Базируясь на мета-анализе, мы наблюдали 7 ассоциированных локусов для 5 лицевых признаков: ширина основания черепа (cranial base width) (Fig 1A), ширина между углами глаз (canthalwidth) (Fig 1H), ширина носа (Fig 1K), длина крыльев носа (nasal ala length) (Fig 1N) и глубина верхней части лица (upper facial depth) (Fig 1B). Наиболее достоверной из них, meeting the strict study-wide превысившей порог достоверности (т.e., p < 5 x 10^-9), была ассоциация ширины основания черепа с 20q12 410kb нижестоящим MAFB, транскрипционным фактором, ранее обнаружившим участие в orofacial расщеплениях [29] и связь с лицевыми характеристиками в семьях с расщеплением [30]. Однако, MAFB SNP, ассоциированный с расщеплением, был на расстоянии в 250kb от обнаруженного места и не был в LD с SNP, наблюдаемым здесь. Помимо orofacial расщеплений мутации в MAFB вызывали синдром multicentric carpotarsal osteolysis, который включал легкие лицевые аномалии. Эти фенотипы согласуются с ролью MAFB в регуляции миграции клеток краниального нервного гребня во время формирования паттерна скелетно-мышечных признаков головы [31].Эти доказательства подтверждают возможную роль MAFB в нормальной изменчивости лица.

Др. ассоциация для ширины основания черепа наблюдалась с регионом 14q21.1 вблизи PAX9, SLC25A2, MIPOL1 и FOXA1. Гомеодоменовый белок, кодируемый PAX9 важен для черепно-лицевого развития у мышей [32,33] и развития зубов у людей [34]. Используя in situ гибридизацию, Peters et al. [32] показали, что Pax9 экспрессируется по всему развивающемуся основанию черепа у мышей на ст. E13.5. Биологические доказательства для др. генов в этом регионе также предполагают возможную роль в лицевой изменчивости MIPOL1, который обнаруживается затронутым хромосомными аберрациями у пациентов с черепно-лицевыми фенотипами, включая голопрозэнцефалию [35]. Поскольку глопрозэнцефалия связана с альтерациями в горизонтальном пространственном распределении лицевых структур, то варианты генов, ассоциированных с этими состояниями, могут также влиять на размер ширины основания черепа у здоровых субъектов. Итак, эти предварительные наблюдения подчеркивают возможность генетических вариантов в этом регионе, влияющих на изменчивость нормального лица.

Две генетические ассоциации наблюдались для ширины между внутренними углами глаз. Одна из них была связана с регионом 1p13.3 внутри гена GSTM2, который кодирует энзим, участвующий в детоксификации соединений. Среди генов внутри 250kb пикового сигнала находятся два потенциально пригодных гена кандидата, GNAI3 и ALX3. Мутации в GNAI3, который кодирует субъединицу G белка, участвующую в формировании паттерна фарингеальных дуг, вызывают auriculocondylar синдром, редкое черепно-лицевое нарушение [36,37], хотя гипер- и гипотелоризм не были специфически описаны. ALX3 - это гомеобоксный ген, важный для развития головы и лица. Мутации в ALX3 приводят к frontonasal dysplasia 1 [38] у людей и расщеплению носа у мышей [39]. Глазной гипертелоризм является приметным признаком фронтоназальной дисплазии и, как полагают, является результатом нарушений в пути передачи сигналов Hedgehog [40,41]. Вторая ассоциация с шириной между глаз обнаруживается для широкого 900kb LD блока на Xq13.2. Пик диффузной ассоциации сигнала приходится на PABP1C1L2A, который кодирует пока не охарактеризованный poly-A связывающий белок. Однако, на краю LD блока, приблизительно в 500kb к центромере от пикового сигнала находится HDAC8, который кодирует гистоновую деацетилазу, участвующую в эпигенетическом замалчивании генов во время черепно-лицевого развития [42]. Мутации в HDAC8 вызывают синдром Cornelia de Lange [43,44], нарушение развития, характеризующееся лицевой дисморфологией, включая гипертелоризм. Мутация в HDAC8 также была описана в семье с синдромом X-сцепленной умственной отсталости с характерными признаками лица, включающими гипертелоризм [45].

Ряд др. генетических ассоциаций с лицевыми признаками наблюдался в локусах, содержащих гены с подходящими биологическими ролями. Напр., ассоциация с шириной носа наблюдалась с регионом 20p11.22 вблизи гена PAX1 . Мутации в PAX1 вызывают otofaciocervical синдром [46], характеризующийся лицевой дисморфологией, включая специфические признаки носа, такие как запавший корень носа и чрезмерное сужение. PAX1 играет роль в дифференцировке хондроцитов [47], это может объяснить его ассоциацию с шириной носа, величиной расстояния между левой и правой хрящевыми носовыми крыльями. Тем не менее изучение экспрессии Pax1 у мышей показало экспрессию в фарингеальных дугах на ст. E11.5, но не в развивающихся обонятельных плакодах [48], так что пока неясно, как эти гены влияют на развитие носа. Ассоциация с длиной носовых крыльев наблюдалась с 14q11.2 в регионе, содержащем кластер генов RNase плюс еще около 25 др. генов (внутри приблизительно 400kb пика ассоциации). Среди множества генов в этом регионе находятся ZNF219, который кодирует транскрипционного партнера для Sox9, важного для хондрогенеза у мышей [49], и ген CHD8, мутации которого ассоциированы с нарушениями спектра аутизма, сопровождаемыми микроцефалией и характерными лицевыми признаками, включая широкий нос [50]. Сходная история касается ассоциации между SNPs в регионе 11q22.1 и глубиной верхней части лица (upper facial depth). Пик сигнала приходится н TRPC6, который кодирует субъединицу катионного канала, мутантную при наследственной почечной болезни [51]. TRPC6 не имеет известной связи с черепно-лицевым развитием, но др. гены в этом регионе обнаруживают черепно-лицевую экспрессию, включая YAP1 [52].

