Посещений:
КЛЕТКИ НЕРВНОГО ГРЕБНЯ



Роль Hoxb5

Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells
• Mandy K. M. Kam, • Vincent C. H. Lui
Development, Growth & Differentiation Volume 57, Issue 2 February 2015 Pages 158–168

Neural crest cells (NC) are a group of multipotent stem cells uniquely present in vertebrates. They are destined to form various organs according to their anterior-posterior (A-P) levels of origin in the neural tube (NT). They develop into a wide spectrum of cell lineages under the influence of signaling cascades, neural plate border genes and NC specifier genes. Although this complex gene regulatory network (GRN) specifies the fate of NC and the combinatory action of Hox genes executed at the time of NC induction governs the patterning of NC for the formation of specific structures along the A-P axis, not much information on how GRN and Hox genes directly interact and orchestrate is available. This review summarizes recent findings on the multiple roles of Hoxb5 on the survival and cell lineage differentiation of vagal and trunk NC cells during early development, by direct transcriptional regulation of NC specifier genes (Sox9 and Foxd3) of the GRN. We will also review findings on the transcriptional regulation of Ret by Hoxb5 in the population of the vagal NC that are committed to the enteric neuron and glia lineages. Functional redundancy between Hox proteins (Hoxa5 and Hoxc5) from the same paralogue group as Hoxb5, and the cooperative effects of Hox cofactors, collaborators and transcription factors in the Hoxb5 transcriptional regulation of target genes will also be discussed.


Рисунки к статье

Клетки нервного гребня (NC) уникальны для позвоночных, они представляют группу временных, мультипотентных и миграторных стволовых клеток (Kalcheim & Le Douarin 1999). NC генерируется в месте соединения между дорсальными частями нервной трубки (NT) и не нейральной эктодермой, мигрирует на периферию и дает различные клеточные клоны в большинстве тканей (Knecht & Bronner-Fraser 2002; Cheung et al. 2005; Hao & Young 2009; Bronner & LeDouarin 2012; Le Douarin & Dupin 2012; Mayor & Theveneau 2013). В ответ на внешние факторы, включая bone morphogenetic proteins (BMP), fibroblast growth factors (FGF), Wnt (Wingless and Int), Delta/Notch и ретиноевую кислоту, экспрессия на границе нервной пластинки генов спецификаторов (напр. Msx1/2, Pax3/7 и Zic) и спецификаторов NC (напр. AP2-α, Id3, Msx1, Pax3, Snail1, Snail2, Sox10, Foxd3 и Sox9) усиливается на дорсальных частях нервных складок, чтобы сформировать качественные характеристики NC (Duband et al. 1995; Knecht & Bronner-Fraser 2002; Meulemans & Bronner-Fraser 2004; Stuhlmiller & Garcia-Castro 2012).
В соответствии с переднезадними (A-P) уровнями в NT, из которой они происходят, клетки NC могут быть классифицированы на несколько типов. Кпереди от сомита 1: краниальный NC вносит вклад в кости, хрящи, соединительную ткань головы и зубы (Sauka-Spengler & Bronner 2010). Ме6жду сомитами 1-7: вагусный NC, дает энтерическую нервную систему (ENS) и кардиальный тракт оттока (Sauka-Spengler & Bronner 2010). Между сомитами 7-28: туловищный NC дифференцируется в симпатические ганглии и клетки, продуцирующие norepinephrine, надпочечников (Sauka-Spengler & Bronner 2010). Сомиты после 28: крестцовый NC дает часть ENS дистальной части кишечника (Serbedzija et al. 1991; Burns & Douarin 1998; Kapur 2000; Anderson et al. 2006; Nagy et al. 2007; Hao & Young 2009; Sauka-Spengler & Bronner 2010). Парасимпатические нервные клетки, генерируются краниальными и крестцовыми клетками NC, тогда как др., происходящие из NC клетки, подобно пигментным клеткам кожи, Шванновским клеткам и сенсорным нейронам, генерируются NC на всех A-P уровнях (Sauka-Spengler & Bronner 2010).
Кроме того, существуют детерминированные по-разному клетки на разных уровнях A-P в NC. В частности, вагусный NC способен формировать ENS, но туловищный NC неэффективен в этом отношении (Zhang et al. 2010). Вагусныхй NC приобретает способность формировать ENS после дальнейшего программирования во время миграции в переднюю кишку. Это может использовать системы передачи сигналов Hedgehog и ретиноевой кислоты, которые усиливают экспрессию Ret вагусного NC (Reichenbach et al. 2008; Simkin et al. 2013).
Аномалии, обусловленные дефектами развития NC, известны как neuroscristopathies. Нейрокристопатии могут быть: (i) неопластическими (напр. нейробластома или меланома); и (ii) дисгенетическими (врожденные болезни, подобные болезни Гиршпрунга и синдрому DiGeorge) (Bolande 1997). Ряд нейрокристопатий ассоциированы с Hox генами. Напр., аномально развитый, происходящий из NC краниальный скелет и краниальные ганглии описаны у мышей с кондиционной делецией Hoxa1 (Redline et al. 1992) и у мышей с мутантным Hoxa2 (Gendron-Maguire et al. 1993); и у Hoxa3-/- мышей, имеющими фенотип сходный с синдромом DiGeorge у людей, с черепно-лицевыми, тироидными и сердечными дефектами (Manley & Capecchi 1995; Bolande 1997).

