Посещений:
НАРУШЕНИЯ СПЛАЙСИНГА



Мышиная модель синдрома Ретт

Misregulation of Alternative Splicing in a Mouse Model of Rett Syndrome. PLoS Genet 12(6): e1006129. doi:10.1371/journal.pgen.1006129
Li R, Dong Q, Yuan X, Zeng X, Gao Y, Chiao C, et al.
PLoS Genet (2016) 12(6): e1006129. doi:10.1371/journal.pgen.1006129

Mutations in the human MECP2 gene cause Rett syndrome (RTT), a severe neurodevelopmental disorder that predominantly affects girls. Despite decades of work, the molecular function of MeCP2 is not fully understood. Here we report a systematic identification of MeCP2-interacting proteins in the mouse brain. In addition to transcription regulators, we found that MeCP2 physically interacts with several modulators of RNA splicing, including LEDGF and DHX9. These interactions are disrupted by RTT causing mutations, suggesting that they may play a role in RTT pathogenesis. Consistent with the idea, deep RNA sequencing revealed misregulation of hundreds of splicing events in the cortex of Mecp2knockout mice. To reveal the functional consequence of altered RNA splicing due to the loss of MeCP2, we focused on the regulation of the splicing of the flip/flop exon of Gria2 and other AMPAR genes. We found a significant splicing shift in the flip/flop exon toward the flop inclusion, leading to a faster decay in the AMPAR gated current and altered synaptic transmission. In summary, our study identified direct physical interaction between MeCP2 and splicing factors, a novel MeCP2 target gene, and established functional connection between a specific RNA splicing change and synaptic phenotypes in RTT mice. These results not only help our understanding of the molecular function of MeCP2, but also reveal potential drug targets for future therapies.
Rett syndrome (RTT) - прогрессирующее нейродегенеративное нарушение, затрагивающее преимущественно женщин [1, 2]. Классические RTT пациенты развиваются нормально первые 6-18 мес. а затем подвергаются быстрой регрессии наивысших функций головного мозга, которые в конечном итоге приводят к потере речи и целенаправленным движениям рук, микроцефалии, деменции, атаксии и судорогам [3]. Мутации в X-сцепленном гене methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) ответственны за более 90% классических случаев RTT [4]. MeCP2 обильно экспрессирующиеся в ЦНС млекопитающих и соединяется с метилированным CpG сайтами по всему геному [5]. Лежащий в основе молекулярный механизм мутаций MECP2, приводящих к RTT, известен недостаточно.
Чтобы выяснить механизм болезни RTT необходимо изучить молекулярные функции MeCP2. Предыдущие исследования молекулярных функций MeCP2 были сконцентрированы на локализации MeCP2 в ядре и на белках, которые физически взаимодействуют с MeCP2. На микроскопическом уровне MeCP2, по-видимому, локализуется совместно с гетерохроматином и поэтому предполагается, что он вызывает крупномасштабные реорганизации хроматина во время терминальной дифференцировки [6]. На геномном уровне MeCP2 может соединяться с неметилированрной ДНК [7], метилированным цитозином [5], и гидроксиметилированным цитозином [8], и может преимущественно модулировать экспрессию длинных генов [9]. Параллельно с исследованием локализации MeCP2 были идентифицированы белки, физически взаимодействующие с MeCP2. Базируясь на известных функциях, взаимодействующих с MeCP2 белков, предыдущие исследования подтвердили роль MeCP2 в поддержании метилирования ДНК [10], регуляции транскрипции [11-16], структуры хроматина [17-22] и преобразования РНК [23-25]. Дальнейшие попытки скомбинировать информацию от двух подходов, описанных выше, сделают возможным более детальное понимание регуляции каждого из этих специфических межбелкового взаимодействий по всему геному, как и значение каждого взаимодействия для патогенеза болезни RTT.
