathway
Xia et al., 2005, Rutkowski et al., 2012
HNSCC
(SCC-15) Inhibition of EphB4 in tumor cells leads to reduced cell number,
apoptosis and activation of the death receptor-caspase pathway
Masood et al., 2006
Melanoma
(K1735, SW1, M2, P, C19, C23) High EphB4 expression enhances metastatic
and migratory potential Yang et al., 2006
Kaposi's Sarcoma EphrinB2 is necessary for survival of KS cells
Masood et al., 2006
Angiosarcoma Increased EphB4 expression Dill et al., 2012
Skeletal System
Osx/LacZ+ precursor cells, Col1/LacZ+ mature osteoblasts
Osx/LacZ+ cells closely colocalized with cartilage-invading vessels
Maes et al., 2010
Placenta
(HIPEC-65, BeWo) Expression of EphB4 and ephrinB2 is induced
by hypoxia (HIPEC-65 and BeWo);
induction of ephrinB2 expression is independent of HIF-1alpha (BeWo)
Chennakesava et al., 2006
Severe pre-eclamptic human placentas
(HUVEC, BeWo) Increased miR-17, miR-20a, and miR-20b expression
Inhibition of miR-20b expression increased IF1A, MMP2, ephrinB2
and EphB4 expression Wang et al., 2012
The Placenta
Успешное развитие и поддержание маточно-плацентраной сосудистой сети является жизненно важным для развития эмбриона и зависит от взаимодействия между EphB4 и ephrinB2. В матке мыши EphB4 и ephrinB2 экспрессируются динамически в спиральных артериях, маточных естественных клетках киллерах и трофобласте на 6.5 to 12.5 день беременности, указывая на их роль в модификации спиральных артерий и в механизмах патологической беременности из-за аномального развития спиральных артерий (Dong et al., 2016). Плацента структурно состоит из цитотрофобластов (CTB) и синцитиотрофобласта (STB) (Mi et al., 2000). STB формирует границу ворсинок в контакте с материнской децидуальной оболочкой и облегчает обмен питательными веществами и газами между матерью и плодом. CTB, с др. стороны, предоставляет источник пролиферирующих и миграторных стволовых клеток, которые в конечном итоге устанавливают кровообращение между маткой и плацентой. В плаценте человека Makikallio et al. (2005) обнаружили, что циркуляция эмбриональной крови присутствует на 7 неделе развития с резким увеличением скорости кровотока, без изменения полного сосудистого сопротивления после 10 недель развития. Эти изменения, как известно, управляются с помощью ангиогенеза, васкулогенеза и их соотв. медиаторов.
При исследовании инструментальной роли Ephs и Ephrins в спецификации клеточных судеб и миграции в плаценте человека, Chennakesava, et al. (2006) установили, что взаимодействие EphB4-ephrinB2 зависит от стадии беременности. EphB4 и ephrinB2 экспрессируются на высоком уровне в плаценте первого триместра, но снижаются к моменту рождения. На 7 неделе беременности, EphB4 преимущественно обнаруживается в синцитиальном клеточном слое ворсинок; подлежащий CTB слой лишь слега позитивен по EphB4. Вне ворсинок EphB4 обнаруживается в одиночных мезенхимных клетках. Эндотелиальные клетки вновь сформированных капилляров, однако, лишены экспрессии EphB4 рецептора. Вне ворсинок экспрессия EphB4 наивысшая в гигантских клетках CTB. Напротив, в 7 недель экспрессия ephrinB2 одинаково сильная в CTB и STB клеточных слоях ворсинок. отсутствуют различия в распределении экспрессии между цитоплазмой и ядрами CTB. Экспрессия EphB4 и ephrinB2 стабилизируется на 12 неделях и сильно уменьшается к рождению в плаценте человека.
Паттерны экспрессии EphB4 и ephrinB2 в плаценте также, по-видимому, ассоциирует с некоторыми плацентарными болезнями. Пре-эклямпсия затрагивает 5 - 8% от всех беременностей человека и характеризуется новым началом гипертензии и протеинурии (Redman and Sargent, 2005; Kanasaki and Kalluri, 2009). При эклямпсии немногие трофобласты проникают в матку и те, которым это удается проникают неглубоко (Goldman-Wohl and Yagel, 2002). Wang et al. (2012) экстрагировали мРНК из тканей ворсинок плаценты здоровых рожденных в срок и с тяжелей пре-эклямпсией и установили, что miRNA-17, -20a, и -20b были существенно повышены в плацентах беременных с пре-эклямпсией. miR-20b была установлена как непосредственная мишень EphB4 и ephrinB2, и экспрессировалась преимущественно в синцитии и некоторых ворсинках STB в плацентах после родов, но не в капиллярных эндотелиальных клетках. Интересно, что плацентарная ephrinB2 мРНК достоверно подавлена при пре-эклямпсии по сравнению с нормальной беременностью.
