Посещений:
РАЗВИТИЕ МОЗЖЕЧКА



Передача сигналов BMP/Smad

BMP/Smad signaling and embryonic cerebellum development: Stem cell specification and heterogeneity of anterior rhombic lip
Ka Kui Tong, Tsz Ching Ma, Kin Ming Kwan
Development, Growth & Differentiation Volume 57, Issue 2 February 2015 Pages 121–134

The canonical bone morphogenetic proteins (BMPs) signaling have been shown to mediate many embryonic developmental processes. Due to its complexity, there are still many unknowns about this signal pathway including the Smad usage and requirement. Cerebellum, one of the most studied neural organs in development biology, requires canonical BMP signaling for stem cell specification. Here we review the role of canonical BMP signaling during the embryonic cerebellum development. Also, we raise several unsolved issues concerning the BMP signaling including the co-Smad independency of this signaling pathway. Besides, we also propose two models for explaining the cerebellar anterior rhombic lip (ARL) specification mechanisms. In addition, we review the heterogeneity of the ARL stem cells, which may provide new insight into understanding the neural stem cell specification process of the embryonic cerebellum.
Передача сигналов Bone morphogenetic protein (BMP) известна давно (Urist 1965; Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). Подразделение передачи сигналов на каноническую и не каноническую части зависит от того, участвуют ли Smads во время процесса сигнальной трансдукции (Wrana 2000). Функция канонической передачи сигналов BMP была также выявлена во многих системах, включая разные органогенезы, возникновение рака и болезней (Blanco Calvo et al. 2009).
Мозжечок является важным органом ЦНС, который участвует в балансировке тела, моторной координации и познавательной функции (Koziol et al. 2012; O'Halloran et al. 2012; Martinez et al. 2013). Благодаря своему простому нейрональному circuit, мозжечок является известным органом для изучения различных онтогенетических процессов, включая поддержание стволовых клеток и др. нейральные события (Altman & Bayer 1997; Basson & Wingate 2013). Кроме того, благодаря своей простой клеточной архитектуре, его эмбриональное развитие также довольно хорошо изучено. Идентифицированы многие гены и функционально охзарактеризованы во время эмбрионального развития (Goldowitz & Hamre 1998; Butts et al. 2014).

Embryonic cerebellum development


У высших позвоночных, таких как млекопитающие, мозжечок подразделен на два самостоятельных компартмента, кора мозжечка и и глубокие ядра мозжечка (Altman & Bayer 1997; Sultan & Glickstein 2007; Hashimoto & Hibi 2012). Оба эти компонента происходят из зачатка мозжечка, который возникает из дорсальной части региона между средним и задним мозгом (Altman & Bayer 1997; Yacubova & Komuro 2003). В целом развитие мозжечка может быть подраздлено на 4 ключевые стадии у мышей (Fig. 1).



Figure 1. A brief summary of mouse embryonic cerebellum development. (1) In the first wave of neurogenesis, the ventricular zone (VZ) generates the prospective deep cerebellar nuclei, whereas the anterior rhombic lip (ARL) generates the cells of nuclear transitory zone. (2) Later, the VZ and the ARL starts to generate Purkinje cells and granule cells, respectively. nuclear transitory zone (NTZ) will be formed. (3) By the time that the VZ starts generating interneurons (IN), VZ-derived Purkinje cells undergo radial migration towards pial surface, while the granule cells in external granular layer (EGL) proliferate to expand its cell population. The prospective deep cerebellar nuclei migrate downward to its position. Moreover, invagination of medullary velum brings the cerebellum backward and downward. (4) At around E16.5, the VZ switches to generate glial cells, whereas the ARL starts to generate unipolar brush cells. Purkinje cell plate is formed between the EGL and prospective white matter. (5) Just before birth, cerebellar foliation occurs to divide cells within into different compartments (future lobules) and cell migration keeps on to fine tune the position of cells within cerebellum. The interneurons are situated in the Purkinje cell plate. Deep cerebellar nuclei derived from both ARL and VZ are positioned. In the meantime, medullary velum continues to invaginate. (6) Final morphology of adult mouse cerebellum. cp, choroid plexus; DCN, deep cerebellar nuclei; Glial, glial cells; IGL, internal granular layer; ML, molecular layer; PC, Purkinje cells; PCL, Purkinje cell layer; PCP, Purkinje cell plate; UPB, unipolar brush cells; velum, medullary velum.

