Посещений:
ЯДРО И ЯДРЫШКИ



Транскрипционные Фактории, Морфология Транскрипции

Morphology of nuclear transcription
• Klara Weipoltshammer, • Christian Schofer
Histochemistry and Cell Biology April 2016, Volume 145, Issue 4, pp 343–358

Gene expression control is a fundamental determinant of cellular life with transcription being the most important step. The spatial nuclear arrangement of the transcription process driven by РНК polymerases II and III is nonrandomly organized in foci, which is believed to add another regulatory layer on gene expression control. РНК polymerase I transcription takes place within a specialized organelle, the nucleolus. Transcription of ribosomal РНК directly responds to metabolic requirements, which in turn is reflected in the architecture of nucleoli. It differs from that of the other polymerases with respect to the gene template organization, transcription rate, and epigenetic expression control, whereas other features are shared like the formation of DNA loops bringing genes and components of the transcription machinery in close proximity. In recent years, significant advances have been made in the understanding of the structural prerequisites of nuclear transcription, of the arrangement in the nuclear volume, and of the dynamics of these entities. Here, we compare ribosomal РНК and mРНК transcription side by side and review the current understanding focusing on structural aspects of transcription foci, of their constituents, and of the dynamical behavior of these components with respect to foci formation, disassembly, and cell cycle.
Ядерная транскрипция осуществляется тремя РНК полимеразами, РНК polymerase I (Pol I) предназначена исключительно для транскрипции рибосомальной РНК (исключение: 5S rРНК), РНК polymerase II (Pol II) транскрибирует мРНК и не кодирующие РНКs, а РНК polymerase III (Pol III) продуцирует тРНКs и 5S рРНК.
C введением меченных нуклеозидов, которые инкорпорируются в синтезируемую РНК, стало понятно, что ядерная транскрипция не происходит случайно по всему jm,]tve ядра, а скорее обнаруживается в дискретных регионах внутри ядерного пространства (Haeusler and Engelke 2006; Jackson et al. 1993; Wansink et al. 1993). Эти фокусы, как было установлено, локализуются совместно с активными формами полимераз, а также с активно транскрибируемыми генами, поэтому такие фокусы являются важными составляющими процесса генной экспрессии (Cisse et al. 2013; Ghamari et al. 2013; Iborra et al. 1996; Schoenfelder et al.2010; Verschure et al. 1999) , где происходит большая часть транскрипции генов (Buckley and Lis 2014; Deng et al. 2013; Edelman and Fraser 2012). Эти фокусы были названы транскрипционными факториями (TFs) (Iborra et al. 1996). Существование сайтов компартментализованной транскрипции в ядрах считается необходимым для гарантии эффективной продукции РНК с помощью увеличения временной и пространственной доступности молекул, участвующих в контроле генной экспрессии. Было показано, что гены стремятся занять транскрипционные фактории, так что совместно регулируемые гены часто занимают одну и ту же транскрипционную факторию и что специализированные транскрипционные фактории существуют для определенных генов (Denholtz et al. 2013; Li et al. 2012, 2013; Papantonis et al. 2012; Park et al. 2014; Schoenfelder et al. 2010). Однако, концепция транскрипционных факторий не принимается всеми [for a review, see (Sutherland and Bickmore 2009)].
Транскрипция с помощью Pol I часто воспринимается как пример локальной ядерной транскрипции и иногда охватывается термином транскрипционная фактория. Несмотря на это существуют четкие отличия между транскрипцией с помощью Pol I и Pol II, напр.., ядрышко является местом транскрипции с очень высокой скоростью в ядре, специфичная для ядрышка рибосомальная ДНК (rDNA) находится в уникальной структуре, rDNA является единственной мишенью для Pol I, а транскрипция пространственно ограничивается бросающейся в глаза ядерной органеллой, ядрышком [rev. (Farley et al. 2015; Raska et al. 2006)].

Morphology of transcription sites


Transcription factories


В отличие от ядрышек, TFs не могут быть идентифицированы морфологически в микроскопе. Первоначально они были выявлены с помощью мечения синтезируемых транскриптов (Fig. 1a) посредством инкорпорации меченных нуклеотидов (Jackson et al. 1993). Позднее была предложена иммуногистохимическая детекция, поскольку она более разносторонняя (напр.., антитела против специфичной для элонгации Ser2P RNAP II). Pol II субъединицы белки слияния были недавно использованы для визуализации транскрипционных факторий и это позволило изучать динамику транскрипционных факторий в реальном времени (Cisse et al. 2013). Поскольку средний диаметр транскрипционных факторий составляет приблизительно 87 nm [для сравнения fibrillar center (FC), функциональный аналог ядрышек человека имеет средний размер около 500 nm], были предприняты попытки локализовать транскрипционные фактории на ультраструктурном уровне. Предыдущие ЭМ исследования установили, что перихроматиновый компартмент, т.е. область, окружающая плотный хроматин, является местом транскрипции с помощью Pol II (Fakan 1976,1994; Fakan and van Driel 2007). Выявление транскрипционных факторий на обычных TEM препаратах с использованием мечения иммуно-золотом (Iborra et al. 1996; Wansink et al. 1996) выявило меченные образования вне плотного хроматина, касающиеся поверхности хроматина. Эти находки были подкреплены с использованием подходов коррелятивной световой микроскопии и EFTEM на эритроидных клетках, где было показано, что транскрипционные фактории состоят из богатой белком сердцевины, окруженной хроматином нуклеосом (Eskiw and Fraser 2011). Более того, в этом исследовании было показано, что во время клеточной дифференцировки транскрипционные фактории крупнее тех, что в раковых клетках, описанных ранее, это согласуется с гипотезой, что совместно регулируемые гены стремятся занимать специализированные транскрипционные фактории. Др. вопрос связан с локализацией промоторов, тел генов и выходящих транскриптов по отношению к транскрипционным факториям. Киназа CDK9 ответственна за прогресс транскрипционно элонгации с помощью наделения Ser2P модификацией Pol II. Подход к живым клеткам (Ghamari et al. 2013), был использован, чтобы скоррелировать Ser2P (транскрипционная элонгация) и Ser5P (транскрипционное ингибирование) антитела. Было показано, что Ser5P всегда совместно локализуется с CDK9, тогда как Ser2P отходит прочь от транскрипционных факторий, указывая. что инициация и элонгация происходят в разных компартментах (Ghamari et al. 2013).