Эти исследования подтверждают, что экспрессия ephrinB2 и EphB4 контролируется, варьирует во времени и преимущественно экспрессируется типами клеток, участвующими в становлении циркуляции между маткой и плацентой.
The Skeletal System
Eph- и Ephrin-обеспечиваемая передача сигналов, как полагают, влияет на прогрессирование некоторых болезней, таких как остеоартрит (Kwan Tat et al., 2008, 2009), ревматоидный артрит (Kitamura et al., 2008), множественные миеломы (Pennisi et al., 2009) и остеосаркома (Varelias et al., 2002; Fritsche-Guenther et al., 2010). В костях, взаимодействия Eph рецептора и ephrin лиганда обеспечивают пролиферацию, миграцию, прикрепление, распространение и дифференцировку остеобластов и остеокластов из клеток предшественников. В дифференцирующихся остеокластах выявлены мРНК ephrinB1 и ephrinB2; остеобласты свода черепа постоянно экспрессируют несколько ephrinB лигандов, EphB рецепторов и EphA4 (Zhao et al., 2006); их взаимодействия происходят во время сомитогенеза, а также черепно-лицевого развития и развития конечностей (Matsuo and Otaki, 2012). Взаимодействия между EphB4 и ephrinB2 также обеспечивают общение между стромальными и гематопоэтическими клетками во время ремоделирования кости, репарации переломов и при артритах (Zhao et al., 2006; Maes et al., 2010; Valverde-Franco et al., 2012; Nguyen et al., 2015).
Во время развития мезенхимные клетки конденсируются и дифференцируются в хондроциты, чтобы сформировать лишенные сосудов хрящевые модели будущих костей. Хондроциты внутри хряща затем дифференцируются в гипертрофические хондроциты, которые продуцируют VEGF, чтобы стимулировать ангиогенез (Matsuo and Otaki, 2012). Остеобласты появляются в окружении перихондрия и генерируют временный кортекс кости. Происходит инвазия сосудов в хрящевую матрицу и способствует становлению первичных центров оссификации внутри кости. Эндотелиальные клетки и остеокласты накапливаются в надхрящнице, проникают и разъедают хрящ, тогда как остеобласты и клетки костного мозга проникают в высоко васкуляризованную область (Karsenty and Wagner, 2002; Kronenberg, 2007). Maes et al. (2010) показали, что проникновение EphB4-позитивных, ephrinB2-позитивных предшественников остеобластов в развивающиеся кости интимно связано с их инвазией кровеносными сосудами. Эти находки подтверждают, что могут существовать механизмы с участием совместных перемещений, которые специфичны для ранних клеток в остеобластном клоне и теряются после успешной дифференцировки в остеобласты.
Остеобласты с двойной экспрессией EphB4 и ephrinB2, скорее всего, являются одним фактором, который управляет развитием и заживлением кости, а аберрантная экспрессия или передача сигналов могут быть фактором, участвующим в разных патологиях костей.
Cancers
Устойчивый ангиогенез это один из многих характерных признаков рака (Hanahan, 2000), а измененные паттерны экспрессии EphB4 и ephrinB2могут способствовать опухолевому росту и образованию новых сосудов. Kaposi sarcoma (KS) один из таких примеров. KS это мультифокальная ангио-пролиферативная болезнь, базирующаяся на эндотелиальных клетках (Gill et al., 1994). Masood et al. (2005) показали, что ткань KS и клеточные линии имеют артериальный фенотип, при этом наблюдается обильная экспрессия ephrinB2, но очень мало или отсутствует EphB4. Инфекция венозных эндотелиальных клеток с помощью HHV-8 или VEGF приводи к фенотипическому переключению с EphB4 на ephrinB2; ингибирование ephrinB2 с использованием внеклеточного домена EphB4, слитого с сывороточным альбумином человека (sEphB4-HSA) подавляет миграцию и инвазию клеток KS in vitro (Scehnet et al., 2009).
Однако, повышенная экспрессия EphB4 также ассоциирует с некоторыми раковыми опухолями. Напр., при head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), 6 из 7 изученных линий клеток HNSCC (SCC-4, -9, -12, -13, -15, -25, -71) имеют функциональный EphB4, регулируемый с помощью передачи сигналов EGFR посредством Akt (Masood et al., 2006). Xia et al. (2005) установили, что экспрессия EphB4 наивысшая в метастатической форме клеточной линии рака простаты prostate cancer cell line 3 (PC3M), и установили, что экспрессия EphB4 локализуется в неопластическом эпителии, тогда как он отсутствует в нормальных железах. Анализ экспрессии генов показал, что EphB4 экспрессируется в 64 из 72 (89%) случаев.
