Посещений:
ПЛАНАРНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ПОЛЯРНОСТЬ НЕЙРОЭПИТЕЛИЯ



Участие в динамике филоподий мигрирующих нейронов

PCP Signaling between Migrating Neurons and their Planar-Polarized Neuroepithelial Environment Controls Filopodial Dynamics and Directional Migration
• Crystal F. Davey , • Andrew W. Mathewson , • Cecilia B. Moens
PLoS Genet 12(3): e1005934. doi:10.1371/journal.pgen.1005934

The planar cell polarity (PCP) pathway is a cell-contact mediated mechanism for transmitting polarity information between neighboring cells. PCP "core components" (Vangl, Fz, Pk, Dsh, and Celsr) are essential for a number of cell migratory events including the posterior migration of facial branchiomotor neurons (FBMNs) in the plane of the hindbrain neuroepithelium in zebrafish and mice. While the mechanism by which PCP signaling polarizes static epithelial cells is well understood, how PCP signaling controls highly dynamic processes like neuronal migration remains an important outstanding question given that PCP components have been implicated in a range of directed cell movements, particularly during vertebrate development. Here, by systematically disrupting PCP signaling in a rhombomere-restricted manner we show that PCP signaling is required both within FBMNs and the hindbrain rhombomere 4 environment at the time when they initiate their migration. Correspondingly, we demonstrate planar polarized localization of PCP core components Vangl2 and Fzd3a in the hindbrain neuroepithelium, and transient localization of Vangl2 at the tips of retracting FBMN filopodia. Using high-resolution timelapse imaging of FBMNs in genetic chimeras we uncover opposing cell-autonomous and non-cell-autonomous functions for Fzd3a and Vangl2 in regulating FBMN protrusive activity. Within FBMNs, Fzd3a is required to stabilize filopodia while Vangl2 has an antagonistic, destabilizing role. However, in the migratory environment Fzd3a acts to destabilize FBMN filopodia while Vangl2 has a stabilizing role. Together, our findings suggest a model in which PCP signaling between the planar polarized neuroepithelial environment and FBMNs directs migration by the selective stabilization of FBMN filopodia.
Путь передачи сигналов планарной клеточной полярности(PCP)наиболее понятен как механизм, зависимый от клеточных контактов для генерации и поддержания полярности в плоскости эпителия [1, 2]. Его функция впервые была описана в статических эпителиальных клетках мух, где молекулярная асимметрия "стержневых" PCP белков приводила к морфологической асимметрии одиночных богатых актином волосков на дистальной стороне каждой крыловой клетки [3-5]. Впоследствии планарная полярность устанавливается с помощью основного пути, характеризующего большинство эпителиальных тканей у позвоночных и беспозвоночных [6-10]. Основной PCP путь представлен двумя белковыми комплексами, которые располагаются на разных частях клеточной мембраны. В крыльях мух трансмембранный белок Frizzled (Fz) ограничен дистальными апикальными клеточными соединениями вместе с цитозольными белками Disheveled (Dsh) и Diego (Dgo), тогда как трансмембранный белок Van Gogh (Vang) (Strabismus(Stbm)) и цитозольный белок Prickle (Pk) локализованы проксимально. Такая молекулярная асимметрия PCP способствует полимеризации актина на дистальной стороне клетки, стоя ниже Fz и Dsh [11-13]. Поскольку факторы, которые первоначально поляризуют компоненты PCP, являются контекст зависимыми [14], то асимметричная локализация PCP белков поддерживается внутри поляризованных клеток посредством дестабилизирующих взаимодействий между комплексом Vang и комплексом Fz [15, 16]. Такая поляризация PCP белков скоординирована между клетками путем образования межклеточных стабилизирующих взаимодействий между Vang и Fz комплексами вдоль клеточных соединений [17-21]. Несмотря на антагонистические роли комплексов Vang и Fz, потеря функции любого стержневого PCP компонента приводит к потере полярности.