Fig. 1 a BrU incorporation to visualize nascent transcripts, HeLa cell, confocal image (projection) Bar 5 µm b Nucleolus of HeLa cell, sketch of Christmas tree in relation to the fibrillar complex where transcription takes place (inset), TEM Bar 1 µm c In situ hybridization to detect rРНК which is present in df and gc, HeLa cell, TEM, Bar 1 µm, fcfibrillar center, df dense fibrillar component, gc granular component

Nucleoli


Ядрышко является морфологическим соотносительным понятием биогенеза рибосом. Оно подразделено на три компартмента, которые могут быть различены на базе морфологических, молекулярных и функциональных критериев. ЭМ изображения (Fig. 1b) показывают, что два фибриллярных компонента могут быть различены с FC, имеющим меньшую электронную плотность, чем окружающий the плотный фибриллярный компонент (DF). Обе структуры расположены внедренными в гранулярный компонент granular component (GC). Транскрипция рРНК ассоциирована с фибриллярными компонентами, тогда как поздние ступени процессинга рРНК и сборки рибосомальных субъединиц происходят в GC (Fig. 1c). Ядрышковая транскрипция происходит на разделе между FC и DF (Hozak et al. 1994; Mosgoeller et al. 2001), и происходит здесь в виде фокусов (Mosgoeller et al. 1998). В соответствии с этими наблюдениями, Pol I и важный транскрипционный кофактор UBF (upstream binding factor) наиболее многочисленны в FCs и обнаруживаются на низких уровнях в DF. rРНК может обнаруживаться как в DF, так и в GC , где происходит скоординированный процессинг 45S pre-rРНК. Точная топология активных TUs и фланкирующих IGS всё ещё неизвестны в деталях. Ранее было показано с помощью обычной wide-field микроскопии, что TU и IGS локализуются совместно (Wachtler et al. 1991), а недавно в 3C исследовании, была предложена модель, согласно которой существует структура сердцевина- спиральная рДНК (Denissov et al. 2011).
В клетках HeLa бы ло подсчитано, что в течение часа в FC обнаруживается около 500 молекул Pol I, и определено, что около 100 Pol I молекул активны в одиночных TU. Приблизительно четыре TUs транскрибируется в FC/DF интерфазе и поскольку клетки HeLa содержат приблизительно 30 FC фокусов, то было подсчитано, что существует около 100-120 активных TUs на клетку HeLa (Dundr et al. 2002a; Haaf et al. 1991; Jackson et al. 1998).
Транскрипционно неактивные гены rDNA преимущественно расположены на периферии ядрышек, где они часто обнаруживаются вблизи крупных агрегатов гетерохроматина, наз. NADs (nucleolus-associated domains). В клетка с низкой скоростью транскрипции rРНК небольшие фокусы rDNA (сателлитные ядрышки) могут иногда обнаруживаться в нуклеоплазме.

Molecular constituents of nuclear transcription foci
<

Chromatin


Transcription factories


Транскрибируемые последовательности отличаются существенно между сайтами транскрипции Pol I и Pol II. Последовательности. кот орые примыкают к транскрипционным факториям обычно способствуют активно транскрибируемым или готовым генам, которые доступны для молекул Pol II. Последовательности, которые могут быть обнаружены в одной транскрипционной фактории могут происходить или из соседних, или удаленных локусов одной и той же хромосомной территории (CT) или из отдельных CTs. В последнем случае они м. формировать длинного размера петли, часто обнаруживаемые в совместно регулируемых локусах во время процессов клеточной дифференцировки (Park et al. 2014). Эта пространственная организация, по-видимому, является кардинальной для связи архитектуры хроматина, сцепленной с транскрипцией, и с скоординированной экспрессией генов (Kagey et al.2010; Zhang et al. 2013). Примерами таких ассоциаций посредством дальнодействующих петель индуцированных генов, формирующих фактории являются связанные с дифференцировкой активированные гены глобинов. Высоко экспрессируемые β-подобные глобиновые гены Hbb-b1 в эритроидных клетках мыши обнаруживают значительную совместную локализацию с транскрипционными факториями (Osborne et al. 2004). Кроме того, был показано, что locus control region (LCR), который необходим для эффективной транскрипции β-globin генов, является критическим для ассоциации β-globin генов с активными формами Pol II (Ragoczy et al. 2006). Впоследствии ассоциация глобиновых генов мыши была подтверждена при геномном исследовании и далее было показано, что специфичный для глобина транскрипционный фактор Klf1 обеспечивает совместную ассоциацию Klf1-регулируемых генов, которые обнаруживаются в специализированных транскрипционных факториях (Schoenfelder et al. 2010). Недавно описаны связанные с дифференцировкой дальнодействующие взаимодействия на транскрипционных факториях для иммуноглобиновых генов. Такая ассоциация Ig генов, как полагают, облегчает процесс соматической рекомбинации (Verma-Gaur et al. 2012). Тщательное исследование Ig генов во время развития B клеток, подчеркнуло совместное расположение Ig генов, хотя они располагаются на разных хромосомах (Park et al. 2014).
Как показывают эти и др. примеры (e.g., (Ho et al. 2013)), конфигурации петель сводят вместе гены в цис и транс транскрипционные фактории, причем в последнем случае часто вовлекаются совместно регулируемые гены в процессе дифференцировки (Rao et al. 2014). В самом деле, исследование с использованием анализа взаимодействий геномного хроматина одновременно с paired-end tag секвенированием (ChIA-PET), выявило частые взаимодействия между промоторами в транскрипционных факториях (Li et al.2012). Авт. далее показали усиление взаимодействий между энхансерами и промоторами для специфичной для типа клеток транскрипции и предположили, что наблюдаемые взаимодействия служат в качестве структурной основы для регуляции транскрипции.
Дальнейшие исследования показали, что критическими для взаимодействий между промоторами и энхансерами являются инсуляторы и хроматин ремоделирующие комплексы. Инсуляторы являются критическими для доставки промоторов, а энхансеры в тесной близи формируют active chromatin hub (ACH) (de Laat and Grosveld 2003). Напр., инсуляторный белок CTCF, как было установлено, участвует в локализации активных генов в транскрипционных факториях. Эта трансляция зависит от активности белков группы Trithorax, которые представляют собой факторы, поддерживающие эухроматин. Эти наблюдения подчеркивают важность инсуляторов и ремодельеров хроматина для образования петель (Li et al. 2013). Cohesin, как было установлено, соединяется со сходными сайтами в геноме как CTCF (Wendt et al. 2008), и было показано, что cohesin загружается на промоторы с помощью транскрипционных факторов, которые предназначены для становления петель с помощью взаимодействий с энхансерными элементами (Kagey et al. 2010). В самом деле недавнее исследование показало, что большинство (более 85 %) петель закрепляются с помощью CTCF, а сцепление (adhesion) подчеркивает важность двух инсуляторов для образования петли (Rao et al.2014).
Было предположено, что др. механизмы, которые управляют инсулятором обеспечиваемые взаимодействия промотор-энхансер, могут участвовать в формировании петель. В модели "active nuclear compartment" образование петли обеспечивается трехмерной укладкой (folding) хроматина (поддерживается инсуляторами), которая помещает регуляторные элементы в один и тот же компартмент ядра (Gavrilov et al. 2013; Kosak and Groudine 2004).
Др. факторы также участвуют в формировании петель. Используя геномное ChIP-Seq, было установлено, что ремоделирующие хроматин комплексы SWI/SNF ассоциируют с активными последовательностями Pol I и Pol III, указывая на участие их в образование петель (Euskirchen et al. 2011).
В соответствии со своей ролью в экспрессии генов, хроматин, ассоциированный с транскрипционными факториями обогащен гистоновыми метками активного хроматина, такими как H3K4me3 (Barski et al.2007; Li et al. 2012). Далее были установлены взаимодействия между промоторами разных генов. Слабые промоторы были существенно более активны, если оказывались вблизи более сильного промотора, это подтверждает наличие сложных комбинаторных взаимодействий в транскрипционных факториях.
В др. исследовании было установлено, что ретроэлементы (short interspersed elements (SINEs)) вблизи промоторов индуцибельных генов часто обнаруживаются в транскрипционных факториях после индукции транскрипции одновременно с доставкой транскрипционных факторов, помогающих локализовать соотв. гены в транскрипционных факториях (Crepaldi et al. 2013).

