Посещений:
ЦЕНТРОСОМЫ: ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ



Роль GTPase RAN

The GTPase RAN regulates multiple steps of the centrosome life cycle
• Patrizia Lavia
Chromosome Research January 2016, Volume 24, Issue 1, pp 53-65, 2016

Growing lines of evidence implicate the small GTPase RAN, its regulators and effectors-predominantly, nuclear transport receptors-in practically all aspects of centrosome biology in mammalian cells. These include duplication licensing, cohesion, positioning, and microtubule-nucleation capacity. RAN cooperates with the protein nuclear export vector exportin 1/CRM1 to recruit scaffolding proteins containing nuclear export sequences that play roles in the structural organization of centrosomes. Together, they also limit centrosome reduplication by regulating the localization of key "licensing" proteins during the centrosome duplication cycle. In parallel, RAN also regulates the capacity of centrosomes to nucleate and organize functional microtubules, and this predominanlty involves importin vectors: many factors regulating microtubule nucleation or function harbor nuclear localization sequences that interact with importin molecules and such interaction inhibits their activity. Active RANGTP binding to importin molecules removes the inhibition and releases microtubule regulatory factors in the free productive form. A dynamic scenario emerges, in which RAN is pivotal in linking spatiotemporal control of centrosome regulators to the cell cycle machinery.
Малая GTPase RAN высоко консервативна среди клеток растений, грибов и животных и регулирует многие клеточные процессы, испуская сигналы, которые детерминируют локализацию, а, следовательно, и функцию большого количества ключевых белков. RAN обильна в интерфазном ядре, на митотическом аппарате и хромосомах. В клетках млекопитающих небольшая фракция пула клеточной RAN также стабильно локализуется на центросомах, а эффекторы RAN ассоциируют с центросомами разными способами во время клеточного цикла. Оказывается, что RAN, посредством своих эффекторов, играет роль практически во всех аспектах клеточного цикла центросом. Хотя всё ещё остаются пробелы в нашем знании, удивительный прогресс достигнут в понимании, как эта GTPase контролирует функции центросом.
Прежде обсуждения роли RAN на центросомах, воспроизведем общий механизм действия, а именно, нуклео-цитоплазматический транспорт и сборку митотического веретена. Подобно всем GTPases, RAN совершает цикл между GTP-связанным и GDP-связанным состояниями. GTP-нагруженная RAN соединяется с большим классом эффекторов, принадлежащих к семейству ядерных транспортных рецепторов. Как будет описано ниже, RANGTP взаимодействия с эффекторами имеют критическое значение для клеточных процессов, с которыми они оперируют.
Цикл между альтернативным гуаниновый нуклеотид-связанным состоянием RAN обеспечивается с помощью фактора, заменяющего гуаниновый нуклеотид, белком, взаимодействующим с хроматином, наз. регулятором конденсации хромосом 1 (RCC1), который заменяет GDP на GTP на RAN, и с помощью RAN GTPase-activating protein 1 (RANGAP1), который генерирует RANGDP. В клетках млекопитающих скорость оборота нуклеотида на RAN увеличивается в присутствии RAN-binding protein 1 (RANBP1), некаталитического компонента, который связывает RANGTP и стимулирует гидролиз с помощью RANGAP1, тогда как обмен подавляется с помощью RCC1. RAN является снующим белком, и её связанные с гуаниновым нуклеотидом формы пространственно компартментализованы в интактных клетках. Поскольку RCC1 связан с хроматином, он нагружает на RAN GTP в ядре. RANGAP1 является цитоплазматическим белком, особенно концентрируется на цитоплазматической стороне ядерной оболочки (NE): это вызывает гидролиз RANGTP до RANGDP в цитоплазме. Упрощенная схема RAN цикла в интерфазных клетках представлена на Fig. 1.



Fig. 1 A simplified overview of the RNA cycle and its effectors in interphase. RANGTP (green) is generated in the nucleus by the RCC1 guanine exchange factor and is converted to RANGDP (red) by the GTPase-activating factor RANGAP1 aided by RANBP1. RANGTP has high affinity for the nuclear import vector importin beta. RANGTP and importin beta have opposite activities (represented by the blunted line) in determining the free (biologically productive) or the inhibited state of import cargoes tagged by nuclear localization signals, NLS (left panel). RANGTP also has high affinity for the export vector CRM1 and facilitates CRM1 function (symbolized by the green bidirectional arrow) by stabilizing its interaction with cargoes carrying nuclear export sequences, NES (right panel)

При митозе, когда разрывается NE у высших эукариот, RCC1 остается связанным с митотическими хромосомами, тогда как RANGAP1 ассоциирует с микротрубочками (MTs) веретена и в меньшей степени с кинетохорами (KTs). Благодаря асимметричной позиции регуляторов, RANGTP концентрируется вокруг хромосом и уменьшается при удалении от них. Такое глобальное распределение первоначально было описано в работе с использованием экстрактов из ооцитов амфибий для изучения сборки веретена, которая выявила критическую потребность в RANGTP. В ооцитах хромосомы занимают относительно небольшой объем; поэтому концентрирующийся вокруг хромосом концентрационный градиент RANGTP создает эффективный пространственный ориентир для взаимодействия с эффекторами и, следовательно, для процессов, которые они регулируют (Caudron et al. 2005). Соматические клетки обычно меньше по размеру по сравнению с ооцитами и хромосомы занимают больший объем. RANGTP также генерируется с помощью RCC1 вокруг хромосом соматических клеток (Kalab et al. 2006), но распределение компонентов RAN сети подвержено действию специфических адаптаций и тонкой настройке в определенных клеточных сайтах и/или в окнах клеточного цикла. Споры о пространственном распределении и способе действия RAN в разных экспериментальных системах описаны в некоторых обзорах (Ciciarello et al. 2007; Clarke and Zhang 2008; Kalab and Heald 2008; Roscioli et al. 2010; Forbes et al. 2015). Здесь мы сфокусируемся на роли RAN в контроле функции центросом в соматических клетках.