Formation of the cerebellar primordium


Становление зачатка мозжечка нуждается в тонкой регуляции со стороны организатора перешейка (isthmus organize), расположенного на границе между средним и задним мозгом (ten Donkelaar et al. 2003; Narboux-N?me et al. 2005). У мышей на ст. E7.5, Otx2 экспрессируется в прозэнцефалоне и мезэнцефалоне (Acampora et al. 2001; Boyl et al. 2001; Li & Joyner 2001), тогда как whereas Gbx2 экспрессируется в метэнцефалоне и др. ромбомерах (Li & Joyner 2001).Экспрессия этих генов предопределяет границу между средним и задним мозгом и делает возможным образование истмического организатора на ст. E9.0. Территория зачатка мозжечка демаркируется на дорсальных частях первого ромбомера (Zervas et al. 2005) с динамической экспрессией Wnt1 (McMahon et al. 1992; Mastick et al. 1996), En1, En2 (Millen et al. 1994, 1995; Kuemerle et al. 1997) и Fgf8 (Blair et al. 2002).

Two primary germinal zones


После возникновения зачатка мозжечка, формируются две самостоятельные первичные герминальные зоны, anterior rhombic lip (ARL) и ventricular zone (VZ) (Goldowitz & Hamre 1998). Ряд исследований по отслеживанию клонов показал, что ARL вносит вклад в генерацию глютаматергических нейронов (Wingate 2001), в то время как VZ генерирует GABAergic нейроны (Leto et al. 2012). Идентифицированы специфические гены, регулирующие развитие ARL и VZ (Yamada et al. 2014). Atoh1 (Ben-Arie et al. 1997; Machold & Fishell 2005; Wang et al. 2005b) и Pax6 (Swanson et al. 2005) это два фундаментальных транскрипционных фактора, ответственные за процессы спецификации ARL. С др. стороны, Ptf1a is является одним из ведущих генов, который регулирует процесс спецификации VZ (Sellick et al. 2004) , а нехватка Ptf1a приводит к изменению VZ в ARL (Hoshino et al. 2005).

Neurogenesis


Нейрогенез ARL: Разные типы нейрональных клеток генерируются из ARL с помощью временной регуляции. С E9.5 по E10.5 ARL генерирует предшественников pontomesencephalic tegmentum, lateral lemniscus и парабранхиальных ядер, которые не принадлежат мозжечку (Wang et al. 2005b). Приблизительно с E10.5 по E11.5, клетки, генерируемые из ARL, образуют nuclear transitory zone (NTZ) (Machold & Fishell 2005; Wang et al. 2005b), которая экспрессирует Tbr1 и Tbr2. Позднее эти клетки становятся частью deep cerebellar nuclei (DCN) (Fink et al. 2006). После E12.5, ARL в основном генерирует гранулярные клетки, покрывающие поверхность мозжечка путем образования external granular layer (EGL) (Machold & Fishell 2005). Гранулярные клетки, экспрессирующие Pax6, Atoh1 и Zic1-а EGL подвергаются пролиферации вплоть до ранней постнатальной стадии (Bennett et al. 2004; Jensen et al. 2004; Swanson & Goldowitz 2011), в качестве критической ступени в направлении созревания мозжечка. Со ст. E16.5 генерируются однополярные щетинистые (brush) клетки из ARL (Englund et al. 2006).
Нейрогенез VZ: Подобно ARL, временные волны нейрогенеза в VZ начинаются вскоре после образования зачатка мозжечка. Перед ст. E10.5 VZ сначала генерирует проспективные DCN (Pierce 1975; Wang & Zoghbi 2001), это сопровождается продукцией Lhx1/5-позитивных клеток Пуркинье (Zhao et al. 2007). После выхода из VZ, зрелые клетки Пуркинье экспрессируют Calbindin. После E13.5 VZ начинает продуцировать предшественники Pax2-позитивных GABAergic промежуточных нейронов (Maricich & Herrup 1999; Leto et al. 2006, 2009). После E16.5 VZ подвергается переключению с нейрогенеза на глиогенез (Kita et al. 2013).