Поскольку PCP хорошо известна по своей роли в стабильном эпителии [22-24], то стрежневые компоненты PCP участвуют также в динамических клеточных процессах, таких как миграция клеток. Как PCP контролирует направленные клеточные движения лучше всего демонстрируют, хотя и не полностью, согласованно мигрирующие клетки, такие, как те, что подвергаются конвергентному удлинению [25-37]. Однако, независимо мигрирующие клетки также нуждаются в PCP [38-44]. Здесь в качестве модели мы использовали стереотипированную и консервативную миграцию краниальных двигательных нейронов в заднем мозге позвоночных [45-47]. Это позволило нам изучить in vivo, как PCP может регулировать не согласованную миграцию клеток, и определить как передача сигналов PCP между разными типами клеток, мигрирующими нейронами и клетками, через которые они мигрируют, может модулировать миграторное поведение клеток.
PCP путь управляет стереотипированной тангенциальной миграцией facial branchiomotor neurons (FBMNs) в заднем мозге позвоночных. FBMNs являются субнабором черепных branchiomotor нейронов, которые возникают в вентральной части ромбомера (r)4 и осуществляют миграцию кзади в r6, где они образуют ядро лицевого двигательного нерва, чьи аксоны покидают задний мозг в r4 и иннервируют мышцы, происходящие bo второй бранхиальной дуги [45, 47]. Передовой генетический скрининг у рыбок данио идентифицировал множественные стержневые PCP компоненты (Vangl2, Pk1b, Fzd3a, Celsr2 и Scribble), как необходимые для миграции FBMN [31, 48-51]; эта потребность в PCP была также обнаружена и для миграции FBMN у мышей [52-54]. В отличие от миграции клеток, упомянутой выше, поиски оказались неспособными идентифицировать роль Wnts или др. хемотаксических сигналов. Хотя ясно, что многие компоненты пути PCP необходимы для тангенциальной миграции FBMN, но как эти компоненты регулируют этот динамический процесс, неизвестно.
Прежде всего мы определили, какие типы клеток участвуют в передаче сигналов PCP во время миграции FBMN, т.к. предыдущие исследования использовали ряд подходов, давших противоречивые результаты [31, 48, 49, 51, 55]. Используя систему Gal4/UAS для систематического нарушения PCP зависимым от типа клеток и ромбомер-специфическим способом, мы продемонстрировали двойную потребность в PCP внутри FBMNs и в планарно поляризованном окружении r4 нейроэпителия, в результате которых они возникают, и идентифицировали реципрокные PCP-зависимые взаимодействия между FBMNs и планарно поляризованной донной пластинкой (floorplate), как достаточные, хотя и не обязательные, чтобы способствовать миграции. Поскольку миграция клеток возникает в результате контакт-зависимой стабилизации клеточных выпячиваний и передачи сигналов PCP, как известно, регулируемых динамикой актина, то мы исследовали активность выпячиваний одиночных FBMNs, используя высокого разрешения time-lapse микроскопию одиночных клеток у химерных эмбрионов и продемонстрировали противоположные функции стержневых компонентов PCP Fzd3a и Vangl2 в регуляции активности выпячиваний филоподий FBMN in vivo. В FBMNs мы показали, что Fzd3a необходим, чтобы стабилизировать филоподии, тогда как Vangl2 обнаруживает антагонистическую, дестабилизирующую роль. Однако, в миграторном окружении мы обнаружили, что Fzd3a необходим, чтобы дестабилизировать филоподии, тогда как Vangl2 выполняет стабилизирующую роль. Несмотря на антагонистические роли на клеточном уровне, Vangl2 и Fzd3a мутанты имеют один и тот же фенотип миграции FBMN. Эти находки напоминают внутриклеточную антагонистическую в противовес межклеточной стабилизирующей роли стержневых PCP белков, выполняемой в стабильно поляризованном эпителии. В соответствии с ролью Vangl2 в регуляции динамики филоподий, мы показали, что Vangl2 локализуется временно на кончиках втягиваемых FBMN филоподий; в соответствии с ролю Vangl2 и Fzd3a в микроокружении, мы показали планарно поляризованную локализация этих белков в соседней floorplate. Итак, наши находки подтверждают модель, согласно которой канонические взаимодействия между компонентами PCP в FBMNs и между FBMNs и их планарно поляризованным нейроэпителиальным окружением способствует миграции путем избирательной стабилизации филоподий FBMN.