Nucleoli


рРНК , транскрибируемая с rDNA, присутствует в уникальной конформации в геноме. Индивидуальные гены расположены в виде повторяющейся ориентации голова-хвост. Транскрибируемые гены (transcription units; TU) разделены с помощью intergenic spacer sequences (IGS). Несколько десятков таких повторов формируют область ядрышкового организатора (NOR) которая у людей внедрена в обширную гетерохроматиновые области на коротких плечах 5 акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22, образуя цитогенетически обнаруживаемое вторичное сужение. Подсчитано, что в среднем существует 400 TUsв диплоидном геноме человека. Интересно, что количество TUs в разных NORs, также как и у разных индивидов варьирует и не все NORs обязательно участвуют в транскрипции (Roussel et al. 1993; Wachtler et al. 1986). Ряд NORs, участвующих в транскрипции ядрышек, находится под эпигенетическим контролем (McStay and Grummt2008; Schlesinger et al. 2009; Shiao et al. 2011).
Точное количество и степень изменчивости в составе индивидуальных повторов в основном неизвестны, в основном из-за отсутствия молекулярных методов анализа одиночных повторяющихся элементов в контексте генома. Для клеток HeLa подсчитано, что приблизительно 120 TUs активно транскрибируются в данный момент, это значит, что активно значительно меньше 50 % TUs (Jackson et al. 1998). Однако, было показано, что ряд повторов rDNA и ряд повторов, участвующих в транскрипции рРНК, варьируют у разных индивидов. Было продемонстрировано (Fig. 2a), что длины повторов также обнаруживают различия (Schofer et al. 1998), и сто некоторые наборы повторов имеют аберрантное палиндромное расположение, несовместимое с транскрипционной активностью (Caburet et al. 2005). Кроме того, одиночные повторы отличаются своим эпигенетическим состоянием, а неактивные повторы были найдены разбросанными между активными повторами (Zillner et al. 2015). Тандемное расположение массива rDNA обладает высокой степенью геномной нестабильности, которая может приводить к зависимой от возраста редукции количества TUs вследствие повреждающих средовых воздействий (Gibbons et al. 2015). Кроме того, NORs были идентифицированы как горячие точки рекомбинации с повышенными уровнями перестроек rDNA в тканях солидных опухолей (Stults et al. 2009).