The GTPase RAN is a centrosomal component throughout the cell cycle in human cells


Относительно небольшая фракция из всего пула клеточной RAN составляет конструктивный компонент центросом. Несколько комплементарных подходов привели к идентификации существования центросомной фракции RAN (Kеryer et al. 2003a). Во-первых, иммунофлюоресценция (IF) и с иммунозолотом ЭМ выявили RAN сигналы на центросомах в интактных культивируемых клетках млекопитающих. Кроме того, центросомная фракция была очищена из культивруемых эпителиальных клеток и проанализирована с помощью IF и Western blot. Эти подходы продемонстрировали, что RAN тесно ассоциирует с центросомами посредством взаимодействий, которые сохраняются даже при жестком экстракционном буфере, и она диссоциирует от центросом только в присутствии сильного денатурирующего агента, такого как мочевина (Keryer et al.2003a).
Медиатор взаимодействия RAN's с центросомами был идентифицирован в виде A-Kinase Anchoring Protein AKAP450 (Keryer et al. 2003a), гигантского каркасного белка, который привлекает несколько белков к перицентриолярному материалу (PCM), включая фосфатазы и киназы [напр.. протеин фосфатаза PP2A и протеин киназа PKA (Takahashi et al. 1999), специфические изоформы casein kinase 1 (Sillibourne et al. 2002) и др.]. AKAP450 и RAN локализуются совместно на центросомах и совместно преципитируются в ходе всего клеточного цикла. AKAP450 обладает доменом, нацеленным на центросому, в C-терминальном регионе; избыточная экспрессия одного этого домена перемещает эндогенный полной длины белок доминантно негативным способом (Keryer et al. 2003b). Интересно, что это заодно перемещает эндогенную RAN из центросомы (K?ryer et al. 2003a). Эти данные указывают на то, что AKAP450 взаимодействует с RAN посредством доменов вне региона, закрепляющего на центросоме, возможно используются биспиральные регионы AKAP450, которые обеспечивают взаимодействия с белковыми партнерами.
Использование конформационных антител, специфичных для GTP-связанной RAN формы (Richards et al. 1995), продемонстрировало, что, по крайней мере, частично центросомная RAN присутствует в виде RANGTP (Keryer et al. 2003a). Как может возникать центросомная RANGTP? Центросомы млекопитающих лишены RCC1 обменного фактора и поэтому маловероятно, что RAN нагружается GTP внутри центросом. Скорее всего, некоторые RANGTP выходят из ядра, где они генерируются, и непосредственно поставлются в центросомы. Центросома закреплена на цитоплазматической стороне NE вблизи комплекса ядерной поры (NPC) (Agircan et al.2014): возможно, что соединение NPC-центросома создает путь, посредством которого AKAP450 рекрутирует фракцию RANGTP, покидающую ядро через NPCs.
Центросомы млекопитающих также содержат RANBP1 (Di Fiore et al. 2003). RANBP1 модулирует связанное с нуклеотидом состояние RAN способом, который зависит от присутствия или отсутствия RAN регуляторов (Bischoff et al.1995): RANBP1 стимулирует гидролиз GTP на RAN, если присутствует RANGAP1 (in vivo это обычно происходит по всей цитоплазме интерфазных клеток). В отсутствие RANGAP1, однако, RANBP1 оказывает противоположный эффект и стабилизирует с GTP связанную RAN. In vivo, эта ситуация может происходить на центросомах. Препараты очищенных центросом лишены RANGAP1 (Di Fiore et al. 2003). RANGAP1 локализуется в цитоплазме и обогащен на цитоплазматической стороне пор NPC интактных интерфазных клеток. При митозе он накапливается на микротрубочках (MTs) веретена и на с MT-связанных кинетохорах (KTs), однако, останавливается на минус конце MT, непосредственно перед тем, как MTs соединятся с центросомами (Joseph et al.2002, 2004). Т.о., центросомы содержат RAN и RANBP1, но не RANGAP1.
Итак, фракция клеточного пула RAN располагается на центросомах и присутствует, по крайней мере, частично как RANGTP. Можно предположить (хотя это не доказано), что оборот RAN на центросомах зависит от циклов прохождения RANGTP из ядра в центросомы через NPC, что сопровождается зависимым от AKPA450 закреплением на них. Поскольку RANGAP1 исключен из центросом, то связывание RANBP1 с RANGTP может стабилизировать центросомную RANGTP. В этих условиях прирожденно низкая активность GTPase у RAN, по-видимому, недостаточна, чтобы вызывать истощение RANGTP на центросомах, позволяя RANGTP действовать посредством своих эффекторов на центросомах.