В линиях клеток рака простаты и молочных желез Rutkowski et al. (2012) показали, что избыточная экспрессия EphB4 в клетках вызывает усиленный независимый от закрепления рост, миграцию и инвазию. Важно, что эти эффекты обращались обратно в присутствии ephrinB2, это приводило к снижению уровней белка EphB4, демонстрируя, что зависимая от лиганда передача сигналов является супрессирующей для опухоли.
Оценка эффектов EphB4's внеклеточного домена на лиганд ephrinB2 в линиях опухолевых клеток (Noren et al. 2004) показала, что EphB4 привлекает эндотелиальные клетки in vitro и стимулирует инвазию, жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток, т.е. критических для ангиогенеза функций. Эти данные подкрепляют модель, согласно которой EphB4 способствует опухолевому росту путем стимуляции ангиогенеза с помощью ephrinB2.
Сходным образом, в высоко злокачественной линии меланомы, Yang et al. (2006) показали, что эти клетки экспрессируют очень высокие уровни EphB4. Рецептор фосфорилируется по тирозину и затем ассоциирует с Src; увеличивая уровень активированного EphB4 путем воздействия на медленно мигрирующие клетки меланомы ephrinB2/Fc, существенно повышающего их миграторную способность.
Vascular Tumors
Гемангиомы являются доброкачественными опухолями и довольно распространены у детей, затрагивая около 10% детей (Waner et al., 2003). Опухоли быстро пролиферируют во время первого года жизни, затем постепенно исчезают. Calicchio et al. (2009) показали, что пролиферативная фаза гемангиом характеризуется незрелыми эндотелиальными клетками и соседними перицит-подобными клетками. Инволюция, с др. стороны, характеризуется апоптозом эндотелия, дилятацией сосудистого просвета, уплощение эндотелиальных клеток, потерей митотической активности, утолщением базальной мембраны и исчезновение капилляров. В пролиферирующих гемангиомах имеется повышенная транскрипция Tie2, Jagged1, и Notch4; однако, обнаруживается повышение EphB3, а не EphB4, рецепторов (Calicchio et al., 2009).
Ангиосаркомы сильно злокачественные сосудистые опухоли эндотелиального происхождения с высокой смертностью 79-83%, благодаря их быстрому росту и метастазированию (Mark et al., 1996; Lahat et al., 2010); эти опухоли, как полагают, возникают в результате трансформации эндотелиальных клеток или из циркулирующих стволовых клеток (Young et al., 2010). Иммуногистохимический анализ образцов ангиосаркомы кожи человека выявил в мембранах EphB4 в 42% (10 of 24) случаев (Fig. 5), подтверждая роль EphB4 в патогенезе и поведении ангиосаркомы. Передача сигналов выше EphB4 также участвует; анализ нокаутов Notch1 у мышей показал повышенную экспрессию EphB4 в печеночном синусоидальном эпителии, с повышенным ангиогенезом, пролиферацией и портальной гипертензией, возникающих в результате синусоидальной capillarization и ангиосарком
(Dill et al., 2012).
Figure 5.
Photomicrographs showing representative histology of human skin angiosarcoma. (A) Hematoxylin and eosin (H&E) staining; (B) CD31 immunolocalization using a mouse monoclonal antibody (catalog no. M0823, Dako); (C) EphB4 immunolocalization using a rabbit monoclonal antibody (catalog no. #14960, Cell Signaling Technology). Assessment of EphB4 immunoreactivity in human skin angiosarcoma showed 42% of cases were positive; n = 24. Scale bars 5µm.
Photomicrographs showing representative histology of human skin angiosarcoma. (A) Hematoxylin and eosin (H&E) staining; (B) CD31 immunolocalization using a mouse monoclonal antibody (catalog no. M0823, Dako); (C) EphB4 immunolocalization using a rabbit monoclonal antibody (catalog no. #14960, Cell Signaling Technology). Assessment of EphB4 immunoreactivity in human skin angiosarcoma showed 42% of cases were positive; n = 24. Scale bars 5µm. Гемангиомы и ангиосаркомы две сосудистые патологии эндотелиального происхождения, затрагивающие разные популяции и имеющие разные исходы. Их молекулярные основы связаны с сигнальными путями определения сосудистых характеристик. Необузданная экспрессия EphB4 или ephrinB2 при разных раковых опухолях часто определяет агрессивный фенотип с важными последствиями для пациентов.
Conclusions and Future Perspectives
Over the past 20 years, there has been significant progress in defining the mechanisms that underlie determination of embryonic vessel identity, with the establishment of Eph-ephrin interactions as critical for vascular development and biology. Several of the signaling pathways that guide embryonic development are also active in adult vessels, and continue to show plasticity and pathology in adults. These findings have been clinically translated with successful inhibition of tumor vessels (Boyd et al., 2014). Continued clinical success for strategies to alter membrane signaling for management of disease will rely on furthering our understanding of the molecular basis for these processes.
|