Fig. 2 a Detection of a fragment of the transcription unit (red) and of the intergenic spacer (green) of rDNA, FISH on stretched DNA fibers, nuclear halo preparation, Bar 5 µm, bHeLa cell expressing histones H2B (green) and histone H3 variant H3.3 (red) which has been associated with transcriptional activity (Ahmad and Henikoff 2002), note that nucleoli are largely devoid of signal, structured illumination imaging, Bar 5 µm, c FISH with a probe covering the entire rDNA repeat showing an extracted rDNA loop, nuclear halo preparation
Эпигенетическое состояние хроматина ядрышек является критическим для контроля экспрессии генов в ответ на метаболические потребности [rev., (Hamperl et al. 2013)]. Тело rDNA гена, в частности стержневого промотора и вышестоящего контрольного элемента rDNA, богато CpG, следовательно, метилирование ДНК является важным регулятором экспрессии генов рРНК (Grummt and Pikaard 2003). Комплекс NuRD (nucleosome remodeling and histone deacetylase), который участвует в замалчивании генов в нуклеоплазме, действует как позитивный регулятор транскрипции рРНК за счет удержания промоторов rDNA гипометилированными и тем самым важен для сбалансированной транскрипции (Brown and Szyf 2008; Xie et al. 2012). Гипометилирование rDNA ассоциировано с болезнью Алцгеймера (Pietrzak et al. 2011), старением (Oakes et al. 2003) и преждевременным старением при синдроме Werner (Machwe et al. 2000). В раковой ткани уровни метилирования rDNA неупорядоченны по сравнению с нормальной тканью (Abranches et al.1998; Bacalini et al. 2014; Belin et al. 2009; Uemura et al. 2012; Yan et al. 2000). Zillner et al. (2015) недавно установили, что гипо- и гиперметилированные повторы сосуществуют в индивидуальных NORs нормальных и раковых клеток.
Три DNA methyltransferases DNMT1, DNMT3a и DNMT3b выполняют разные роли в транскрипции рРНК. Все три энзима обнаруживаются на промоторах неактивных rDNA генов. Специфические роли были идентифицированы для DNMT1 и DNMT3B относительно дифференциальной регуляции экспрессии рРНК с метилированных и не метилированных промоторов rDNA. Более того, DNMT1 кооперирует с сцепленной с HDAC2 ДНК и метилированием гистонов, чтобы репрессировать транскрипцию рРНК (Majumder et al. 2006). Клетки, лишенные DNMT1 и DNMT3b обнаруживают нарушения морфологии ядрышек и нарушения регуляции рекрутирования генов rDNA (Espada et al. 2007; Gagnon-Kugler et al. 2009).
Кроме того, некодирующие РНКs также влияют на состояние метилирования rDNA. Показано, что РНК, комплементарные промоторам rDNA, формируют триплексы ДНК:РНК, создавая тем самым мишень для DNA methyltransferase DNMT3b, индуцируя т.о. de novo метилированные CpG островки (Schmitz et al. 2010).
Модификации гистонов это др. процесс, с помощью которого транскрипция рРНК может регулироваться [rev. (McStay and Grummt 2008). Предыдущие исследования выявили два различных состояния rDNA с помощью psoralen методов перекрестного сцепления (Conconi et al. 1989). При одной конформации хроматин состоит из нуклеосом, которые недоступны для psoralen, тогда как при втором состоянии в основном свободном от гистонов он доступен для перекрестного сцепления. Сегодня полагают, что рРНК гены существуют, по крайней мере, в трех состояниях хроматина. При одном состоянии из замалчиваемого хроматина, состоящего из регулярной архитектуры нуклеосом в закрытой конфигурации, они обладают метками молчания подобно гипометилированным промоторам или повышенным триметилированием H3K9. Ассоциация промоторов rDNA с комплексом ремоделирования ядрышек NoRC поддерживает состояние молчания (Santoro et al. 2002). Транскрипционно активные TUs присутствуют в открытой конфигурации хроматина, характеризующегося активирующими метками, подобными гипометилированному промотору, и диметилированием H3K4. Активные гены содержат все необходимые компоненты аппарата транскрипции. Третья часть rDNA также присутствует в открытой конфигурации с неметилированными промоторами, но содержит бивалентные (репрессивные и активные) метки модификации гистонов и является ассоциированным с нуклеосомами ремоделирующим и деацилирующим комплексом (NuRD). Бивалентная природа этих эпигенетических меток вместе с тем фактом, что промоторы заняты частично аппаратом транскрипции (но без Pol I) показывают, что rDNA гены присутствуют в устойчивом состоянии (Xie et al. 2012). Авт. полагают, что переключение с устойчивого к активному состоянию обеспечивается фактором ремоделирования хроматина Cockayne syndrome B (CSB).
Точная природа открытой конфигурации хроматина тела активного rDNA гена остается спорной (Jones et al. 2007; Merz et al. 2008). Первоначальные psoralen данные по перекрестному сцеплению указывали на то, что активные TUs являются свободными от нуклеосом, что согласовывалось с электронными микрфотографиями Miller расплющенных препаратов. Считалось, что свободное от нуклеосом состояние гарантирует высокую насыщенность Pol I и скорость элонгации. Однако, используя метод chromatin endogenous cleavage (ChEC) , было установлено, что имеется немного нуклеосом в промоторном регионе активных TUs и что их позиция и эпигенетические модификации отличаются в активных и неактивных rDNA генах (Cong et al. 2013; Langst et al. 1998; Li et al. 2006; Majumder et al. 2010).
Истощенное по нуклеосомам тело гена и высокое насыщение молекулами Pol I, по-видимому, свидетельствуют против канонического расположения нуклеосом (Fig. 2b). Было предположено, что альтернативные состояния нуклеосом могут существовать в TU, таких как lexosome (Prior et al. 1983) (Lavelle and Prunell 2007), которые могут избегать psoralen перекрестного сцепления и обеспечивать прогрессию Pol I.
Недавно исследование на дрожжах показало, что Pol I-транскрибируемая нуклеосомная rDNA представлена "динамическим хроматином", состоящим из неканонических нуклеосом (Jones et al.2007). В др. исследовании было установлено, что TU, истощен по гистонам по сравнению с IGS (Zentner and Henikoff 2013) , а др. исследование показало, что существуют три разных архитектуры нуклеосом активных rDNA повторов у дрожжей (Johnson et al. 2013).
Интригующий вопрос, как истощение нуклеосом происходит и поддерживается. Одной из многих функций upstream binding factor 1 (UBF1) является деконденсация rDNA хроматина (Chen et al. 2004). В самом деле, обратная корреляция для насыщенности rDNA была обнаружена между гистонами и UBF в клетках человека (Gagnon-Kugler et al. 2009). UBF соединяется со всем телом гена rDNA и является критическим для формирования enhancesome, которые сводят вместе последовательности промотора и энхансера за счет образовании петли (Bazett-Jones et al.1994), функционально напоминая и возможно замещая нуклеосомы. Также активность по ремоделированию хроматина транскрипционным фактором TTF-1 участвует в становлении пространственной конформации rDNA путем образования петли, которая сводит вместе 3' и 5' концы TUs с помощью TTF-1, облегчая тем самым транскрипцию (Grummt and Langst 2013).
Комплекс FACT (facilitator of chromatin transcription), который специфически взаимодействует с H2A-H2B гистоновыми димерами, как было установлено, реорганизует, изгоняет или смещает нуклеотиды, чтобы облегчить процесс элонгации (Formosa 2012). Недавно rDNA-специфичная метка модификации гистонов, метилирования глютамина H2A, была идентифицирована, она предупреждает связывание FACT с H2A, и авт. полагают, что тем самым снижается изменение позиции гистонов в теле гена с помощью FACT (Tessarz et al. 2014).
Итак, хроматин и составляющие ДНК варьируют существенно между транскрипционными факториями и ядрышками. Базовые принципы экспрессии генов, такие как образование петель (Figs. 2c,3) приложимы к обоим случаям, хотя бы постулировано более сложное распложение ДНК для активных rDNA (Denissov et al. 2011).