RAN regulates the microtubule nucleation capacity of centrosomes


RAN регулирует нуклеацию и стабилизацию митотических MT как in vitro, так и в интактных клетках (rev. Ciciarello et al. 2007; Kalab and Heald 2008; Clarke and Zhang 2008; Cavazza and Vernos 2015). Короче, несколько факторов вместе наз. spindle-activating factors (SAFs), стимулируют нуклеацию или организацию MT. Большинство SAFs несут nuclear localization signals (NLSs), которые взаимодействуют с молекулами importin и оказываются неактивными, если вовлечены в такое взаимодействие. RANGTP связывает импортины и высвобождает SAFs на свободу в их активной форме.
Самые ранние экспериментальные доказательства, что RANGTP активирует SAFs получены в исследованиях сборки веретена в экстрактах яиц амфибий (summarized by Kahana and Cleveland 1999). RANGTP-зависимая активация SAFs, как было установлено позднее, является консервативным механизмом как у лишенных центросом (Xenopus ооцитов), так и имеющих центросомы (клетки млекопитающих) (Carazo-Salas et al. 2001). Два NLS-содержащих SAFs были идентифицированы, а именно TPX2 (Gruss et al. 2001) и NuMA (Nachury et al. 2001; Wiese et al. 2001), оба соединяются с молекулами импортинов. RANGTP высвобождает SAFs из комплексов с импортином и позволяет им участвовать в организации веретена. Список SAFs, контролируемых с помощью импортинов и RANGTP сегодня довольно обширен (Kalab and Heald 2008; Forbes et al. 2015).
Как упоминалось выше, избыточная экспрессия AKAP450, нацеленного на центросомы домена в клетках человека, устраняет оба эндогенных AKAP450 и RANGTP с центросом. Gamma-tubulin не устраняется в этих условиях, однако, нуклеация MT нарушена как при митозе, так и в интерфазе (K?ryer et al. 2003a). Нарушение способности нуклеации MT из этих центромер несмотря на присутствие gamma-tubulin, строго подтверждает потребность в RANGTP на центросомах.
Дальнейшее подтверждение этой идеи получено при анализе центросом спермиев перед и после приобретения компетентности к нуклеации. Уже давно наблюдалось, что когда спермии используются для сборки веретена in vitro с экстрактами из яиц, то их центросомы первоначально некомпетентные к нуклеации MT; то при инкубации с яйцевым экстрактом становятся компетентными (Stearns and Kirschner 1994). Пересмотр этих наблюдений с помощью IF показал, что перед активацией некомпетентные к нуклеации центросомы спермиев содержат gamma-tubulin и AKAP450, но не RAN; после инкубации в яйцевом экстракте, RAN рекрутируется на центросомы (K?ryer et al. 2003a). Эти находки подтверждают, что рекрутирование RAN из экстракта в центросомы спермиев является обязательным условием для активации их способности к нуклеации MT. Поэтому было сделано заключение, что центросомная RAN необходима для нуклеации MT.
Др. клеточные структуры могут действовать как MT organizing centers (MTOCs) (rev. Petry and Vale 2015; Meunier and Vernos 2015). Альтернативный путь нуклеации MT управляется с помощью KTs, физиологически оперирует в клетках млекопитающих (O'Connell and Khodjakov 2007). Экспериментально, KT-управляемая нуклеация MTs наиболее различима и функционально определима, когда центросомы разрушены или имеют повреждения. Когда нуклеация центросомных MT нарушена, напр., путем инактивации PLK1, то RANGTP накапливается на KTs, где увеличивается его концентрация, определяемая с помощью RANGTP-специфических конформационных антител. Такое накопление возможно потому, что RANGAP1 в то же время теряется с KTs (Torosantucci et al. 2008). Потеря RANGAP1 с KTs и последующая стабилизация RANGTP затем создают механистическую основу для наблюдаемой роли RANGTP в активации нуклеации MT из KTs (Tulu et al.2006). Одновременно gamma-тубулиновый кольцевой комплекс (gamma-TuRC) также перемещается с центросом на KTs (Mishra et al. 2010) и там взаимодействует с субнабором nucleoporins (NUP107-160), которые целенаправленно воздействуют на KTs во время митоза (Lo?odice et al. 2004; Zuccolo et al. 2007). Интересно, что нуклеация MT с KTsс помощью NUP107-160/gamma-TuRC комплекса нуждается в RANGTP и устраняется, если RCC1-зависимый обмен GTP не происходит (Mishra et al. 2010).
Итак, и центросомы и KTs нуждаются в RANGTP, чтобы активировать нуклеацию MT и организацию веретена. Линии доказательств, суммированные выше, согласуются с идеей, что локальные стратегии гарантируют рекрутирование RANGTP на KTs (обусловлено RCC1-зависимой хромосомной концентрацией и потерей RANGAP1 с KTs) или центросомы (посредством предоставления AKAP450 и исключения RANGAP1), чтобы активировать в них факторы нуклеации MT. Стоит отметить, что RANGTP также участвует в augmin-зависимом пути ветвящейся нуклеации новых MTs из предсуществующих MTs, как в мейотических экстрактах Xenopus (Petry et al. 2013) , так и в клетках человека (Hsia et al. 2014).
В системе ооцита RANGTP регулирует нуклеацию и стабилизацию MT посредством концентрационного диффузионного градиента длинного ранга: эффективность передачи сигналов RANGTP зависит, следовательно, от положения целевых факторов в пределах досягаемости градиента (Caudron et al. 2005). В системах без центросом это ограничивает активацию факторов нуклеации MT вокруг мест с высокой концентрацией RANGTP, т.e., вокруг хромосом. В митотических соматических клетках центросомная фракция RANGTP существует в дополнение к градиенту, исходящему от хромосом, указывая, что система RAN "topologically" реадаптируется, чтобы регулировать нуклеацию MT на этих органеллах. Наблюдение, что нарушения центросом вызывают перемещения членов сети RAN и одновременно факторов нуклеации MT с центросом на KTs подчеркивает роль RAN в кооперации путей формирования митотического веретена в клетках млекопитающих.

