Гомологичная рекомбинация (HR) широко используется для облегчения обмена последовательностями ДНК между целевым хромосомным локусом и гомологичной матрицей, содержащей определенное изменение [1, 2, 3]. HR неэффективна во многих типах клеток и поэтому сайт-специфические разрывы двойной нити ДНК (DSB) часто вызываются с помощью сайт-специфических самонаводящихся эндонуклеаз или искусственно созданных нуклеаз, таких как с цинковыми пальчиками и TALE нуклеазы. Такие эндонуклеазы доставляют к желаемому геномному локусу, чтобы стимулировать последующую репарацию ДНК [4, 5]. Совсем недавно система ассоциированного с типа II бактериальными clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) белка 9 (Cas9) оказалась эффективным инструментом для дальнейшей разработки стратегии по целенаправленному воздействию на гены [6, 7, 8, 9, 10] благодаря простоте целанаправленного воздействия на любой локус для его расщепления с помощью одиночного белка и программируемой одиночной наводящей РНК или гидРНК (sgRNA).
Сайт-специфические DSB могут эффективно стимулировать HR примерно в 10000 раз [11, 12]. Несмотря на это конкурентный путь non-homologous end-joining (NHEJ) репарации DSB часто предпочтителен и часто приводит к небольшим инсерциям/делециям (indels) или хромосомным перестройкам, особенно в клетках млекопитающих [13, 14]. Т.о., этот путь репарации вызывает главную проблему безопасности для стратегии целенаправленного воздействия на гены, особенно для терапии генов и продукции трансгенных животных [15, 16]. Ряд исследований был сконцентрирован на увеличении эффективности, специфичности и гибкости CRISPR/Cas9 системы [14, 17, 18], но сообщения об вставках крупных функциональных генов при редактировании генома млекопитающих, ограничены.
В данном исследовании разработан способ иммунопреципитации хроматина (ChIP) каталитически неактивного двойного мутантного (D10A и H840A) Cas9 (dCas9) белка [7, 19] для детекции сайта связывания белка в телячьих плодных фибробластных клетках (BFFs) и последующего секвенирования (ChIP-seq). В соответствии с уже описанными находками [6, 20], одиночные Cas9 nickase (Cas9n)-обусловленные разрывы одиночной нити (SSB) обладают потенциалом в целом избегать пути NHEJ репарации. Поэтому были использованы Cas9n-индуцируемые SSB, чтобы стимулировать homology-directed repair (HDR) и тем самым предоставить надежную альтернативу для инсерции генов и создания трансгенных животных. После систематического отбора сайтов мишеней и колоний трансгенов, мы удачно получили 9 коров со вставкой экзогенного гена natural resistance-associated macrophage protein-1 (NRAMP1) с помощью стратегии Cas9n. Более того, выявлено снижение эффектов вне мишени в трансгенных BFFs и коровах. Далее было продемонстрировано, что обусловленное Cas9n внедрение
NRAMP1 предоставляет крупному рогатому скоту повышенную устойчивость к туберкулёзу.
Discussion
Геномное редактирование быстро развивается благодаря открытию программируемых искусственных эндонуклеаз, таких как ZFN, TALEN и Cas9. Они вызывают сайт-специфические DSBs ДНК и эти DSBs могут усиливать эффективность HDR примерно на два порядка величин и/или запускать NHEJ и тем самым приводить к целенаправленному мутагенезу [48]. ZFNs и TALENs нуждаются в сложных искусственных преобразованиях высоко специфичных ДНК-связывающих доменов для соотв. целенаправленного воздействия. Напротив, система CRISPR/Cas9 нуждается лишь в небольшой искусственной sgRNA, чтобы направлять Cas9 эндонуклеазу на действительно любое место генома [14]. Благодаря высокой эффективности, CRISPR/Cas9 технология может с готовностью одновременно воздействовать на мишени нескольких локусов, включая оба аллеля того же самого гена [7, 10, 49].
Однако, принимая во внимание разнообразные и существенные эффекты вне мишени, остается под вопросом специфичность в этой системе. Кстати, нет определенных правил для предсказания Cas9 специфичности, но некоторые мутанты и соотв. стратегии были предложены для минимизации событий разрезов вне мишени. Эти стратегии включают использование двойных nickase [19, 20], коротких sgRNAs [50], и слияние белка, содержащего каталитически неактивную dCas9 и эндонуклеазу Fok1 [8, 51]. Поскольку каждый одиночный indel в неожиданном сайте вне мишени может быть гибельным, то необходимо сделать генную терапию точной.