Fig. 3 Sketch to compare morphology of transcription a in nucleoli and b in transcription factories. The transcription factory core (tf) is functionally related to the fibrillar center (fc), and transcription takes place at the surface of both entities. Active genes come into contact with the polymerases by chromatin loop formation out of silenced chromatin (gray dots). In nucleoli, nascent transcripts (brown) are predominately found in the dense fibrillar component (df) where РНК processing commences. A similar zone can be postulated for the transcription factory, Pol I…green dots, Pol II pink dots, gc granular component

Proteins


Transcription factories


Электронные спектроскопические изображения транскрипционных факторий подтвердили белковую массу в 10 MDa (Eskiw et al. 2008). Недавно возбуждение всех трех полимеразных комплексов стало возможно и массовая спектрометрия выявила несколько сотен белков в каждом комплексе (Melnik et al. 2011). В Pol II комплексах, Pol II были идентифицированы субъединицы, как и ожидалось в качестве транскрипционных факторов, специфичных регуляторов, таких как CTCF, РНК преобразующих факторов и структурных белков, таких как актин и lamins A/C и B.

Nucleoli


В изолированных ядрышках, проанализированных с помощью масс спектроскопии, было выявлено от 700 до 1400 белков (Ahmad et al. 2009; Andersen et al. 2005). Несмотря на большое количество белков плотность ядрышек была лишь вдове выше по сравнению с нуклеоплазмой, что, скорее всего, отражает динамичность компонентов ядра и также функции ядрышек помимо биогенеза рибосом (Boisvert et al. 2007).
Некоторые белки ядрышек участвуют в нескольких разных процессах. Одним из мультифункциональных белков является nucleolin [rev. (Durut and Saez-Vasquez 2015; Mongelard and Bouvet 2007)]. Nucleolin может соединяться с ДНК и РНК и участвует в транскрипции, процессинге рРНК и рибосомальном транспорте, а также в др. не связанных с рибосомами функциях. Nulceolin, как полагают, является белком, связывающим ядрышковый матрикс у растений (Minguez and Moreno Diaz de la Espina 1996). В ядрышках он обнаруживается в интерфейсе между FC и DF, в DFв теле генов rDNA, что согласуется с его ролью в экспрессии Pol I гена. Nucleolin, как было установлено, действует также гистоновый шаперон, связывающий H2A-H2B димеры и, следовательно, как гистоновый ремодельер. В этой связи nucleolin функционально напоминает нуклеоплазматический комплекс FACT, облегчающий тем самым Pol I транскрипционную элонгацию (Angelov et al. 2006). Более того, nucleolin участвует в предупреждении связывания репрессивного хроматинового комплекса NoRC, чтобы активировать rDNA повторы. Nucleolin обладает активностью helicase и поэтому может участвовать в репликации rDNA. В то же самое время, nucleolin участвует в первой ступени процессинга рРНК посредством взаимодействия с U3snoRNP. Nucleolin является т.о. основным из ядрышковых белков, участвующих в регуляции биогенеза рибосом на разных уровнях.
Др. многофункциональным ядрышковым белком является метилтрансфераза fibrillarin [rev. (Rodriguez-Corona et al. 2015)]. В ядрышках fibrillarin располагается в тех же самых компартментах, что и nucleolin, т.e., в FC/DF переходной зоне и в DF. Fibrillarin участвует в различных процессах модификации рРНК, таких как расщепление пре-рРНК, метилирование и сборка рибосом. Недавно было показано, что fibrillarin является метилтрансферазой, ответственной за активное Pol I-специфичное метилирование гистонового глютамина в H2AQ104, который связывает FACT (Tessarz et al. 2014). Fibrillarin является стержневым белком U3snoRNP (Baserga et al. 1991); т.о., можно предположить, что взаимодействие fibrillarin и nucleolin могут участвовать в модификациях гистонов и ремоделировании активного rDNA хроматина.

РНК polymerases


Transcription factories


Одним из главных преимуществ компартментализованной экспрессии генов является накопление необходимых транскрипционных факторов и особенно РНК полимераз. Транскрипционные фактории обычно обнаруживают в фиксированных клетках с помощью антител против Pol II, которая фосфорилирована по serine2 (Ser2P) в C-терминальном домене (CTD) у RPB1, крупнейшей субъединице Pol II. Разные паттерны фосфорилированя в CTD, как полагают, обусловливают разные функции [rev. (Phatnani and Greenleaf 2006)], и Ser2P-Pol II участвует в транскрипционной элонгации, тогда как Ser5P и Ser7P участвуют в инициации перед настоящей транскрипцией (Spilianakis et al. 2003). Однако, недавно идентифицировано несколько ацелирований и метилирований лизиновых остатков в CTD у RPB1, подтверждая сложность тонкой настройки сети для инициации и элонгации (Dias et al.2015).
В транскрипционных факториях было подсчитано, что в среднем 8 активных молекул Pol II доступны для транскрипционной инициации и элонгации.
Для инициации эффективной транскрипции Pol II энзимы формируют ассоциацию с 5 транскрипционными факторами в промоторной ДНК, создавая преиниационный комплекс (PIC) [rev. (Kornberg 2007)], этот процесс недавно был изучен в реальном времени (Fazal et al. 2015).

Nucleoli


В ядрышке регуляция транскрипции рРНК тесно связана с метаболическими потребностями клетки. Минимальная основа аппарата Pol I транскрипции состоит из Pol I, SL-1 и UBF [rev. (Russell and Zomerdijk 2006); об эволюционной консервации субъединиц полимеразы см. (Viktorovskaya and Schneider 2015)]. По сравнению с Pol II , где модификации CTD важны для инициации транскрипции, элонгации, завершение транскрипции рРНК зависит от упомянутых выше вспомогательных факторов. Эти факторы важны для доставки Pol I и для стабилизации Pol I на промоторах и они гипер-фосфорилированы, когда активны. UBF доставляется непосредственно на ДНК и он изменяет структуру rDNA так, что последовательность промотора и вышестоящего контролирующего элемента сводятся вместе (Putnam et al. 1994).

РНК


Transcription factories


Становится всё яснее, что РНКs, в особенности некодирующие РНКs, выполняют важные роли как регуляторы экспрессии генов, а также как детерминанты для структурных компонентов аппарата транскрипции. Недавно стало возможным изолировать транскрипционные фактории и проанализировать содержание в них РНК (Caudron-Herger et al. 2015a). Было установлено, что транскрипционные фактории содержат весь образующийся транскриптом клетки, включая некодирующие РНК, ассоциированные с энхансером РНК (eРНК), происходящие из повторов РНКs, и предшественники микро-РНК (Caudron-Herger et al. 2015a). Авт. полагают, что в особенности некодирующие РНКs могут оказывать влияние на регуляторные активности транскрипционных факторий. Остается посмотреть, действительно ли некодирующие РНКs участвуют в формировании петель хроматина, как это было предположено для аппарата РНКi, включая её РНК компонент (Lei and Corces 2006).