RAN network members regulate mitotic centrosome organization and position


Несколько линий доказательств показывают, что дисбаланс сети RAN в клетках млекопитающих приводит к дефектам митотических центросом и полюсов веретена, как первое и наиболее распространенное последствие. Разные молекулярные механизмы лежат в основе этих дефектов, оэ восстановление баланса концентрации RANGTP восстанавливает целостность полюсов веретена во всех случаях.

RANBP1 and mitotic centriole splitting


Повышенные уровни RANBP1 влияют на слипчивость внутри центросом после разрыва NE, когда (a) компартментализация членов сети RAN между цитоплазмой и ядром теряется и (b) центросомы соединены с MTs веретена (Di Fiore et al. 2003). Эксперименты с видеозаписью показали, что высокие уровни RANBP1 индуцируют расщепление центриолей внутри митотических центросом. Не обнаруживаются видимые аномалии, которые помогли бы понять процесс разъединения центриолей перед удвоением центриолей в интерфазе. Ингибиторы MT, такие как nocodazole, не предупреждают локализацию RAN или RANBP1 на митотических центросомах, однако, происходит супрессия RANBP1-зависимой индукции расщепления митотических центриолей. MTs, следовательно, несущественны для локализации RANBP1 на центросомах, однако необходимы для RANBP1-зависимого расщепления митотических центриолей. Каждая центриоля остается связанной с набором MT, генерируя мультиполярные веретена с моно-центриолярным полюсом, который может управлять неправильной сегрегацией хромосом (Di Fiore et al. 2003). Эти наблюдения подтверждают, что RANBP1, когда присутствует в избыточной концентрации на центросомах, дестабилизирует связи между митотическими центриолями, так что их сцепление во время митоза теряется.

Importin beta and mitotic centrosome fragmentation


Importin beta наиболее сильно законсервированным вектором белкового импорта в ядро и один из наиболее охарактеризованных RANGTP эффекторов. Избыточная экспрессия Importin beta в соматических клетках не индуцирует драматических альтераций во время интерфазы, но оказывает характерные эффекты в митозе, давая мультиполярные веретена и неправильное расположение и неправильную сегрегацию хромосом (Nachury et al. 2001; Ciciarello et al. 2004; Kalab et al. 2006). Митотический фенотип, вызываемый c помощью избытка importin beta не в точности совпадает с таковым, вызываемым избытком RANBP1: моно-центриолярные полюса наблюдаются редко; вместо этого, полюса митотического веретена фрагментированы (Ciciarello et al. 2004), напоминая фенотип, наблюдаемый, когда MT-генерированные силы передают избыточное давление на полюса веретена во время сегрегации хромосом (Maiato and Logarinho 2014). Т.о., избыток importin beta и избыток RANBP1 вызывают отличающиеся аномалии полюсов веретена. Эти аномалии, следовательно, не могут возникать за счет общего механизма, такого как RANGTP "sequestration" c помощью эффекторов. Скорее, несбалансированное соотношение importin beta:RANGTP или RANBP1:RANGTP, соотв., проявляющееся в нарушении определенных молекулярных путейв организации митотических хромосом. Как упоминалось выше соотношение RANGTP и importin beta является критическим для предопределения свободного или связанного состояния NLS факторов. NUMA и TPX2 являются хорошо охарактеризованными NLS-содержащими факторами, которые зависят от RANGTP в своей активации (see above), и оба вносят вклад в осуществление структурной поддержки полюсов веретена. Дефекты в виде фрагментации центросом, генерируемые при высоком уровне importin beta, сходны с теми, что генерируются за счет непосредственной инактивации TPX2 (Garrett et al. 2002), подтверждая механизм "секвестрации" TPX2 в импортирующем комплексе. В самом деле, совместная экспрессия TPX2 в высоких концентрациях восстанавливает организацию биполярного веретена, которая нарушается высоким уровнем importin beta (Ciciarello et al. 2004).