Мы наблюдали ряд генетических ассоциаций вблизи генов с возможными биологическими ролями в изменчивости лица. Общей темой является то, что ассоциированные локусы содержат гены, участвующие в синдромах с черепно-лицевыми фенотипическими отклонениями. Это согласуется с давно известной гипотезой о взаимоотношении между Менделирующими синдромами и комплексом признаков, в которых общераспространенны варианты вблизи генов, вызывающих Менделирующие синдромы, участвуют в родственных общераспространенных сложных болезнях , и признаках, включая нормальную фенотипическую изменчивость [53]. Можно сказать, для любой из наблюдаемых ассоциаций, остается неясным, какой вариант может быть функциональным, поэтому мы полагаем, что функциональные варианты, лежащие в основе статистического сигнала д. быть регуляторными. Более того, неясно, какие гены они регулируют. Поэтому ссылки на участвующие гены д. быть осторожными.

Поскольку ни один из наших геномных или предполагаемых (p < 5 x 10^-7) сигналов, включая SNPs, не участвовал в предыдущих двух GWA исследованиях [17,18], но мы тем не менее нашли доказательства ассоциации, когда мы тестировали наивысшие SNPs из этих исследований в сравнении с фенотипами из наших данных. Наиболее сильной из них была длина крыльев носа, измерение боковой проекции носа, зависимой от величины от угла alar хряща к кончику носа, ранее обнаруживавшей ассоциацию с 1p36.32 (rs4648379, PRDM16) [18] или 3p14.3 (rs1982862, CACNA2D3 [17]. Мы установили, что, по крайней мере, незначительные ассоциации с обоими этими регионами присутствуют в наших данных, при этом в одном случае (rs4648379, PRDM16) обнаружено доказательство p = 1.70 x 10^-5. Оба предыдущих GWA исследования сообщили об ассоциации между SNPs в 2q35 (PAX3) и морфологией межорбитальной (interorbital) перегородки. Мы протестировали эти SNPs и установили ассоциацию между rs974448 и шириной между углами глаз (p = 0.002), это привело к некоторому дополнительному подтверждению утверждения, что широко распространенные варианты в PAX3 могут влиять на аспекты нормальной лицевой морфологии.

Наша способность тестировать уже описанные генетические ассоциации ограничена из-за отсутствия прямо сравниваемых фенотипов, которые связаны с различиями методах сборки данных и типом и количеством доступных измерений. Кроме того, два предыдущих Европейских GWA исследования, каждый использовал модельности изображений (imaging modalities), отличающиеся от типа, использованного здесь. Сходные факторы могут также объяснить некоторые расхождения в результатах ассоциаций, обнаруженных между нашей и двумя др. когортами. Хотя со всей тщательностью был измерен тот же самый набор расстояний в обеих когортах, разные 3D камеры и протоколы определения признаков могли дать иные результаты паттернов. Несмотря на эти различия, измерения обеих когорт были очень сходны в их общих дистрибутивах. Альтернативные фенотипы, такие как мультивариантные измерения формы лиц, могли быть также использованы в этих типах исследований. Однако, прежние попытки экстрагировать форму изменчивости из характерных признаков и данных поверхности в сходного размера выборках (напр., используя Procrustes-based методы) пока не дали статистически достоверных ассоциаций [17,18]. Одной из причин этого может быть то, что эффект любого одиночного гена растворяется, поскольку результирующие фенотипы представляют собой такую сложную смесь локальных и глобальных признаков формы. Проблема очень сложная и в настоящее время имеется мало совпадений (consensus) при большинстве благоразумных подходов к сложному лицевому фенотипированию [54]. По счастливой случайности некоторые многообещающие подходы возникли на горизонте, такие как BRIM методы, разработанные Claes et al. [28]. Вполне возможно, что выборки на порядок величин крупнее, чем пока доступные, будут необходимы прежде, чем мы начнём эксплуатировать богатство, содержащееся в 3D лицевых базах данных человека.

Несмотря на эти ограничения, мы получили доказательства генетической ассоциации между хромосомными регионами, содержащими гены с важными ролями в развитии лица, и количественными признаками, которые характеризуют ключевые особенности нормального черепно-лицевого комплекса человека. Помимо улучшения нашего общего знания факторов, лежащих в основе разнообразия лицевых форм, наблюдаемые нами у людей эти генотип-фенотип ссоциации могут помочь нам лучше понять широкий диапазон фенотипической экспрессии и тяжесть, наблюдаемую при некоторых редких генетических синдромах. Распространенные варианты при ряде разных генов или регуляторных элементов могут вносить вклад в выраженность дисморфных фенотипов, присутствующих при таких состояниях. Более того, такие ассоциации у здоровых индивидов могут иметь целью изучение сигналов для этиологии многих более распространенных черепно-лицевых аномалий. Напр., три признака, описанные здесь (ширина основания черепа, ширина носа и расстояние между углами глаз) все они ранее были использованы в качестве потенциальных фенотипических факторов риска для orofacial расщеплений, наиболее распространенного врожденного черепно-лицевого дефекта у людей [55]. Weinberg et al. [15,56] показали, что незатронутые, но генетически подвергнутые риску, родственники индивидов с расщеплениями, обнаруживают увеличение ширины средней и верхней части лица. Идентификация генов, которые влияют на эти признаки, может помочь идентифицировать важные модификаторы риска для расщеплений [16]. Тестирование SNPs, участвующих здесь в ассоциациях в наших семьях с расщеплениями будущая цель нашей группы исследования.