Nucleoli


В ядрышке Pol I транскрипты, происходящие с промоторов, расположенных в IGS регионе (структурно сходном с промотором гена Pol I), как было установлено, важными являются эпигенетические модификаторы транскрипции генов. Было продемонстрировано, что они являются критическими для целенаправленной доставки NoRC и тем самым для замалчивания rDNA (Mayer et al. 2006, 2008). Две длинные некодирующие (lncРНК), происходящие из IGS, важны для ремоделирования структуры ядрышек в ответ на внешне-средовые сигналы (Jacob et al. 2013). Помимо этих Pol I-зависимых транскриптов, Pol II транскрипция некодирующих РНКs была идентифицирована в IGS. Эти транскрипты, как было установлено, являются важными для замалчивания rDNA за счет рекрутирования комплекса NoRC и обеспечения модификаций гистонов (Bierhoff et al. 2014). Белковые компоненты аппарата РНКi , как было установлено, изменяют структуру ядрышек у Drosophila (Peng and Karpen 2007), и у растений, описано РНКi-обеспечиваемое молчание транскрипции рРНК (Preuss et al. 2008). Совсем недавно некодирующие РНКs из мобильных элементов были обнаружены, как участники поддержания структуры ядрышек (Caudron-Herger et al. 2015b). В этом исследовании было описано, что aluРНКs, происходящие в результате Pol II транскрипции, модулируют структуру ядрышек путем взаимодействия с белками ядрышек nucleolin и nucleophosmin. Это выявляет связь между Pol I и Pol II транскрипцией и может объяснить ранее обнаруженный феномен, что ингибирование Pol II транскрипции приводит к перестройке ядрышек. l

Dynamics of transcription sites


Dynamics of the constituents


Transcription factories


Предыдущее исследование продемонстрировало существование двух разных пулов ядерной Pol II, один пул (~75 % от всех молекул Pol II) является мобильным, а др. (25 %) оказывается временно неподвижным (Kimura et al. 2002). Путем экстракции растворимой фракции, было подтверждено, что неэкстрагируемая фракция является транскрипционно активной популяцией энзимов, которые концентрируются на поверхности транскрипционных факторий и здесь иммобилизируются (Eskiw et al.2008). Далее было предположено, что ДНК затягивается посредством полимеразы скорее, чем с помощью др. ближайших путей (Iborra et al. 1996). Получение изображений на живых клетках Pol II-зависимой транскрипции с помощью супер-разрешающей микроскопии подтвердило фокальное распределение полимеразы, видимой в фиксированных клетках, но привело к неожиданной картине динамики этого энзима. Было установлено, что время пребывания RPB1 молекул в фокусах транскрипции неожиданно короткое и что фокусы являются временными структурами (Cisse et al. 2013). Авт. подсчитали, что средняя продолжительность жизни фокусов примерно 5.1 сек. Короткая продолжительность жизни транскрипционных факторий сравнима с хорошо известным фактом, что регулярная транскрипция мРНК генов происходит в виде взрывов, т.e., в виде последовательных on-off состояний скорее, чем непрерывным способом. Авт. также продемонстрировали, что после стимуляции транскрипции продолжительность жизни транскрипционных факторий существенно увеличивается. Это согласуется с более ранним наблюдением на высоко транскрибируемых глобиновых генах в эритроидных клетках, авт. также установили, что эти гены были активны в виде почти беспрерывного способа транскрипции, тогда как др. изученные гены обнаруживали заметные периоды вкл.-выкл. (Osborne et al. 2004). Др. интересное наблюдение сделано (Cisse et al. 2013) в экспериментах, где Pol II транскрипция останавливалась, следовательно, образование транскрипционных факторий предшествует активации транскрипции.

Nucleoli


Молекулы Pol I и UBF преимущественно присутствуют в FCs и в меньшей степени в DF ядрышек (Mosgoeller et al. 1998). Используя получение изображений с помощью lifetime FRAP и математическое моделирование GFP-нагруженного UBF и некоторые GFP-нагруженные субъединицы Pol I (RPA), выявлена высокая скорость оборота, сходна с таковой для Pol II (Dundr et al. 2002a, b). Авт. подсчитали присутствие 200-400 [околоd 500 в клетках HeLa (Jackson et al.1998)] молекул Pol I на FC и 90-520 молекул UBF на FC (Dundr et al.2002b). Кинетика показала, что более чем 95 % молекул Pol I быстро обменивается, а скорость восстановление FRAP для Pol I и UBF, как было установлено, находится в пределах 30-40 сек. Инициация аппарата Pol I происходит каждые 1.4 сек, и в среднем затрачивается 140 сек., чтобы транскрибировать одну TU человека. Итак, эти находки относительно аппарата Pol I демонстрируют быстрые движения по ядрышку и приводят к заключению, что части аппарата вступают в ядрышко в виде отдельных субъединиц скорее, чем в виде предварительно собранного голоэнзима, как это считалось ранее (Dundr et al. 2002a). Кроме того, высокая скорость тока ядрышковых белков также была обнаружена с помощью протеомных подходов, базирующихся на масс-спектрометрии, чтобы сравнить рост ядрышек клеток HeLa в нормальных условиях и при ингибировании Pol I (Andersen et al. 2005). Более того, авт. установили, что только субнабор белков испытывает влияние со стороны ингибирования Pol I, это привело авт. к предположению, что структура ядрышка формируется не только как результат начала синтеза рРНК, но что основные белки остаются и в отсутствие транскрипции (Andersen et al. 2005). Это может быть объяснено тем, что разные не рибосомальные функции ядрышек [rev. (Boisvert et al. 2007)] играют роль в формировании финальной структуры ядрышка.
Итак, эти данные демонстрируют сходство с высокой подвижностью транскрипционных субъединиц как Pol I, так и Pol II. В терминах процесса транскрипции наблюдается переход от on-off состояний (напр., генов домашнего хозяйства) к почти непрерывной (строго экспрессируются гены во время дифференцировки) до непрерывной транскрипции (rDNA). Морфологически альтерации происходят на очень различающихся временных шкалах, секунды в Pol II транскрипционных факториях и минуты для ядрышек, если, напр., обрабатываются транскрипционными ингибиторами или энхансерами.