RANBP2 and the structural integrity of centrosomes and spindle poles


RANBP2 является др. важным RAN-связывающим белком, фракция которого ассоциирована с центросомами (Hashizume et al. 2013). Предположительно не являющийся каталитическим членом "стержня" RAN сети, представленной нап Fig. 1, RANBP2 взаимодействует с RANGTP и представляет четыре RAN-связывающих домена. RANGTP модулирует взаимодействия RANBP2 с некоторыми из его партнеров; в свою очередь, RANBP2 модулирует доступность свободного RANGTP для др. эффекторов.
RANBP2 является очень крупным nucleoporin (его альтернативное обозначение, NUP358, отражает его молекулярную массу в 358 kDa) и во время большей части клеточного цикла он располагается на цитоплазматической стороне NPC. Помимо RAN-связывающих доменов и консервативных последовательностей нуклеопорина, RANBP2 также обладает SUMO E3 лигазной активностью и содержит с SUMO-взаимодействующий домен (SIM) , который связывает и стабилизирует с SUMO-конъюгирующие белки (Pichler et al. 2002). Конъюгация с SUMO модифицирует поверхность белков, а значит и их профили взаимодействий. Эти модификации часто затрагивают белки, которые регулируют быстрые динамические изменения, напр., в митотических KTs (Wan et al. 2012). Обильно SUMOylated белком является RANGAP1, с которым RANBP2 взаимодействует в ходе клеточного цикла и который стабилизирован в SUMOylated форме; фактически, внутриклеточная локализация RANGAP1 зависит от его конъюгации с SUMO c помощью RANBP2 (see Flotho and Werner 2012, rev.).
Взаимодействия RANBP2 являются предметом пространственного контроля во время митозов. Когда NPCs разбираются в начале митоза, то RANBP2 накапливается вдоль MTs веретена и на полюсах веретена, включающих митотические центросомы, на что указывает ко-локализация специфических маркеров (Joseph et al. 2002; Hashizume et al. 2013); часть рекрутируется на KTs после прикрепления MT (Joseph et al. 2004). Замалчивание RANBP2 приводит к разным дефектам митоза, включая мультиполярные веретена и неправильное расхождение хромосом (Salina et al. 2003; Joseph et al. 2004). Поскольку RANBP2 может взаимодействовать с многими белками, эти дефекты могут быть вызваны отсутствием регуляторных взаимодействий и/или отсутствие конъюгации SUMO с разными факторами мишенями.
RANBP2 и RANGAP1 локализуются совместно и взаимодействуют с importin beta вдоль MTs веретена (Roscioli et al.2012; Hashizume et al. 2013). Importin beta негативно регулирует локализацию RANGAP1 и конъюгацию SUMO c помощью RANBP2 в митотических клетках (Roscioli et al. 2012). Подъем или замалчивание экспрессии или RANBP2 или importin beta, индивидуально, нарушают структуру полюсов веретена и функции веретена (Salina et al.2003; Joseph et al. 2004; Roscioli et al. 2012; Hashizume et al. 2013). Восстановление их молярного баланса устраняет дефекты, вызываемые нарушениями какждого из компонентов в отдельности, подтверждая заключение, что взаимный баланс между RANBP2 и importin beta является критическим для регуляции функций веретена.
Итак, митотические центросомы содержат фракции RANGTP, RANBP2 и importin beta, но не RANGAP1. И RANGTP и importin beta взаимодействуют с RANBP2 на NPCs (Hamada et al. 2011). Логически можно предположить, что RANGTP и importin beta также модулируют взаимодействия RANBP2 на центросомах, хотя экспериментально, трудно засечь такие локальные модуляции в отдельности от того, что происходит на митотическом веретене. Следует отметить, что отсутствие RANGAP1 на центросомах может не только помогать сохранять там RANGTP, но и также делать RANBP2 фракцию, которая достигает центросом, делать доступной для взаимодействий с др. партнерами. Интересно, что в этом отношении увеличивающееся количество центросомных белков обнаруживается в виде конъюгированных SUMO пептидов. Среди них, NUMA сумоилируется (SUMOylated) и это оказывает влияние на его функцию на полюсах митотического веретена (Seo et al. 2014). Сходные фенотипы фрагментации полюсов наблюдаются после или замалчивания RANBP2, или экспрессии SUMO-дефектного NUMA. Можно предположить, что RANBP2 стабилизирует с помощью SUMO модифицированный NUMA на полюсах, где они оба совместно располагаются, хотя это напрямую не подтверждено.

RANBP2 regulates dynein recruitment and centrosome positioning at mitotic entry


RANBP2 взаимодействует с bicaudal D2 (BICD2), гомологом у млекопитающих Drosophila bicaudal D, законсервированного адаптора между моторами, базирующимися на MT, и их грузами. Комплекс RANBP2-BICD2 рекрутирует dynein-dynactin на NPC , чтобы закрепить центросомы вблизи разрыва NE при вступлении в митоз (Splinter et al. 2010).
Если dynein инактивирован, то центросомы не закрепляются вблизи ядра, а отталкиваются от него прочь; кроме того, вступление в митоз задерживается (Splinter et al. 2010; Hu et al. 2013). Это указывает на то, что неправильное позиционирование центросом относительно ядра воспринимается как сигнал, который отслеживается, чтобы позволить или предупредить разрыв NE и продолжение митоза. BIC2 рекрутирует также kinesin-1, моторный белок с противоположной направленностью по отношению к dynein, т.е. к NE; комплекс RANBP2-BICD2, следовательно, контролирует баланс между активностью dynein и kinesin-1 для позиционирования центросомы (Splinter et al. 2010). Зависимое от RANBP2-BICD2 рекрутирование dynein на NE также необходимо для апикальной миграции ядра, которая предшествует митозу в клетках предшественниках радиальной глии (Hu et al. 2013; Baffet et al. 2015).
Как активность RANBP2 управляется, чтобы участововать в позиционировании премитотических центросом? Недавно было показано, что CDK1-зависимое фосфорилирование активирует связывание RANBP2 с BICD2, а значит последующее рекрутирование dynein, в промежуток G2-to-M (Baffet et al. 2015). Интересно, что форсированное целенаправленное воздействие на NE или dynein (Hu et al. 2013) или BICD2 (Baffet et al. 2015) обходит оба блока в ходе от G2 к M, а ингибирование комплекса RANBP2-BICD2, вызывает инактивацию CDK1и тем самым восстанавливает условия для вступления в митоз. Т.о., RANBP2 играет жизненно важную роль в соединении специфичных для G2 фазы модификаций с помощью CDK1 с закреплением центросом вблизи ядра перед вступлением в митоз. Др. комплекс, формируемый с помощью nucleoporin Nup133 и кинетохорного белка CENP-F, рекрутирует dynein на NE в профазе после RANBP2-BICD2 (Bolhy et al. 2011).
Возможное участие фракции центросомных RAN в RANBP2-зависимом позиционировании центросом было исследовано экспериментально. RANGTP, однако, глобально необходим для позиционирования веретена путем регуляции взаимодействий NUMA/LGN с dynein (Kiyomitsu and Cheeseman 2012), а importin beta взаимодействует непосредственно с dynein вдоль MTs веретена (Ciciarello et al. 2004). Взаимодействие этих компонентов на уровне митотического веретена, способность RAN взаимодействовать с RAN-связывающими доменами RANBP2 на NPCs, и присутствие RANGTP на центросомах д. быть сравнимы с ролью RAN в модулировании динамических взаимодействий RANBP2 при позиционировании центросом.