Major morphological changes


Несколько морфогенетических перемещений необходимо для превращения тонкого зачатка мозжечка в трехмерную слоистую структуру. В то время как размер и толщина мозжечка увеличиваются, медуллярный velum инвагинирует в 4-й желудочек (Altman & Bayer 1997). Этто движение перемещает обратно и вниз зачаток мозжечка. Кроме того, разные компартменты внутри развивающегося мозжечка мигрируют и закладывают форму мозжечка. Производные ARL мигрируют кпереди ниже поверхности мягкой мозговой оболочки (Gilthorpe et al. 2002). NTZ позднее мигрирует внутрь и вниз приблизительно на ст. E14.5. Эта клеточная популяция позднее образует три пары DCN вместе с происходящими из VZ GABAergic DCN (Fink et al. 2006). Тем временем клетки Пуркинье, генерируемые из VZ начинают миграцию, ведомые глией в направлении pail поверхности мозжечка, чтобы сформировать пластинку клеток Пуркинье под EGL (Miyata et al. 2010). Примерно в то же самое время предшественники гранулярных клеток в EGL продолжают пролиферацию, которая приводит к увеличению толщины EGL и размера мозжечка. Приблизительно на ст. E17.5, происходят инвагинации определенных специфических регионов pial поверхности мозжечка, образуя рисунок трещин и слоистости (foliation) (Altman & Bayer 1997).

Canonical BMP signaling


Передача сигналов Bone morphogenetic protein (BMP) изучалась более 40 лет с момента открытия его лигандов (Urist 1965), и была описана во многих работах (Sieber et al. 2009). Подобно многим др. сигнальным путям передача сигналов BMP нуждается в лигандах, мембранных рецепторах и во внутриклеточных медиаторах, которые все вместе позволяют клетке получать сигналы извне и трансдуцировать их внутрь. Каноническая передача сигналов BMP также обозначается как передача сигналов BMP/Smad, обозначая ось BMP к Smad (Fig. 2).



Figure 2. Current understanding of canonical bone morphogenetic protein (BMP) signaling. In brief, BMP ligands interact with the BMP receptor complex. Upon this interaction, BmpRII phosphorylates BmpRI, leading to the phosphorylation of the C-terminus of R-Smad (Smad1, Smad5 or Smad8). This activation allows the formation of R-Smad-co-Smad heterotrimer which accumulates in the nucleus. Regulators of this pathway are shown, including extracellular BMP antagonists, coreceptor and I-Smad. Besides, the involvement of Insulin-like growth factor, Fibroblast growth factor and Wnt signals in regulating the phosphorylation of R-Smad linker region is illustrated. This type of phosphorylation leads to ubiquitination via Smurf1, and thus proteasome-dependent degradation. Meanwhile, PP2A reverses the phosphorylation of R-Smad linker region to protect R-Smad from degradation.

The ligands


Концепция bone morphogenetic proteins (BMPs) впервые описана в 1965 (Urist 1965; Reddi 1997). BMP лиганды были классифицированы как члены сверхсемейства transforming growth factor-beta (TGFβ) (Sieber et al. 2009; Ehrlich et al. 2011). Они секретируются как внеклеточные белки, которые обладают как аутокринной, так и паракринной активностью. Благодаря диффузии на большие расстояния (Plouhinec et al. 2011), могут устанавливаться концентрационные градиенты, которые вызывают разные реакции реципиентных клеток (Sieber et al. 2009). Поэтому они были также описаны как морфогены (Plouhinec et al. 2011). Большинство биоактивных BMP лигандов димеризуется (Liao et al. 2003; Little & Mullins 2009), в гомо- или гетеродимерные формы посредством ковалентных дисульфидных мостиков (Hogan 1996; Vitt et al. 2001). В большинстве случаев гетеродимеры обнаруживают более высокий потенциал, чем соотв. гомодимеры (Little & Mullins 2009).