Discussion


Базируясь на наших находках, мы предложили модель относительно роли передачи сигналов PCP миграции FBMN, в которой канонические взаимодействия между трансмембранными PCP стержневыми компонентами Vangl2 и Fzd3a регулируют динамику филоподий, тем самым передачу сигналов и/или регуляцию адгезии для направленной миграции (Fig 7). Мы отметили, что эта модель динамики филоподий базируется на генетике и что наша работа не выясняет молекулярную природу этих взаимодействий, которые остаются спорными даже в контексте полярности эпителия [17, 76]. Эта модель согласуется 1) двойной клеточно-автономной и клеточно-неавтономной потребностью в PCP стержневых компонентах, особенно в трансмембранных компонентах Vangl2 и Fzd3a, в FBMNs и их rhombomere 4 окружении для миграции; (this work, [31, 49, 51]); 2) цитоскелетной и законсервированной молекулярной планарной поляризацией r4 нейроэпителиального окружения, включая floorplate (this work, [6]); 3) со способностью планарно поляризованной floorplate способствовать миграции дикого типа, но не мутантных FBMNs; 4) с локализацией Vangl2 во втягиваемых кончиках филоподий FBMN; 5) с антагонистическими клеточно-автономными ролями Fzd3a и Vangl2 в стабильности филоподий FBMN и 6) с противоположными ролями Fzd3a и Vangl2 в окружении FBMN на стабильность филоподий FBMN.

Fig 7. Model of PCP regulation of directed neuron migration. Based on the filopodial dynamics and migratory behaviors of FBMNs we observed in genetic chimeras, and the localization of Vangl2 and Fzd3a we observed in FBMNs and the cells of their migratory environment, we suggest a model in which antagonistic interactions between Vangl2 and Fzd3a mediate the observed effects on FBMN filopodial dynamics and through them, directional neuron migration. Within FBMNs, Vangl2 (green) localizes to filopodial tips and destabilizes them while Fzd3a (magenta) has the opposite, stabilizing effect. In the planar-polarized cells of the migratory environment Vangl2 serves to stabilize filopodia while Fzd3a destabilizes them. In light of the known intracellular and intercellular interactions between Vangl and Fzd that underlie epithelial planar polarization, we hypothesize that interactions between Fzd3a and Vangl2 complexes destabilize one another intracellularly while they promote one another's effects on the actin cytoskeleton when they interact across cell membranes. Whether these interactions provide directional cues for migration remains to be discovered. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pgen.1005934.g007

Mutual antagonism of Vangl2 and Fzd3a


Наши in vivo наблюдения динамики филоподий у генетических химр демонстрируют антагонистические внутриклеточные взаимоотношения между Vangl2 и Fzd3a в мигрирующих FBMNs, которые регулируют стабильность филоподия-подобных выпячиваний. Поскольку происходит это в контексте высоко динамической структуры, то это антагонистическое взаимоотношение Vangl2 и Fzd3a напоминает ситуацию в стабильно поляризованном эпителии, где взаимный внутриклеточный антагонизм между Fzd и Vangl комплексами обеспечивает динамику поляризованного актина внутри клетки, при этом Fzd активирует полимеризацию актина, а Vangl супрессирует её в проксимальной части [11-13, 77, 78]. Это законсервированное взаимодействие между Fzd способствующим и Vangl супрессирующим действием на рост актина может быть общим и для др. миграторных клеток. В метастатических клетках рака груди, индуцированного с помощью стромальных Wnt11-содержащих экзосом, Fzd6 и Vangl1 обнаруживают взаимно исключающую локализацию, при этом Fzd6 в выпячиваниях на ведущем крае клетки, а Vangl1 на клеточной поверхности, лишенной выпячиваний, а нокдаун любого из белков снижает подвижность клеток [44]. Сходным образом, в мигрирующих клетках при лейкемии Dvl-3 (часть комплекса Fzd) локализуется на ведущем крае, тогда как Vangl2 располагается на подтягиваемо крае [79]. Во время мезодермальной и нейроэктодермальной конвергенции, медиолатерально ориентированные клеточные поверхности обнаруживают повышенную сократимость актомиозина [33, 80], что коррелирует с асимметричной локализацией PCP компонентов Dvl и Pk часть комплекса Vangl) [7, 81], подтверждая консерватизм внутриклеточного антагонизма этих комплексов. Напротив, в комиссуральных ростовых конусах, Vangl2 способствует Fzd3-зависимому росту, индуцированному с помощью диффундирующего Wnt5a путем противодействия неканоническому ингибирующему взаимодействию между Dvl1 и Fzd3, идентифицированному в этом контексте [41]. Эти примеры показывают, что стержневые PCP компоненты располагаются в отличающихся доменах движущихся клеток и мы показали in vivo впервые, что это приводит к противоположным эффектам на стабильность филоподий.