RANGTP and CRM1 recruit factors involved in interphase centrosome organization and licensing


Exportin 1/CRM1 является экспортным вектором для белков, которые содержат последовательность ядерного экспортного сигнала (NES), из ядра в цитоплазму; RANGTP стабилизирует взаимодействия CRM1/NES груза и тем самым стимулирует экспорт из ядра. Тот же самый механизм лежит в основе функций, выполняемых с помощью CRM1, в кооперации с RAN, по структуре и регуляции центросом.
CRM1 в основном ядерный, но также представлен небольшой фракцией, прикрепленной к центросомам (Forgues et al. 2003; Liu et al. 2009). Ассоциированные с центросомами фракции как RAN, так и CRM1 регулируют центросомную локализацию сигнальных белков вызывая арест клеточного цикла вследствие повреждения ДНК, такой как BRCA1 (Brodie and Henderson 2012; Brodie et al. 2012) и BRCA2 (Han et al. 2008). Белки, вносящие вклад в структуру центросом и удвоение центросом, также чувствительны к активности CRM1. Важными мишенями для центросмных CRM1 и RANGTP являются centrin и pericentrin (K?ryer et al. 2003a). Pericentrin является важным каркасным белком, который играет важную роль в накоплении gamma-tubulin и др. компонентов PCM. Pericentrin обладает NLS, направляемым с помощью importin beta и 5 функциональных NES последовательностей обеспечивать высокое сродство для CRM1 (Liu et al. 2009). Способность RANGTP удалять ингибирующие взаимодействия importin beta и тем самым кооперировать с CRM1, регулирует локализацию pericentrin, соотв., в ядре и околоцентросомном регионе (Liu et al. 2010) и тем самым последующее привлечение gamma-TuRC компонентов, которые зависят от pericentrin.
CRM1 и RANGTP также вносят вклад в ограничение удвоения центросом одним клеточным циклом. Сеть факторов (напр., PLK4, факторы репликации из семейств MCM и Orc, separase и ubiquitin ligases) вносят вклад в поддержание "только однажды", правила для удвоения центросом во время клеточного цикла. Правили интимно связано с концепцией "лицензирования," в результате чего центросомы находятся в пермиссивном для удвоения состоянии в течение определенного промежутка в клеточном цикле, затем они удваиваются и теряют свое "licensed" состояние вплоть до тех пор, пока они опять не достигнут соотв. промежутка в ходе следующего клеточного цикла. При репликации ДНК, где концепция лицензирования была сформулирована впервые, лицензирующие факторы ассоциируют с источниками ДНК вскоре после сегрегации хромосом в телофазных ядрах и и маркируют их недуплицированное состояние; когда начинается репликация, то лицензионные факторы смещаются с источников репликации, так что один и тот же источник не может повторно реплицироваться в одном и том же клеточном цикле. Мнение, что CRM1 вносит вклад в лицензирование центросом для удвоения, получено в исследовании клеток, инфицированных вирусом гепатита B (HBV). Онкопротеин HBx, кодируемый HBV, содержит NES мотив, который взаимодействует с CRM1; в инфицированных HBV клетках HBx, как было установлено, секвестрирует CRM1вдали от центросом и одновременно появляются избыточные центросомы, которые вызывают образование множественных веретен (Forgues et al. 2003).
Среди потенциальных мишеней для CRM1 находится nucleophosmin (NPM)/B23, ядерный белок, который содержит NoLS (nucleolar localization signal), NES и NLS мотивы. NPM обнаруживает специфическую для фаз клеточного цикла локализацию, по характеру сопоставимую с ролью в лицензировании удвоения центросом: он ассоциирует с центросомами в митозе и остается связанным с ними во время сегрегации в дочерних клетках. В следующем G1, когда циклин E/CDK2 активирует удвоение центросом, NPM отсоединяется от них вплоть до следующего митотического раунда. Время клеточного цикла, когда NPM ассоциирует с и диссоциирует от центросом напоминает то, что наблюдается для факторов лицензирования репликации ДНК в источнике репликации (Okuda et al. 2000; Okuda 2002).
Потеря функции CRM1 (вызванная или leptomycin B, специфичным ингибитором CRM1, или избыточной экспрессией NES-содержащих белков, таких как HBx, которые насыщяют CRM1) вызывает смещение локализации NPM с центросом и повторное удвоение их в течение того же самого цикла (Shinmura et al. 2005; Wang et al. 2005). Данные подтверждают модель, согласно которой NPM высвобождается из ядрышка при разрыве NE и взаимодействует с центросомным CRM1 посредством своей NES последовательности. Центросомный CRM1 является критическим для привлечения NPM на центросомы, особенно между материнской и дочерней центриолями (Shinmura et al. 2005). Рекрутирование NPM на центросомы маркирует их недуплицированный статус и важно для предупреждения повторной дупликации в том же самом клеточном цикле. В соответствии с этим замалчивание NPM вызывает ту же самую потерю лицензирования дупликации центросом, как и при инактивации CRM1. Повторная экспрессия дикого типа, но не дефективного по NES, NPM восстанавливает лицензионный контроль в клетках с замалчиваемым NPM (Wang et al. 2005). NPM NES сдержит сайт мишень для фосфорилирования с помощью циклина E/CDK2. В нормальном клеточном цикле фосфорилирование NES вызывает диссоциацию NPM с CRM1 (Shinmura et al. 2005) и высвобождение центриолей до удвоения. NPM phosphomimetic мутантные по NES не могут взаимодействовать с CRM1 и не способны локализоваться на центросомах, нарушая тем самым контроль механизма лицензирования (Wang et al. 2005). Исходя из этих данных, CRM1 играет активную роль в механизме лицензирования центросом (Budhu and Wang2005). RANGTP стабилизирует NPM-CRM1 комплексы на центросомах и может поэтому рассматриваться как вышестоящий регулятор лицензирования центросом.