The receptors


Рецепторами для Bone morphogenetic protein служат гетеромеры, состоящие из type I и type II трансмембранных серин/треонин киназных рецепторов (Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). Чтобы стать функциональными рецепторными комплексами рецепторы типа I и два типа II д. сформировать гетеротетрамер (Sieber et al. 2009). У млекопитающих обнаружены три типа I рецептора, включая Activin receptor type Ia (ActRIa или Alk2) (Schmitt et al. 1995), BMP receptor type 1a (BRIa или Alk3) (Gupta et al. 2000) и BMP receptor type Ib (BRIb или Alk6) (Baur et al. 2000). Также три типа II рецептора обнаружены, которые являются BMP рецепторами типа II (BRII) (Nohe et al. 2002), Activin receptors type IIA (ActRIIA) (Dalkin et al. 1996) и Activin receptor type IIB (ActRIIB) (Barbara et al. 1999). Разные комбинации типа I и типа II рецепторов могут быть сформированы в разных тканях и системах органов. Чтобы активировать каноническую передачу сигналов BMP, необходимы предварительно сформированные type I/type II рецепторные комплексы. После связывания лигандов киназный домен типа II рецепторов фосфорилирует GS-box типа I рецептора. Фосфорилирование активирует типа I рецепторы, чтобы далее фосфорилировать R-Smad белки (Sieber et al. 2009).

The intracellular mediators: Smad


Чтобы трансдуцировать сигналы BMP от рецепторов в плазматической мембране в ядро для активации нижестоящих генов, необходимы внутриклеточные медиаторы: Smad белки (Wrana 2000; Sieber et al. 2009). В канонической передаче сигналов BMP описаны три класса белков Smad в системах млекопитающих, которые являются receptor-regulated Smads (R-Smads), common-partner Smad (co-Smad) и ингибирующими Smads (I-Smads) (Wrana 2000; Sieber et al. 2009). Сегодня R-Smads включают Smad1, Smad5 и Smad8, тогда как имеется только один тип co-Smad, Smad4. Кроме того, имеются два I-Smads, Smad6 и Smad7. Важно, что эти ортологи Smad генов млекопитающих были обнаружены у Caenorhabditis elegans (sma) (Savage et al. 1996; Wang et al. 2005a) и Drosophila (mad) (Wisotzkey et al. 1998; Raftery & Sutherland 1999).
Smad белки млекопитающих содержат два Mad-гомологичных домена: MH1 и MH2 домены (Wrana 2000; Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). В R-Smad, N-терминальный MH1 домен ответственен за взаимодействие с ДНК и рекрутирование др. белков (Pouponnot et al. 1998; Shi et al. 1998), тогда как C-терминальный MH2 домен ответственен за тримеризацию Smad (Chacko et al. 2001), транслокацию в ядро и фосфорилирование с помощью мембранных рецепторов. Между двумя Mad-гомологичными доменами находится линкерная область, содержащая многие сайты фосфорилирования, делающие возможным обмен сигналами (Fuentealba et al. 2007). Когда C-терминальный MH2 домен R-Smad фосфорилируется с помощью типа I рецепторов, то он активируется так, чтобы стало возможным формирование гетеротримера, состоящего из двух R-Smad и одного co-Smad белков (Kawabata et al. 1998). Smad гетеротример может затем транслоцироваться и накапливаться в ядре для взаимодействия с др. транскрипционными факторами и для обеспечения ими соответ. клеточных реакций (Nicol?s et al. 2004; Collart et al. 2005). Итак, для канонической передачи сигналов BMP важны гетеротримерные Smad (Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). Следовательно, инактивация R-Smad или co-Smad предполагает устранение всей канонической передачи сигналов BMP. Однако, недавние генетические исследования предоставляют доказательства роли co-Smad в канонической передаче сигналов BMP (Zhou et al. 2003; Chu et al. 2004; Zhang et al. 2005; Rajagopal et al. 2009; Retting et al. 2009; Tong & Kwan 2013; Yang et al. 2014).