Неправильная регуляция альтернативного сплайсинга РНК была отмечена в ряде нейрологических болезней, которые могут быть отнесены к двум категориям: цис-действующим нарушениям сплайсинга и транс-действующими нарушениям [26]. Цис-действующее нарушение вызывается мутациями, которые воздействуют на сплайсинг самого мутантного гена , а значит и функцию этого гена. Примером такого типа является frontotemporal dementia with Parkinsonism, сцепленная с хромосомой 17 (FTDP-17), при которой MAPT (Tau) ген изменяет функцию Tau путем увеличения exon 10 содержащей изоформы [27]. Напротив, транс-действующие нарушения вызываются потерей функции генов с регуляторными ролями в сплайсинге РНК. Напр., потеря функции survival motor neuron protein 1 (SMN1) затрагивает биогенез small nuclear RNA (snRNA) и приводит к широко распространенным изменениям сплайсинга при spinal muscular atrophy (SMA)[28]. Относительно RTT, в Zoghbi lab идентифицировали РНК-зависимое взаимодействие между MeCP2 и Y box-binding protein 1 (YB1) в культивируемых клетках и далее сообщалось о многих изменениях событий сплайсинга РНК в мышиной модели RTT [23]. Однако, неясно, действительно ли альтерации сплайсинга в самом деле, зависят от взаимодействия MeCP2/YB1 и действительно ли отсутствует связь, открытая между любым ген-специфичным изменением сплайсинга и специфическим нейрональным фенотипом при RTT. Следовательно, механистические и функциональные связи между MeCP2, регуляцией сплайсинга, и RTT фенотипическими отклонениями остаются неуловимыми.
Чтобы облегчить систематическую идентификацию взаимодействующих с MeCP2 белков в головном мозге, мы получили knockin линию мышей (Mecp2-Flag), которая экспрессирует Flag-нагруженный MeCP2 с эндогенного Mecp2 локуса [29]. Этот уникальный инструмент дает нам два преимущества. Во-первых, он гарантирует, что MeCP2-Flag белок экспрессируется на физиологическом уровне, так, что неспецифические межбелковые взаимодействия, вызываемые избыточной экспрессией MeCP2-Flag минимизированы. Во-вторых, он позволяет нам использовать высоко эффективные anti-Flag антитела для ко-иммунопреципитации. Выбор антител не тривиальный вопрос, поскольку в прошлом они приводили к противоречивым результатам с anti-MeCP2 антителами при идентификации белков, взаимодействующих с MeCP2 [30, 31]. Масс спектрометрический анализ ко-иммунопреципитируемых белков с помощью anti-Flag антител из ядерных экстрактов из головного мозга Mecp2-Flag мышей показал, что MeCP2 взаимодействует с многими сплайс-факторами. Некоторые из этих физических взаимодействий были нарушены при RTT-вызывающих мутациях в MeCP2. Более того, ChIP-seq анализ выявил расположение MeCP2 при exon/intron инъекциях, которые предоставили дополнительное подтверждение роли MeCP2 в модуляции альтернативного сплайсинга. В соответствии с предыдущими находками сотни событий сплайсинга были обнаружены, как неправильно регулируемые в кортексе Mecp2 нокаутных (KO) мышей. Более важно, что специфические изменения сплайсинга в коре Mecp2 KO сдвигали баланс между flip и flop экзоном в AMPA рецепторном (AMPAR) гене, оказывались причинно-связанными с синаптическими фенотипическими отклонениями быстрой кинетики десенсибилизации AMPAR-gated тока и изменениями синаптической трансмиссии. Наши находки подтвердили роль MeCP2 в регуляции альтернативного сплайсинга РНК путем выявления прямого физического взаимодействия между MeCP2 и множественными факторами сплайсинг, ассоциации MeCP2 с exon/intron соединением и впервые подтверждена функциональная связь между специфическими альтерацими сплайсинга и синаптическими фенотипическими отклонениями у RTT мышей.