Hox genes


Hox гены кодируют семейство регуляторов транскрипции, которые осуществляют программы развития вдоль A-P оси животных, детерминируя основные структуры и ориентацию в организме (McGinnis & Krumlauf 1992). Hox белки обладают общим в 60 аминокислот гомеодоменом, и они осуществляют разнообразные регуляторные функции в многочисленных процессах посредством связывания ДНК в специфических сайтах и в результате регуляции транскрипции их генов мишеней (McGinnis & Krumlauf 1992).
Hox гены были открыты у Drosophila, где они существуют в виде двух отдельных кластеров генов, а именно, Antennapedia и Bithorax комплексы (Kaufman et al. 1980; Lewis et al. 1980). Впоследствии, Hox были обнаружены у позвоночных, включая лягушек, птиц, млекопитающих, человека и у всех животных с билатеральной симметрией (Carrasco et al. 1984; McGinnis et al. 1984; Boncinelli et al. 1989; Duboule 1994).
У млекопитающих всего 39 Hox гена подразделены на 4 кластера Hoxa, Hoxb, Hoxc и Hoxd, которые располагаются на 4 разных хромосомах (Shashikant et al. 1991; Krumlauf 1994; Manley & Capecchi 1997, 1998). Благодаря сходству последовательностей Hox гены подразделены на 13 групп паралогов (Fig. 1). Начало экспрессии Hox связано с элонгацией эмбриона вдоль A-P оси, и Hox гены экспрессируются в виде перекрывающихся доменов с пространственным сдвигом передних границ экспрессии вдоль NT (Duboule & Morata 1994; Carpenter 2002; Akin & Nazarali 2005; Durston et al. 2011). Пространственная A-P экспрессия упорядочивает Hox гены в NT точно так же каков их пространственный 3' - 5' порядок вдоль хромосомы, при этом первый или наиболее 3' расположенный ген каждого кластера экспрессируется на переднем конце развивающегося организма (Fig. 1). Hox гены экспрессируются в NT во время индукции NC, и один и тот же набор Hox генов экспрессируется NC, из которого они возникли (Lumsden & Krumlauf 1996; Trainor & Krumlauf 2000; Trainor et al. 2000). Это согласуется с идеей, что Hox гены регулируют развитие NC и структур, происходящих из NC (Mallo et al. 2010).