Данное исследование демонстрирует использование одиночной Cas9n впервые на крупном рогатом скоте. Эта техника имеет целью эффективно индуцировать вставки гена в определенный локус телят и получать трансгенных коров с пониженными эффектами вне мишени. Более того, было показано, что вставленный ген NRAMP1 экспрессируется правильно и дает коров с повышенной устойчивостью к инфекции M. bovis, микобактериального патогена, вызывающего у коров туберкулёз.
Из-за значительного влияния специфичности помимо мишени, предполагаемый трансгенный локус и специфический сайт мишень д. отбираться путем дотошного обдумывания. Оценка практических функций CRISPR/Cas9 в индивидуальных сайтах является важной целью из-за различных частот мутаций в 14 компьютерами предсказанных сайтах мишенях (Fig. 1d). Поэтому мы осуществляли систематический процесс отбора, куда входили детекция эффективности разрезов, детекция эффективности рекомбинации и картирование специфичности связывания, из отобранных сайт мишень 45 гарантировала её качественную работу. Более того, данное исследование подтвердило, что этот сайт мишень может предоставлять внутренний трансген со стабильной и ткане-специфичной экспрессией (Fig. 7b and c) без нарушенй соседних генов (Figs. 6a, b, and 7a). Эта находка показывает, что сайт мишень 45 из F-A локуса может безопасно обладать сайт-специфической инсерцией гена в геном телят.
Точный механизм, с помощью которого SSB приводит к меньшему эффекту вне мишени и снижению токсичности по сравнению с DSB до конца непонятен [52]. В общем, большинство хромосомных вырезок одной нити хромосом быстро выявляется и удаляется с помощью пути репарации однонитчатых разрывов (SSBR) в ходе всего митотического цикла и не происходит геномных модификаций во время этого процесса [53, 54]. Следовательно, одиночные Cas9n-индуцированные HDRs обычно обнаруживают низкую эффективность в некоторых типах клеток и было предположено, что этот феномен д. быть поддержан финансово для специфического генного таргетинга [5]. Базируясь на довольно высокой величине indel (~47%) при WT CRISPR/Cas9 в отобранном сайте мишени 45, использование Cas9n-индуцированных одиночных SSB для стимуляции HDR с последующей инсерцией гена технически выполнимо. Кроме того, существенно более высокая эффективность генерации трансгенных BFFs (~18% позитивных колоний) и коров (9/11 новорожденных телят) с одиночной Cas9n подтверждает, что одиночная Cas9n может рассматриваться как настоящая альтернатива классическому WT Cas9 методу. Недавнее исследование сконцентрировалось на улучшении специфичности Cas9 нуклеазы посредством рационального преобразования Cas9 белка [55, 56]. Рассматривая эти инструменты в развитии, одиночная никаза для отобранного сайта д. обладать выдающейся исполнительностью.
В соответствии с нашими предыдущими исследованиями [43, 44], получение с гомозиготно вставленным трансгеном колоний посредством осуществления операции целенаправленного воздействия на ген, было трудным для BFFs. Хотя ни одна из 57 позитивных колоний не обнаруживала биаллельного внедрения (knockin) NRAMP1 по сайту мишени 45, indels наблюдались в других аллелях в нескольких клонах WT Cas9 группы (Additional file 3: Table S6). Эта находка подтверждает, что Cas9 может разрезать оба аллеля. Поэтому получение, гомозиготных коров для размножения станет предметом будущих исследований путем увеличения количества трансгенных колоний или использования малых молекул и белков, которые будут увеличивать HDR [57, 58].
Относительно MDMs, которые были изолированы от трансгенных животных, наблюдалась более мощная экспрессия NRAMP1 вследствие контакта с M. bovis по сравнению с MDMs от обычных коров. Однако не выявлено различий в конституитивной экспрессии уровней NRAMP1 между этими группами. Трансгенные NRAMP1 коровы обладали повышенной устойчивостью к M. bovis. Эта находка может быть связана с активностью апоптического пути после инфекции, который может снижать эффективность механизма внутриклеточного выживания M. bovis [59]. Мы полагаем, что открытая геномная структура локуса со вставкой NRAMP1 может усиливать взаимодействия с активаторами транскрипции, но специфический механизм c помощью которого NRAMP1 предопределяет судьбу макрофагов д. быть исследован далее.