Formation, maintenance, and disassembly of transcription foci


Transcription factories


Количество фокусов с постоянно транскрипцией Pol II внутри ядер значительно меньше, чем количество транскрибируемых генов. В самом деле, было показано, что TFs содержат более одного транскрибируемого гена. Это требует, чтобы хроматин был организован так, чтобы гены могли приходить в контакт. Петли, устанавливаемые в результате промотор-энхансер взаимодействий (PEIs) важны, хотя др. взаимодействия, такие как промотор-промотор, энхансер-энхансер или инсулятор-инсулятор также возникают.
Были предложены разные модели механизмов, с помощью которых PEIs формируются в ядрах. Было показано, что фракция Pol II сохраняется в ядрах после процедур экстракции, указывая, что они закреплены на поддерживающих подлежащих структурах (нуклеоскелете) (Jackson and Cook 1985). Поскольку было установлено, что сохраняющаяся фракция обогащена активной Pol II, то была предложена модель, согласно которой полимераза фиксирована и матричная ДНК протягивается через транскрипционный комплекс во время транскрипции. В соответствии с этим мнением транскрипционные фактории и являются фактически предварительно собранными организованными структурами, а хроматиновые петли перемещаются в направлении транскрипционных факторий. Некоторые находки трудно примирить с этой моделью, такие как те, что Ser2P обнаруживается также вне транскрипционных факторий во время элонгации, что не согласуется с фиксацией молекул полимеразы (Ghamari et al. 2013), или то, что высокая подвижность субъединиц Pol II обнаруживается в живых клетках (Cisse et al. 2013).
Тем не менее модель транскрипционных факторий ценится широко [e.g., (Chen et al. 2015; Li et al. 2012; Osborne et al. 2004; Rieder et al. 2014; Schoenfelder et al. 2010)] for reviews, see (Edelman and Fraser 2012; Papantonis and Cook 2013). Дальнейшие подтверждения модели предварительной сборки обнаруживаются в исследованиях индукции глобиновых генов и позиционирования LCR , где было показано, что LCR, первоначально расположенный в репрессивной периферии ядра, транслоцируется внутрь ядра, благодаря образованию петли, и только затем начинается мощная транскрипция (Ragoczy et al. 2006; Schubeler et al. 2000) , которая д. располагаться в транскрипционных факториях (Lee et al. 2011; Schoenfelder et al. 2010; Zhou et al.2006). IВ исследовании LCR гена hGH-N (human pituitary growth hormone), было показано, что DNase I-hypersensitive site I (HSI) в LCR действует ка важный фактор, чтобы поддержать ассоциацию гена с транскрипционными факториями в течение многох лет развития (Ho et al. 2013). Напротив, вызванная лекарствами остановка транскрипции не приводит к разборке транскрипционных факторий, но они остаются стабильными с закрепленными генами (Ghamari et al. 2013; Mitchell and Fraser 2008; Palstra et al. 2008) несмотря на высокую мобильность компонентов транскрипционных факторий в живых клетках (Cisse et al.2013). Кроме того, транскрипционные фактории могут существовать в устойчивом состоянии обогащенные модификацией Ser5P Pol II, но при этом отсутствует Ser2P (Ferrai et al. 2010), или они могут давать убежище сбалансированным генам (Larkin et al. 2012), в обоих случаях это позволяет быстро восстанавливать экспрессию генов.
Остается спорным вопрос, являются ли транскрипционные фактории предварительно собранными драйверами организации ядра или компартментализация транскрипции является конечным результатом упаковки хроматина и соотв. расположения активных генов в пространстве ядра (Sutherland and Bickmore 2009). Два сценария не являются взаимно исключающими и выдвигается привлекательная гипотеза, что транскрипционные фактории могут формироваться как следствие транскрипции высоко активных генов, при этом сильные промоторы и те, что вновь формируют транскрипционные фактории, способны привлекать и др. гены (Sutherland and Bickmore 2009). Можно предположить, что эти вновь сформированные транскрипционные фактории могут содержать молекулы Pol II , позиция которых фиксирована.
Принимая во внимание структурные основы организации ядра, выдвигаются гипотезы в диапазоне от существования ядерного матрикса или нуклеоскелета со стохастической самосборкой макромолекулярных комплексов, управляемых с помощью биохимических или биофизических сил. В самом деле, исследования по моделированию подтверждают возможность генерации кластеров (Canals-Hamann et al. 2013), хотя биофизические силы определенно являются важными игроками в модели предварительной сборки (Brackley et al. 2013).
Начало митотических делений приводит к разбросанным транскрипционным факториям. Однако, становится всё более очевидным, что транскрипционно активные гены в предыдущей интерфазе обладают эпигенетической памятью об активном состоянии (mitotic bookmarking). Эта метка передается через митоз в G1 ядер дочерних клеток и, как полагают, обеспечивает мощную экспрессию того же самого набора генов, активных в материнской клетке. Механизм внесения закладок использует специфические модификации гистонов, замещение гистоновых вариантов или поддержание общего транскрипционного фактора TIFIID, соединяющегося с промотором [rev. (Zaidi et al. 2010)]. Однако, компоненты Pol II отсоединяются от промоторов в профазе и впоследствии импортируются в ядра дочерних клеток в G1 (Prasanth et al. 2003).