Hoxb5 expression in the neural tube and neural crest cells


Hoxb5 (также известен как Hox2.1) член Antennapedia гомеобоксного семейства, который в гомеобоксном кластере B генов расположен на хромосоме 17 человека и на хромосоме 11 у мышей. С помощью reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), экспрессия Hoxb5может быть обнаружена у эмбрионов мышей со ст. E6.5 (Fig. 2). При тотальной in situ гибридизации, Hoxb5 обнаруживает экспрессию в NT вдоль A-P уровня позади сомита 3, и наивысший уровень экспрессии обнаруживается между уровнем сомита 4 и сомита 8 на ст. E8.0 - E10.5 эмбрионов мышей (Fig. 2), это перекрывается по времени с формированием NC и epithelial mesenchymal transition (EMT) на этом A-P уровне. Помимо этого слабая экспрессия Hoxb5 наблюдалась также в переднем мозге и заднем мозге и в 4-й фарингеальной дуге и вдоль окологлоточного (circumpharyngeal) гребня у эмбрионов на ст. E8.0-8.5 и E9.0-9.5 (Fig. 2). На ст. E10.5 экспрессия Hoxb5 постоянно увеличивается в 4-й фарингеальной дуге и окологлоточном гребне (Fig. 2). Более того, выявляется сильная экспрессия в зачатках передних конечностей, тогда как экспрессия в слуховом пузырьке и телэнцефалоне довольно слабая (Fig. 2). Со ст. E12.5 Hoxb5 экспрессируется по всей NT, при этом передний домен экспрессии в миелэнцефалоне и и наивысшая экспрессия обнаруживается на A-P уровнях, простирающихся на регионы миелэнцефалона и вагуса (Krumlauf et al. 1987; Hogan et al. 1988; Holland & Hogan 1988; Kuratani & Wall 1992; Wall et al. 1992). Во время индукции NC, Hoxb5экспрессируется в дорсальной части the dorsa NT, и позднее в мигрирующих вагусном и туловищном NC у человека, мыши и кур (Holland & Hogan 1988; Kuratani & Wall 1992; Wall et al. 1992; Fu et al. 2003).

Hoxb5 and vagal neural crest cells


У человека клетки вагусной части NC проникают в пищевод, мигрируют и колонизируют всю кишку в рострально0каудальном направлении, формируя нейроны и глию ENS между 4 и -7 неделей развития, и пути миграции клеток вагусной части NC в кишке человека сходны с таковыми у мышей и кур (Le Douarin & Teillet 1973; Tam & Lister 1986; Gershon et al. 1993; Fu et al. 2003). Разные клеточные события, включая отсоединение от NT, миграцию и дифференцировку вагусного NC во время развития ENS у человека (Attie-Bitach et al. 1998; Touraine et al. 2000; Fu et al. 2003, 2004) и мыши (Baetge & Gershon 1989; Kapur et al. 1992; Durbec et al. 1996; Young et al. 1998, 1999, 2003; Anderson et al. 2006) на разных эмбриональных стадиях суммированы в таблице 1.

Table 1. Summary of the developmental events of the vagal neural crest cells (NC) in the human and mouse enteric nervous system development 

Stage        Cellular events
Human
Not known        Delamination of vagal NC
<4th week        NC entry to foregut
4th week        NC migration to the rostral stomach
5th week        NC migration to the caudal stomach; appearance of
 PGP9.5+ve neurons and S100+ve glia in ganglion plexus in the esophagus
7th week        Completion of migration; appearance of ganglion
 plexus in foregut and midgut; PGP9.5+ve neurons and S100+ve glia
 in the hindgut have not coalesced in the ganglion plexus
Mouse
E8.5        Delamination of vagal NC
E9-9.5        NC entry to foregut
E10.5        NC migration to the proximal midgut, start of neuronal differentiation
E11.5        NC migration to the cecum, start of glia differentiation
E12.5        NC migration to the proximal hindgut
E13.5        Completion of migration


У человека и мыши в эмбриональной кишке экспрессия Hoxb5 поддерживается в NC по фронту миграции, но выключается, как только клетки NC начинают подвергаться дифференцировке в нейроны и глию (Fu et al. 2003) (Fig. 3-5). Позднее экспрессия Hoxb5 включается снова в энтерических нейронах (Tuj1-позитивные) и глие (S100-positiveпозитивные), когда завершается дифференцировка (Fu et al. 2003), и эта экспрессия сохраняется в энтерических глиальных клетках и разных подтипах энтерических нейронов у взрослых (Fig. 3-5). Функциональное значение двухфазной экспрессии Hoxb5 в происходящих из вагусного NC нейрональных и глиальных клонах, неизвестно.