Discussion


Участие MeCP2 в регуляции альтернативного сплайсинга РНК уже было известно. В 2005, Young et al сообщили о RNA-зависимом взаимодействии MeCP2 и YB1 в линии клеток нейробластомы, понуждаемой к избыточной экспрессии MeCP2 и к некоторым изменениям альтернативного сплайсинга в Mecp2308/y головном мозге [23]. В 2013, Maunakea et al сообщили об внутригенной зависимой от метилирования ДНК связи MeCP2 с альтернативно сплайсируемыми экзонами в линиях раковых клеток [48]. Наша работа существенно расширила эти исследования несколькими способами и это первое сообщение о функциональных последствиях MeCP2-обусловленного сплайсинга.
Во-первых, физическое взаимодействие между MeCP2 и взаимодействующими с ним партнерами идентифицированы в нашем исследовании как независимые от каких-либо нуклеиновых кислот, указывая, что MeCP2 не нуждается в связывании с РНК, чтобы регулировать сплайсинг. Кроме того, эти физические взаимодействия имеют большое физиологическое значение, поскольку они были идентифицированы в головном мозге мышей, где MeCP2 экспрессируется со своего эндогенного локуса. Более того, мы идентифицировали множественные сплайс-факторы в качестве новых взаимодействующих с MeCP2 партнеров в головном мозге. Т.к. эти факторы не являются частью стержневого аппарата сплайсинга, а скорее влияют на сплайсинг как дополнительные факторы сплайсинга [55], но биохимический механизм, лежащий в основе их участия в регуляции сплайсинга известен недостаточно. Их взаимодействие с MeCP2, известным белком хроматина, предоставляет новую информацию для изучения того, как эти факторы регулируют сплайсинг. Кроме того, поскольку мы использовали разные мышиные модели RTT (Mecp2 KO мышей в нашем исследовании в противовес Mecp2308/y мышам у Young et al[23]) и более чувствительный метод, чтобы профилировать альтернативный сплайсинг (RNA-seq vs. microarray), то измененные события сплайсинга отличались от тех, чтоб были идентифицированы Young et al[23]. Несмотря на это, комбинированные результаты трех независимых беспристрастных подходов (Co-IP mass spectrometry, RNA-seq и ChIP-seq), в нашем исследовании предоставили строгие доказательства важного участия MeCP2 в регуляции сплайсинга РНК.
Во-вторых, мы открыли важное местонахождение MeCP2 вокруг границ между экзоном и интроном в головном мозге мышей и охарактеризовали специфичное для экзонов взаимодействие между MeCP2 и двумя регуляторами сплайсинга, указывая на потенциальный механизм MeCP2-зависимой регуляции сплайсинга. Недавние доказательства подтвердили, что внутригенное метилирование ДНК рекрутирует MeCP2 и регулирует сплайсинг пре-мРНК путем изменения скорости удлинения с помощью DNA polymerase II [48]. Однако, наши данные подтвердили, что это неважно для измененного flip/flop сплайсинга в коре Mecp2 KO мышей. Вместо этого наши результаты подтвердили новую модель, что совместное расположение на хроматине MeCP2 и LEDGF необходимо для нормального flip/flop сплайсинга в гене Gria2.
Наконец, что важно, мы установили функциональную связь между специфическими изменениями сплайсинга, вызываемые потерей функции MeCP2 с синаптическими изменениями у RTT мышей. Тот факт, что ESF специфически устраняющий дефекты flip/flop сплайсинга, может быть обратным образом связан с соотв. синаптическими изменениями в головном мозге при RTT, строго подтверждает, что специфические изменения в свойствах синапсов (AMPAR kinetics) вызываются измененным flip/flop сплайсингом. Учитывая центральную роль AMPARs в синаптической передаче, очень возможно, что отклонения в кинетике AMPAR будут приводить к изменениям синаптической функции по другому, чем повторяющиеся стимуляции, использованные в нашем исследовании. Необходимо дальнейшее изучение механистической связи измененной кинетики AMPAR со специфическими дефектами нейронов в симптоматике RTT и чтобы оценить эффект обратно направленного flip/flop сплайсинга на прогрессирование болезни RTT. Помимо flip/flop выбора в AMPARs, альтернативный сплайсинг некоторых др. генов (напр. Nrxn1, Dscam, lin7a), которые выполняют важные роли в синаптических функциях, были изменены в кортексе RTT мышей, указывая, что дополнительные синаптические изменения могут быть вызваны дефицитом сплайсинга. Т.о., изменения сплайсинга РНК, по-видимому, являются новым молекулярным механизмом, лежащим в основе дисфункции синапсов при RTT.
Нарушения регуляции сплайсинга часто распознаются в качестве важного вклада в ряде нейрологических болезней, таких как SMA[56], FTDP-17[27], ALS[57] и миотональная дистрофия [58]. Механистические исследования того, как гены, мутантные при нейрологических болезнях, могут непосредственно влиять на альтернативный сплайсинг, а также на функциональные последствия изменений сплайсинга при таких болезнях чрезвычайно важны.