RAN partners are phosphorylated at centrosomes


Открытие, что центросомные киназы фосфорилируют членов сети RAN, подтверждает, что дополнительные уровни контроля могут регулировать взаимодействия RAN на центросомах.
Во-первых, RAN подвергаются фосфорилированию в митотических клетках человека. Митотическое фосфорилирование использует одиночный сайт (ser135), и две центросомные киназы участвуют в модификации этого сайта, а именно, PLK1 (Feng et al. 2006) и p21 протеином (Cd42/Rac)-активированная киназа 4, PAK4 (Bompard et al. 2010). PLK1 преципитируется совместно с RAN в клеточных экстрактах нескольких клеточных линий человека и может фосфорилировать RAN in vitro (Feng et al. 2006), однако, RAN ser135 обладает консенсусной последовательностью низкого сродства к PLK1 и реальный вклад PLK1 в фосфорилированный пул RAN в митотических клетках не был продемонстрирован in vivo.
PAK4 является serine threonine киназой с плейотропными ролями в организации клеток. Она представляет активную фракцию, которая располагается совместно с RAN на центросомах и, как было установлено, фосфорилирует RAN ser135 (Bompard et al. 2010). Интересно, что независимы исследования сходятся на выводе, что нарушение фосфорилирования RAN ser135 вызывает вредные эффекты на организацию митотического веретена. Во-первых, принудительная экспрессия phosphomimetic RAN, мутантных по позиции 135, вызывает возникновение мультиполярных веретен в клетках человека (Feng et al. 2006), подобно тому, что наблюдается в клетках, в которых активности RAN противодействует избыточная экспрессия importin beta (Nachury et al. 2001; Ciciarello et al. 2004; Kalab et al. 2006; Roscioli et al.2012). Во-вторых, PAK4-зависимое фосфорилирование подавляет взаимодействие RAN с RCC1 и RANGAP1 , а, с другой стороны, и оборот нуклеотида на RAN; в соответствии с этим phosphomimetic (S135D) мутантная RAN нагружается GDP и ингибирует нуклеацию MT в экстрактах яиц Xenopus (Bompard et al. 2010). Т.о., фосфорилирование RAN д. быть обратимым, чтобы модулировать её взаимодействие с факторами, которые вносят вклад в организацию полюсов веретена и нуклеацию MT.
Кроме того, PLK1 фосфорилирует RANBP1 по одиночному сайту, участвующем во взаимодействии с RAN, а замалчивание PLK1 снижает силу взаимодействия между RAN и RANBP1 (Hwang et al. 2011). Совместное расположение PLK1 с RAN и RANBP1 на центросомах особенно очевидно в ранних этапах митоза, на стадии, на которой циклин B1 также кратковременно перемещается на центросомы в качестве ступени в направлении полного созревания центросомы (Jackman et al. 2003). Ранее было установлено, что подавление RANBP1 нарушает динамику MT и соответственно предупреждает ассоциацию cyclin B1 с MTs веретена (Tedeschi et al. 2007). Интересно, что повторная экспрессия дикого типа RANBP1 восстанавливает циклин B1 на MTs в дефектных по RANBP1 клетках, тогда как phosphodefective RANBP1 неспособен отвечать подобным образом (Hwang et al. 2011). Это указывает на то, что RANBP1 д. быть фосфорилирован, чтобы регулировать расположение cyclin B1 на MTs, и в своей фосфорилированной форме он может стабильно взаимодействовать RAN. Базируясь на этих данных, можно предположить, что phospho-RANBP1 и RAN модулируют функции cyclin B1, включая ассоциацию с или стабилизацию нуклеированных MTs на центросомах. Как упоминалось выше, инактивация PLK1 нарушает способность центросом к нуклеации MT и это вызывает накопление RANGTP и активацию нуклеации a MT на KTs (Torosantucci et al. 2008). Отсутствие фосфорилирования RANBP1 в отсутствие PLK1 может "сигнализировать" об ослабленной способности центросом и запускать события ре-локализации, лежащие в основе KT-управляемой нуклеации.
Следовательно, локальное фосфорилирование центросомных RAN и RANBP1 модулирует их взаимодействия. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения, как в точности фосфорилирование центросомными киназами влияет на передачу сигналов RAN и регуляцию нижестоящих процессов.