The regulation of canonical BMP signaling


Путь канонической передачи сигналов BMP регулируется на разных уровнях. Один из них посредством внеклеточных BMP антагонистов, которые являются секретируемыми пептидами, которые соединяются с BMP лигандами и блокируют взаимодействие между лигандами и рецепторами (Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). Эти антагонисты включают Chordin (Holley et al. 1995; Sasai et al. 1995), Noggin (Re'em-Kalma et al. 1995), Tsg (Oelgeschl?ger et al. 2000), Cerberus (Piccolo et al. 1999), NBL1 (Pearce et al. 1999). Кроме того, ко-рецепторы могут влиять на BMP мембранные рецепторы. В зависимости от природы ко-рецепторов, некоторые способствуют взаимодействию между лигандами и рецепторами, тогда как некоторые конкурируют с рецепторами за связывание с лигандами (Xia et al. 2005; Kuo et al. 2010; Ma et al. 2011).
R-Smad является главным внутриклеточным игроком канонической передачи сигналов BMP и поэтому многие регуляторы нацелены на него. I-Smads (Smad6 и Smad7) являются главными ингибирующими молекулами. Имеется функциональный MH2 домен, но не MH1 домен, I-Smad может т.о. ингибировать активность R-Smad путем уменьшения R-Smad C-терминального фосфорилирования, гетеротримеризации Smad и взаимодействий с транскрипционными факторами (Hayashi et al. 1997; Imamura et al. 1997; Whitman 1997; Hata et al. 1998). Более того, стабильность самих молекул R-Smad также является критической для передачи сигналов BMP. Линкерный регион в R-Smad содержит множественные места фосфорилирования, которые могут быть фосфорилированы с помощью MAPK и GSK3 (Fuentealba et al. 2007). Эти множественные фосфорилирования запускают инициируемое с помощью Smurf1 убиквитинирование R-Smad и приводят к зависимой от протеосом деградации, ингибируя тем самым каноническую BMP реакцию (Murakami et al. 2003). Напротив, передача сигналов Wnt может подавлять зависимое от GSK3 фосфорилирование R-Smad и тем самым защищать R-Smad от деградации и продлевают передачу сигналов (Fuentealba et al. 2007). Кроме того, serine/threonine protein phosphatase, PP2A, также может дефосфорилировать линкерный регион R-Smad, чтобы стабилизировать R-Smad (Bengtsson et al. 2009). Более того, описано сумоилирование Smad4 , которое может супрессировать каноническую передачу сигналов BMP (Long et al. 2004).