Nucleoli


Как упоминалось выше, в ядрах транскрипция происходит также в фокусах на месте разделе между FC и DF и, что важно, NORs из разных хромосом д. собраться в соотв. ядрышках. Обычно NORs располагаются на периферии ядрышек, где они находятся в своем молчащем состоянии и отсюда они испускают петли из повторов rDNA в ядрышки, которые транскрибируются. Конвергенция акроцентриков, NOR-несущих хромосом человека происходит в ранней G1 фазе, когда хроматин относительно мобилен, прежде чем CTs займут стабильную позицию (Walter et al. 2003). Механизмы, с помощью которых NORs собираются вместе и в конечном итоге сливаются, неясен и Pol I транскрипция, по-видимому, несущественна для слияния NOR (Dousset et al. 2000). Дистальные и проксимальны последовательности, располагающиеся по флангам NOR, как было установлено, участвуют в поддержании целостности ядрышек и возможно в слиянии NOR (Floutsakou et al. 2013), но не формировании ядрышек (Grob et al. 2014). NORs д. быть компетентными к слиянию, которое критически зависит от UBF присутствия, удерживая их в не гетерохроматиновом состоянии (Grob et al. 2014). Не только слияние NOR изучено недостаточно, также становление своеобразного расположения трех компартментов ядрышек остается загадочным. Ядрышки разных типов клеток часто обнаруживают характерную морфологию.
Судьбы аппарата транскрипции rDNA во время клеточного цикла существенно отлична от Pol II транскрипции. Главные составляющие аппарата транскрипции Pol I, такие как Pol I и UBF остаются связанными с (предварительно активированными) NORs в ходе всего митоза [rev. (HeРНКndez-Verdun 2011)], составляя эффективный путь для внесения митотических закладок. В профазе, компоненты ядра начинают диссоциировать, а в поздней профазе Pol I транскрипция останавливается за счет фосфорилирования транскрипционных факторов посредством CDK1-cyclin B kinase. Pol I транскрипция возобновляется уже в телофазе за счет ингибирования CDK1 и сборка ядрышка начинается в ранней G1 перед слиянием NORs. Для формирования собственно ядрышек Pol I транскрипции недостаточно и необходимы компоненты аппарата преобразования рРНК, которые обнаруживаются в специальных ядрышковых тельцах, наз. pre-nucleolar bodies (PNBs), таких как snoРНКs, рибосомальные белки и не подвергнутые процессингу 45S рРНК, которая синтезируется перед завершением транскрипции. Некоторые составляющие декорируют митотические хромосомы и будучи перенесены на ядрышки в G1 обеспечивают образование нормальных ядрышек после их слияния (HeРНКndez-Verdun 2011).
Интересно, что ряд ядрышек варьирует даже внутри одной популяции линии клеток, хотя существуют менее активные NORs, чем десяток NORs человека (Carpenter et al.2006). Структура ядрышка постоянно присутствует в течение всей интерфазы, хотя она и меняет свою структуру драматически в зависимости от потребностей клеток в рибосомах. Напр., покоящиеся лимфоциты содержат ядрышки с максимум 9 FCs, тогда как после стимуляции количество FCs увеличивается примерно до 80 (Haaf et al. 1991, это сопровождается существенными изменениями в количестве и размере ядрышек (Fig. 4) (Wachtler et al.1982). Ранее сообщалось, что количество активных rDNA повторов является стабильным в течение всей интерфазы (Conconi et al. 1989). Усиление активности транскрипции может также обеспечиваться эпигенетической индукцией (Stefanovsky and Moss 2008) или увеличением присутствия в TUs молекул Pol I. Позднее было показано на примере дрожжей (French et al. 2003), где имеются линии с пониженными количествами rDNA повторов, компенсирующих их дефицит за счет более высокого присутствия Pol I. В самом деле, величина теоретического минимального присутствия у дрожжей предопределяется соотношением 1 Pol I молекула на 35 nt (ToРНКletti et al. 1992) это, по отношению к человеку, д. увеличивать приблизительно до 380 молекул на TU вместо подсчитанных 100 (Haaf et al. 1991), подтверждая, что некоторый потенциал усиления транскрипции рРНК человека. С др. стороны, в клетках человека, как было установлено, пул rDNA генов не является статичным, а UBF предопределяет количество активных генов (Sanij et al. 2008).

Fig. 4 Human peripheral lymphocytes a unstimulated and b after 72-h stimulation, FISH to detect part of the TU of rDNA showing significant alterations of rDNA arrangement in the course of differentiation, nuclear outline indicated (yellow)

Подходы генной инженерии проливают свет на потребности для формирования ядрышка в клетках человека. Эктопические включения UBF-связывающей последовательности в линии клеток создают "псевдо-NOR," т.e., вторичные сужения в сайте интеграции после загрузки UBF (Mais et al. 2005). Эта вставка не содержит последовательность Pol I промотора и не образует функциональных ядрышек, хотя Pol I рекрутируется с помощью UBF. Это группа продолжила продукцию "neo-NORs" (Grob et al. 2014), которые содержали полностью функциональные эктопические повторы rDNA, которые активно продуцировали рибосомы и некоторые из этих NORs сливались с эндогенными NORs, подтверждая существование "NOR-территорий" (Grob et al. 2014).
Пример совместной локализации нео-NORs и эндогенных NORs в однос дрышке иногда напоминает совместную локализацию некоторых генов в одной Pol II транскрипционной фактории. Сходные транскрипционные фактории продемонстрированы также в случаях ядрышек, структурная фиксация активных молекул Pol I в FC (Dickinson et al. 1990), также как и предпочтительное удержание TU в противовес IGS последовательностям в клетках HeLa (Weipoltshammer et al. 1996). Также в случае ядрышек биофизические силы и самосборка, как полагают, являются факторами, участвующими в формировании и поддержании ядрышка [rev. (Hancock 2014; Lam and Trinkle-Mulcahy 2015)].

Conclusions


РНК polymerase I transcription has often been put forward as paradigmatic for nuclear transcription. Concerning the constituents, Pol I and Pol II transcription are largely different. However, on a functional level, analogies can be found which may rely on general principles of biological organization. Chromatin loop formation is one hallmark that acts as prerequisite of focal transcription in both transcription factories and nucleoli. Another common property is the high mobility of some of the constituents.
The underlying organizing principles of focal transcription and of nuclear organization in general are controversially discussed and range from fixation to an underlying support such as nuclear matrix or nucleoskeleton to self-organization and compartmentalization based on stochastic biochemical and biophysical principles. The methodological armory for studying biophysical forces is restricted, and novel approaches are needed to reveal if one of these possibilities or combinations thereof occur.
In addition to basic consideration on nuclear organization, focal nuclear transcription might have consequences relevant for medicine. In this respect, it was postulated that the proximity of genes present in an open and transcriptionally active state at transcription factories might have potentially detrimental consequences for genome stability and chromosomal translocations ultimately leading to cancer (Osborne 2014), and it seems as if similar conclusions can be drawn for the stability of the rDNA cluster [e.g., (Diesch et al.2014; Harding et al. 2015)]. Moreover, involvement of Pol I transcription in many disease-related pathways has been demonstrated (Quin et al. 2014). Furthermore, Pol I transcription has become a promising target for therapeutic intervention by the introduction of cancer-specific, Pol I inhibiting small-molecule drugs (Drygin et al. 2011).