Centrosomal RAN network members are targets of viral oncoproteins as part of the virus pro-replicative strategy


Интересно, что в свете многочисленных функций, регулируемых с помощью RAN на центросомах, некоторые вирусные белки взаимодействуют с RAN и нарушают контроль дупликации центросом. Как аденовирусный E1A антиген, так и онкопротеин вируса папиломы человека E7 взаимодействуют с RAN и это взаимодействие нарушает RCC1-зависимое образование RANGTP in vitro (De Luca et al. 2003). В интактных клетках наиболее доказательным эффектом, вызываемым взаимодействием любого белка с RAN является индукция избыточного удвоения центросом в одном и том же цикле (rev. Lavia et al. 2003). Возможно, что E1A и E7, путем уменьшения образования RANGTP, существенно нарушают образование тримерного комплекса RANGTP/CRM1/NPM на центросомах, вызывая сходное нарушение механизма лицензионного контроля, как это вызывается дисфункцией CRM1 (see above). Эта идея подкрепляется находками, что E1A д. быть специализирована для взаимодействия с RAN, чтобы вызывать численные аномалии центросом, тогда как делеционный мутантный домен с отсутствием связывания RAN, неспособен продуцировать сходные эффекты (De Luca et al. 2003).
T-клеточной лейкемии человека вирус type-1 (HTLV-1) является онкогенным ретровирусом, который кодирует Tax онкопротеин, регулятор транскрипции. Tax был также найден, как нарушающий контроль числа центросом посредством RAN и RANBP1. Tax локализуется на центросомах, соединяется там с RAN и RANBP1 и вызывает появление сверхчисленных центросом (Peloponese et al. 2005). Нарушение регуляции цикла удвоения центросом, как полагают, лежит в основе геномной нестабильности, с добавлениями и потерями хромосом, типичной HTLV-1-индуцированной T-клеточной лейкемией. В самом деле, лейкемические T лимфоциты от пациентов, обнаруживают умножение центросом. Нарушение регуляции удвоения центросом, наблюдаемое после индукции Tax, супрессируется с помощью CDK ингибиторов, участвующих в нарушении регуляции активности CDK при Tax-вызываемой амплификации центросом в HTLV-1-инфицированных клетках (Nitta et al. 2006).
Итак, эволюционно удаленные онкогенные вирусы, такие как аденовирусы, папиломовирусы, HBV и ретровирусы, используют разнообразные стратегии для достижения общего результата по инактивации RAN контроля центросмных функций во время их собственной репродукции.

Conclusions


Diverse lines of evidence summarized in this review indicate that mammalian cells need RAN-mediated control of key factors in multiple steps of the centrosome life cycle (Fig. 2). RAN is a stable centrosomal component through its interaction with AKAP450, which takes place continuously during the cell cycle. At centrosomes, it establishes dynamic interactions with its effectors to orchestrate the spatial and temporal program of localization and activation of crucial factors. It is interesting to note that the direct regulators of nucleotide turnover on RAN, RCC1 and RANGAP1, are not found at centrosomes, suggesting the likely scenario that RAN reaches the centrosomes via NPCs in the active GTP-bound form and is preserved as RANGTP via specific local interactions. Recent studies are beginning to identify modifications of RAN itself, and of its partners, by centrosomal kinases; these modifications may provide an additional layer of control of the dynamics with which RAN associates with, and dissociates from, effectors to regulate centrosomal targets.



Fig. 2 A summary of centrosomal functions controlled by the RAN network during the cell cycle. The diagram depicts RAN interactions that regulate centrosomal functions (R RAN, C CRM1, IB Importin beta). Red lines symbolize negative control and green arrows positive control of key factors; only some paradigmatic factors are depicted (PC pericentrin, NPM nucleophosmin, BIC2 bicaudal 2). Viral oncoproteins targeting specific RAN network members or effectors are indicated (grey flashes)

Our mechanistic understanding of RAN control of centrosome functions remains incomplete in places, but a common emerging theme is the high sensitivity of centrosome structure and activity to alterations in the molar ratio between RAN network members. Nucleo-cytoplasmic transport processes, per se, are generally tolerant of RAN network imbalance, consistent with predictions from modeling studies that nuclear export and import are "robust" processes that can buffer relatively ample concentration variations (Smith et al.2002). These variations, instead, readily affect the structural integrity of centrosomes and spindle poles, as well as their nucleation capacity, as illustrated in the studies summarized above. In addition, time-lapse recording assays show that most centrosome defects induced under conditions of RAN network imbalance, such as altered MT function and multipolar spindles, remain largely uncorrected during mitosis and cause chromosome mis-segregation to newly generated daughter cells. This provides ground to suggest that centrosomal dysfunction due to RAN network imbalance contributes to the genetic instability observed in cancer cells in which RAN network members or effectors are aberrantly expressed (examples are discussed in the reviews by Rensen et al. 2008; Doherty et al. 2011; van der Watt et al. 2013; Takeda and Yaseen2014). Remarkably, RAN's ability to orchestrate a specific and regulated program of protein delivery and activation at centrosomes underlies the assembly of all basal body-derived organelles, i.e., centrosomes, cilia, and flagella. Although the conservation and diversification of specific processes cannot be discussed in depth here, available data suggest that these organelles rely for their assembly on similar RAN-dependent mechanisms to those acting at centrosomes (see, for example, Fan et al. 2011; Fan and Margolis 2011; Qin2012). Technical advances now enable the isolation of whole organelles, their proteomic characterization, and their dynamic analysis by high-resolution imaging methods. The integration of these approaches in a network-based, rather than single protein-centered, perspective contributes to delineate a scenario in which RAN, its partners, and effectors act in a topologically specific and temporally regulated manner to ensure the localization and function of proteins necessary to build up, regulate, and position centrosomes and cilia and coordinate their function with the cell cycle.