The role of filopodia in FBMN cell migration


Филоподии обычно ассоциируют с направленной миграцией клеток, хотя в некоторых примерах, аксоны и клетки могут достигать соотв. целей и наведения без филоподий [82-84]. Благодаря своей динамике и длинной тонкой архитектуре, филоподии способны обследовать широкие области вокруг клетки, и они могут содержать рецепторы, чтобы различать диффундирующие и связанные с мембранами сигналы и молекулы внеклеточного матрикса [85]. Т.о., считается, что первичной функцией филоподий является роль "антенны", которую клетки используют, чтобы ощущать свое микроокружение и ориентировать направление клеточной миграции [86]. В самом деле, было продемонстрировано, что элиминация филоподий в ростовых конусах аксонов не нарушает рост аксонов, но вместо этого нарушает повороты ростовых конусов в ответ на внешние сигналы [87-89]. Эта роль ощущений филоподиями демонстрируются мигрирующими клетками [84, 90]. Помимо ощущающей роли филоподии, как полагают, вносят вклад непосредственно в клеточную подвижность, т.к. клетки, лишенные филоподий стремятся мигрировать более медленно из-за отсутствия филопоидальных адгезивных молекул, которые д. вызывать тягу, а также посредством силы генерировать приток актина в филоподии [82, 90-93]. В этом контексте миграции FBMN филоподии распространяются во всех направлениях от нейронов, затем они инициируют их миграцию и мы наблюдаем отсутствие склонности в ориентации филоподий у мутантов, затрагивающих PCP. Мы полагаем, что филоподии действуют как сенсоры асимметрично расположенных на клеточной поверхности компонентов PCP на нейроэпителиальных клетках, благодаря чему они мигрируют и это ощущение тонко настраивает динамику филоподий, способствуя миграции с помощью действия генераторов сил, или соотв. образом ощущая др., пока еще не идентифицированные средовые сигналы. В др. мигрирующих клетках некоторые эффекторы были идентифицированы как возможные связи между передачей сигналов PCP и регуляцией цитоскелета [33, 94, 95]. Поскольку наша работа не выявила, как эти сигналы передаются в филоподиальному актиновому цитоскелету в FBMNs, наша предыдущая работа идентифицировала домен гомологии WAVE, содержащий регулятор актина Nhsl1 , как локализованный в филоподиях FBMN и необходимый для клеточно автономной миграции FBMN [51, 96]; поэтому мы полагаем, что передача сигналов PCP может быть передана актиновому цитоскелету в FBMNs посредством Nhsl1.