Дефекты развития вагусного NC вызывают врожденную болезнь ENS , известную как болезнь Гиршпрунга (HSCR, MIM142623), которая характеризуется отсутствием нейронов и глии вдоль варьирующей по длине дистальной части кишечника (Farlie et al. 2004; Tam & Garcia-Barcelo 2009; McKeown et al. 2013).
Ген RET (REarranged during Transfection) является главным геном HSCR (Angrist et al. 1993; Lyonnet et al. 1993), а активность передачи сигналов RET является критической для развития вагусной части NC (Pachnis et al. 1998). Гаплонедостаточность по RET приводит к HSCR (Amiel et al. 2008). HOXB5 соединяется с промотором и интроном 1 законсервированной у разных видов последовательностью (MCS+9.7) гена RET и изменяет конформацию хроматина и модификации гистонов локуса RET, это может усиливать инициацию транскрипции и экспрессию RET (Zhu et al. 2011, 2014). Ассоциированные с HSCR мутации или варианты последовательности промотора RET влияют на связывание HOXB5 с промотором и активацию транскрипции RET, приводят к снижению экспрессии RET (Emison et al. 2010; Miao et al. 2010; Zhu et al. 2011). В соответствии с активацией транскрипции Ret с помощью Hoxb5, пертурбации активности Hoxb5 за счет экспрессии engrailed-Hoxb5 репрессорного белка (доминантно негативная форма Hoxb5) специфически в вагусном NC приводит к подавлению Ret, задержке миграции NC в развивающуюся кишку и к фенотипу HSCR у b3-IIIa-Cre/enb5 мутантных модельных мышей (Lui et al. 2008).

Hoxb5 and trunk neural crest cells


У мышей клетки туловищной части NC (возникающие между вагусным и крестцовым уровнем) мигрируют к своим органам мишеням в виде трех волн: первые две обусловливают миграцию вентро-медиально, чтобы сгенерировать клетки, продуцирующие epinephrine, в надпочечниках на ст. E9.0-E10.5, включая ганглии дорсальных корешков (DRG) и симпатические ганглии; третья волна мигрирует дорсо-латерально вдоль поверхности эктодермы и дермомиотома, чтобы сформировать меланобласты кожи на ст. E10.5-E13.5 (Bronner-Fraser & Fraser 1989; Serbedzija et al. 1989; Raible & Eisen 1994; Henion & Weston 1997; Luo et al. 2003; Wilson et al. 2004; Ruhrberg & Schwarz 2010).
Когда нарушена активность Hoxb5 особенно в вагусной и туловищной части NC, то возникает апоптоз премиграторных и ранних миграторных клеток NC, у Wnt1-Cre/enb5 мышей и возникают множественные аномалии развития NC, включая гипоплазию симпатических ганглиев и ганглиев дорсальных корешков, гипопигментация кожи и дефекты ENS (Kam et al. 2014b). Эти Wnt1-Cre/enb5 мыши обладают сходными фенотипами с двумя др. мутантными мышиными моделями (Wnt1-Cre/Sox9flox/flox и Wnt1-Cre/Foxd3flox/-), у которых специфически подвергнуты нокауту Sox9 или Foxd3 в NC (Teng et al. 2008; Kam et al. 2014a,b), указывая на их потенциальную роль в качестве нижестоящих мишеней для Hoxb5 сигнального пути. Было установлено, что промоторы Sox9 и Foxd3 могут быть связаны и трансактивированы с помощью Hoxb5 (Kam et al. 2014a,b).

Hoxb5 and trunk neural crest cell-derived neuronal lineage


На ст. E9.0-E10.5, первая и вторая волны миграции клеток туловищного NC, которые являются p75 позитивными и дифференцируются в клоны клеток нейронов (Ruhrberg & Schwarz 2010). Sox9 и Foxd3 экспрессируются не по всему развивающемуся NC. Sox9 является активным участником epithelial-mesenchymal transition (EMT), обнаруживая постепенно понижающуюся экспрессию после отделения. Хотя его экспрессия начинается на ст. имплантации, экспрессия Foxd3's в NT снижается перед миграцией третьей волны клеток NC (Thomas & Erickson 2009). Др. словами сильная экспрессия Sox9 и Foxd3 в первых двух волнах миграции туловищного NC совпадает с детерминацией клонов нейронов, в противоположность третьей волне миграции NC, предназначенной для образования кожных меланоцитов. Это объясняет фенотип гипопластичных DRG у Wnt1-Cre/Sox9flox/flox, Wnt1-Cre/Foxd3flox/-, а также у Wnt1-Cre/enb5, это в свою очередь подчеркивает жизненно важную роль Hoxb5 в регуляции развитияпроисходящих из NC нейронов DRG путем индукции Sox9 и Foxd3.

Hoxb5 and trunk neural crest cell-derived skin melanogenic lineage


На ст. E10.5-E13.5, третья волна миграции клеток туловищного NC, которые являются Kit позитивными, вызывает образование меланогенного клона кожи (Ruhrberg & Schwarz 2010). Отсутствие дефектов пигментации у Wnt1-Cre/Sox9flox/flox мышей указывает на то, что жизнеспособность туловищного NC на поздних эмбриональных стадиях, которые дают кожные меланобласты, не столь зависят от Sox9. Foxd3 экспрессируется в премиграторных клетках туловищного NC, чтобы обеспечить становление клона нейронов; напротив, в проспективных меланобластах Foxd3 подавляется и происходит отделение от нейронального клона перед миграцией (Krispin et al. 2010a,b; Nitzan et al. 2013). Сообщалось, что Foxd3 супрессирует развитие меланогенного клона NC (Krispin et al. 2010a,b), а делеция Foxd3 в NC способствует развитию меланоцитов (Nitzan & Kalcheim 2013; Nitzan et al. 2013). Следовательно, истощение меланоцитов у Wnt1-Cre/enb5 , скорее всего, обусловлено дефектами развития меланобластов после отделения их от нейронального клона и может быть объяснено снижением экспрессии Sox9 или Foxd3 в NC. Вместо этого, Hoxb5, скорее всего, регулируется некими др. генами при развитии кожных меланоластов.

Potential regulation of Sox10 by Hoxb5 in skin melanoblast development


Помимо Sox9 клетки NC экспрессируют также др. члены подгруппы E семейства генов Sox, Sox8 и Sox10. Sox8 не обязателен для развития NC, так как Sox8-/- мыши развиваются до взрослой стадии без очевидных дефектов (Sock et al. 2001). Напротив, Sox10 важен для дифференцировки NC в меланобласты и клетки глии (Southard-Smith et al. 1998; Potterf et al. 2000, 2001; Paratore et al. 2001). SOX10 мутации вызывают Waardenburg-Shah синдром (WS4), который характеризуется дефектами ENS, гипопигментацией и нейросенсорной глухотой у людей (Pingault et al. 1998; Southard-Smith et al. 1998). Промотор Sox10 обладает потенциальными сайтами связывания Hox и приблизительно 60% Wnt1-Cre/enb5 мышей страдают от дефектов слуха также (M. K. M. Kam and V. C. H. Lui, unpubl. data). Это подтверждает, что Sox10 может быть др. потенциальной нижестоящей мишенью для Hoxb5 во время развития NC.

Hoxb5 cooperates with other signaling, 'Hox cofactors', 'Hox collaborators' and transcription factors in regulating vagal and trunk neural crest cell development


В целом Hox белки обладают активностью регуляции транскрипции в виде транскрипционного аппарата, известного как 'Hoxasome', в котором Hox белки рекрутируют др. факторы, наз. 'Hox cofactors' и 'Hox collaborators' (Mann et al. 2009). 'Hox cofactors' распознают и соединяются со специфическими аминокислотными последовательностями Hox белков, чтаобы усилить специфичность и сродство связываемых с ДНК последовательностями Hox белков (Mann et al. 2009). 'Hox collaborators' затем соединяются параллельно с Hox белками, чтобы диктовать силу генной транскрипции (Mann et al. 2009). Hox белки д. работать вместе с др. транскрипционными факторами, чтобы тонко настраивать свою регуляторную роль в транскрипции в NC также. Кооперация между HOXB5 и NKX2.1, который вызывает синергичный эффект при транс-активации RET у людей, напр. (Zhu et al. 2011).
Можно предсказать, что Hoxb5 может кооперироваться с некоторыми др. сигнальными молекулами (напр. Bmp, Notch и Wnt) (Stuhlmiller & Garcia-Castro 2012; Liu et al. 2013; Sasai et al. 2014), Hox ко-факторами (напр. Pbx, Extradenticle [Exd], Meis и Homothorax [Hth]), Hox collaborators (напр. Slp и FoxP1) (Dasen et al. 2008; Rousso et al. 2008; Mann et al. 2009) и транскрипционными факторами (напр. Nkx2.1, Sox10, Phox2B и Pax3) (Zhu et al. 2011, 2014), чтобы с точностью осуществлять регуляцию транскрипции во время развития NC.
Экспрессия Sox9 и Foxd3 была ограничена дорсальной частью NT (Labosky & Kaestner 1998; Dottori et al. 2001; Cheung & Briscoe 2003; Cheung et al. 2005), тогда как транскрипты Hoxb5 могут быть обнаружены как в дорсальной, так и вентральном регионах (M. K. M. Kam and V. C. H. Lui, unpubl. data). Электропортация Hoxb5 может индуцировать эктопическую экспрессию только Foxd3 и Sox9 на дорсальной стороне NT (Kam et al. 2014a,b), подтверждая, что только специфицированные предшественники NC на дорсальной стороне NT чувствительны к Hoxb5. Всё это подразумевает, что Hoxb5 в отдельности недостаточен, чтобы индуцировать Sox9 и Foxd3. Повторяет это наблюдение, что Hoxb1 нуждается в передаче сигналов Bmp и Notch для успешной индукции NC в NT кур (Gouti et al. 2011).