Fzd3a and Vangl2 function in the migratory environment


Более неожиданной находкой, чем противоположные клеточно автономные роли Fzd3a и Vangl2 в динамике филоподий и миграции FBMN является то, что те же самые компоненты PCP функционируют в окружении FBMN, чтобы влиять на динамику филоподий, но противоположным образом: Fzd3a в окружении дестабилизирует филоподии, тогда как Vangl2 в окружении стабилизирует их. Эти клеточно-неавтономные функции для Fzd3a и Vangl2 в динамике филоподий коррелируют с их неавтономными ролями в миграции FBMN [31, 49]. Опять же это напоминает классическую планарную полярность, при которой локальная активность Fzd завсит от присутствия Vangl в соседних клетках в эпителии и наоборот; этот механизм, с помощью которого PCP скоординирован по всему эпителию [17-21]. Мы полагаем, что клеточно-автономные активности Fzd3a и Vangl2 активируются в разных филоподиях, когда они контактируют с доменами Vangl2 и Fzd3a нейроэпителиальных клеток в r4 окружении (Fig 7), при этом последствия на динамику актина регулируют стабильность филоподий, приводя к изменениям в передаче сигналов и/или в адгезии. Мы показали, что Vangl2 и Fzd3a обнаруживают планарно поляризованное расположение в r4 нейроэпителии и floorplate во время миграции FBMN. У PCP мутантов эта поляризованная информация отсутствует и/или не может быть правильно интерпретирован филоподиями, приводя к неспособности направленной миграции клеток. Мы отметили, что клеточно-автономные фенотипы филоподий, по-видимому, доминантны, т.к. у конституитивных мутантов филоподии имеют клеточно-автономные фенотипические отклонения (длинные и стабильные у vangl2 мутантов; нестабильные у fzd3a мутантов). Итак, наши находки подтверждают, что консервативные внутриклеточные и межклеточные взаимодействия между стержневыми компонентами PCP могут вызывать разные эффекты на динамику актина и, следовательно, на поведение клеток.
Поскольку наблюдаются сходные эффекты на динамику филоподий, когда Vangl2 истощен в FBMNs и когда Fzd3a истощен в их окружении, подтверждая, что два белка работают совместно, PCP окружения может также влиять на динамику филоподий FBMNs посредством косвенного механизма. Напр., стержневые PCP белки участвуют в доставке и в мембранных уровнях cadherins у мух и позвоночных в эпителиальных клетках [97-99]. Следовательно, Vangl2 и Fzd3a в миграторном окружении могут модулировать динамику филоподий FBMN путем регуляции уровней N-cadherin на поверхности нейроэпителиальных клеток. Др. потенциальный механизм, с помощью которого PCP в миграторном окружении может регулировать динамику филоподий FBMN, заключается в регуляции membrane type-1 matrix metalloproteinase (MMP14), которая, как известно, деградирует белки внеклеточного матрикса. Во время гаструляции у рыбок данио повышение активности Mmp14 наблюдается у vangl2 мутантных эмбрионов [100]. Т.о., снижение стабильности филоподий FBMN, наблюдаемое, когда отсутствует Vangl2 в миграторном окружении, может быть обусловлено снижением внеклеточного матрикса.
Какие клетки в окружении FBMNs являются источником PCP сигналов для динамики филоподий и миграции? Мы показали, что нарушения передачи сигналов PCP в r4 окружении предупреждает миграцию FBMN , демонстрируя, что передача сигналов PCP необходима для инициации направленной миграции. Недавно установлено, что экспрессия Vangl2 даже в одиночной клетке r4 floorplate достаточна, чтобы восстановить миграцию FBMN у vangl2 мутантов [55]. Напротив, наши результаты показали, что floorplate Vangl2 не обязательна и недостаточна для миграции FBMN. Ни широко распространенное присутствие GFP-Vangl2 экспрессирующих клеток или дикого типа происходящих из донора клеток в floorplate vangl2 мутантов не восстанавливает миграцию vang2 мутантных FBMNs. Восстановление миграции FBMN , наблюдаемое Sittaramane et al. (2013) может быть обусловлено не выявленной ранней экспрессией Vangl2 вне floorplate [101, 102].
Необходимо отметить, что присутствие клеток дикого типа в floorplate может частично восстанавливать миграцию дикого типа FBMNs у vangl2 мутантных эмбрионов. Это подтверждает, что двунаправленная передача сигналов PCP между планарно поляризованной floorplate и FBMNs может способствовать миграции. Однако, это восстановление неполное, указывающее на то, что др. планарно поляризованные клетки в r4 окружении обычно вносят вклад в окружение, способствующее миграции. В соответствии с этой гипотезой, мы установили, что нарушение планарной поляризации только floorplate у эмбрионов рыб и мышей недостаточно, чтобы предупредить миграцию FBMN (Fig 3 and S4 Fig). Мы пришли к заключению, что планарная поляризация всего r4 окружения вокруг FBMNs необходимо для эффективной инициации миграции. Мы оказались неспособны подтвердить это путем восстановления миграции FBMN у vangl2 мутантов с r4-ограниченной экспрессией GFP-Vangl2, скорее всего, из-за избыточной экспрессии PCP компонентов, нарушающих планарную полярность столь же эффективно, ка и их отсутствие [28, 31, 103, 104].
Наше исследование пролило новую информацию о роли пути планарной клеточной полярности в миграции нейронов, путем идентификации, где и когда передача сигналов PCP необходима и как она влияет на динамику клеточного поведения мигрирующих нейронов in vivo. Наши данные подтвердили, что планарная поляризация ромбомера 4 заднего мозга способствует миграции FBMN посредством избирательной стабилизации и дестабилизации филоподий FBMN за счет использования внутри- и межклеточных взаимодействий между компонентами PCP Vangl2 и Fzd3a. Действительно ли планарная полярность нейроэпителия управляет миграцией кзади или просто делает её возможной и посредством каких эффекторов передачи сигналов PCP регулируется динамика филоподий in vivo являются важными вопросами, ждущими решения.