Functional redundancy between Hoxa5, Hoxb5 and Hoxc5 in neural crest cell development


Функциональное перекрывание среди Hox генов может быть обусловлено сильно законсервированным ДНК связывающим у членов Hox и перекрываем доменов их экспрессии; особенно для членов, относящихся в одной и той же группе паралогов, такие как Hoxa5, Hoxb5 и Hoxc5. Поскольку некоторые др. члены могут компенсировать функции Hox белков, необходимы детальные исследования онтогенетических функций каждого индивидуального Hox в развитии NC посредством экспериментов с потерей функции. В случае мышей Hoxb5-/- наблюдался только ростральный сдвиг плечевого пояса, но не фенотипические отклонения NC (Rancourt et al. 1995; Manley & Capecchi 1998). Очевидно. что др. Hox члены могут частично замещать функцию Hoxb5 и продолжать поддерживать нормальное развитие NC даже, когда Hoxb5 отсутствует.
Hox белки из одной и той же группы паралогов обладают сходным потенциалом соединяться с одними и теми же сайтами мишенями. Однако, даже незначительные отличия в аминокислотных последовательностях, особенно в 'hexapeptide'и 'linker' регионах ДНК связывающего домена (Mann et al. 2009), могут быть достаточны, чтобы обеспечивать разную связывающую специфичность и сродство, тем самым обнаруживая разные степени эффектов индукции/репрессии транскрипции на нижестоящие мишени; и при этом обычно один из членов выполняет доминирующую роль (Boucherat et al. 2013; Xu et al. 2013).
В клетках NC, выделенных из кишки на ст. E11.5 эмбрионов мыши, среди 39 Hox генов, экспрессия Hoxb5, Hoxa5,Hoxb6, Hoxc5, Hoxb4, Hoxc4 и Hoxd3 была выявлена с помощью Affymetrix Genechip анализа (V. C. H. Lui, unpubl. data). Сфокусировавшись на членах группы паралогов 5 (Hoxa5, Hoxb5 и Hoxc5), Hoxa5 и Hoxc5 обнаруживали 91% и 82% сходства, соотв., с Hoxb5 в терминах аминокислотных последовательностей ДНК связывающего домена (M. K. M. Kam and V. C. H. Lui, unpubl. data). Все Hoxa5, Hoxb5 и Hoxc5 д. активировать транскрипцию с промоторов SOX9 и FOXD3 (Fig. 6), среди них Hoxb5 обнаруживает наиболее выдающийся результат; и все их активности могут быть репрессированы в присутствии engrailed-Hoxb5 (enb5) в NC (Kam et al. 2014a,b). Следовательно, Hoxb5, скорее всего, выполняет доминирующую роль в регуляции Sox9 и Foxd3 во время развития NC, обнаруживая при этом некоторые сходные функции с Hoxa5 и Hoxc5.



Future challenges in the dissection of Hox functions in neural crest cells


The specific function of Hox proteins in initiating transcription is enhanced by their joint action with Hox cofactors, Hox collaborators (Mann et al. 2009) and other transcription factors. Hox proteins are highly versatile elements that drive diverse but cell-type specific functions (Boube et al. 2014). Hence, to understand the molecular mechanisms by which Hoxb5 or other Hox proteins regulate the transcription of different target genes in NC at different developmental stages of various NC lineages, identification of these Hox cofactors, Hox collaborators and transcription factors in the Hox-complexes in NC becomes necessary. In addition, single cell transcriptomics analysis of different lineages/developmental stages of NC should also be performed. The major challenge lying ahead will be the identification of specific markers for the isolation of NC of a specific lineage and of a specific developmental stage.