BMP/Smad in cerebellum development


Contribution of BMP signaling components during cerebellum development


Перед образованием зачатка мозжечка BMPs экспрессируются в верхней пластинке нервной трубки мезэнцефалона и метэнцефалона. Обнаруживается высокий уровень экспрессии Gdf7, BMP6 и BMP7, но не BMP2, BMP9, Gdf5 и Gdf6 (Lee et al. 1998; Alder et al. 1999; Chizhikov et al. 2006; Su et al. 2006; Salero & Hatten 2007). Функция BMPs в развитии мозжечка подтверждается анализом культур и генетическим анализом. Путем воздействия на ex vivo культуру E8 клеток вентральной части нервной пластинки BMP7, клетки могут в конечном итоге дифференцироваться в зрелые гранулярные клетки мозжечка (Alder et al. 1999). Более того, мышиные ES клетки могут индуцироваться в Math1 позитивные предшественники нейронов мозжечка при добавлении BMP4 и Wnt3a лигандов (Su et al. 2006). Также последовательная обработка разными лигандами ES клеток может генерировать дифференцированные гранулярные нейроны мозжечка, в которых BMP6/7 и Gdf7 являются важными для индукции маркеров предшественников ранних гранулярных клеток (Salero & Hatten 2007). С др. стороны, NBL1, a BMP антагонист, секретируемый Math1-позитивным ARL, может супрессировать BMP7-обеспечиваемую спецификацию стволовых клеток ARL (Krizhanovsky & Ben-Arie 2006). Всё это подтверждает участие BMP лигандов в эмбриональном развитии мозжечка.
Помимо связывания лигандов были изучены и др. функции BMP рецепторов. У эмбрионов кур избыточная экспрессия постоянно активного Bmpr1a в мозжечке вызывала морфологические аномалии и образование эктопических фокусов гранулярных клеток (Ming et al. 2002). У мышей BMP type I рецепторы кодируются двумя генами, Bmpr1a и Bmpr1b (Qin et al. 2006). Генетический анализ показал, что эти два гена выполняют перекрывающиеся роли в эмбриональном развитии мозжечка, в частности в развитии ARL и EGL. Известно, что передача сигналов BMP/Smad нуждается в образовании гетеротетрамерного рецепторного комплекса, состоящего из type I и type II рецепторов (Sieber et al. 2009). BMP рецепторы типа II, как полагают, участвуют в развитии мозжечка. Однако, неясно, какой тип type II рецептор непосредственно вовлечен.
Чтобы передавать трансмембранные сигналы в ядро, необходимы внутриклеточные медиаторы. Белки Smad выступают в роли внутриклеточных медиаторов в канонической передаче сигналов BMP (Wrana 2000; Sieber et al. 2009). Активная экспрессия R-Smad может быть обнаружена в ARL и VZ во время развития эмбрионального мозжечка (Fernandes et al. 2012; Tong & Kwan 2013). Генетические исследования показали, что Smad1 и Smad5 действуют перекрывающимся способом во время развития эмбрионального мозжечка. Потеря и Smad1 и Smad5 приводит к дефектам спецификации ARL, приводя к потере NTZ и к уменьшению EGL (Tong & Kwan 2013). Повсеместная экспрессия Smad4 обнаруживается и в эмбриональном мозжечке (Zhou et al. 2003; Fernandes et al. 2012; Tong & Kwan 2013). Ранее генетический анализ по инактивации Smad4 в мозжечке выявил дефекты ARL, потерю NTZ и уменьшение EGL (Fernandes et al. 2012). Однако, наше недавнее генетическое исследование Smad4 с использованием тех же самых мышей линии Cre (En1-Cre) дало противоречивый результат. Не выявлено крупных обнаружимых дефектов в ARL, NTZ или EGL в мозжечке инактивированных по Smad4 эмбрионов (Tong & Kwan 2013). Более того, др. исследование, с использованием Nestin-Cre для инактивации Smad4 выявило нормальные ARL клоны (Zhou et al. 2003). Итак, Smad1 и Smad5 действуют как внутриклеточные медиаторы в развитии мозжечка, обеспечиваемом BMP. Но действительно ли Smad4 действует также как co-Smad для поддержания канонической передачи сигналов BMP в мозжечке не до конца ясно.
I-Smads также являются одними из ключевых регуляторов канонической передачи сигналов BMP и модулируют активность R-Smad. Во время развития мозжечка Smad7 экспрессируется в EGL (Lai et al. 2011), указывая на то, что активная передача сигналов BMP не нужна для развития EGL. С др. стороны, ранняя избыточная экспрессия Smad7 на границе между средним и задним мозгом посредством Wnt1-Cre приводит к потере хороидного сплетения и к морфологическим аномалиям мозжечка (Tang et al. 2010). Т.о., роль I-Smad в эмбриональном мозжечке всё ещё неясна. Тем не менее ясно, что каноническая передача сигналов BMP важна для эмбрионального развития ARL. Передача сигналов BMP посредством R-Smad управляет спецификацией пула стволовых клеток ARL и последующей генерацией NTZ и EGL, которые позднее становятся глубокими ядрами мозжечка и гранулярными нейронам мозжечка, соотв.
С др. стороны, роль передачи сигналов BMP в VZ, другой изначальной зародышевой зоне эмбрионального мозжечка, не была изучена. Известно, что фосфорилированные R-Smad экспрессируются в VZ (Fernandes et al. 2012; Tong & Kwan 2013) , а у Nestin-Cre производных Smad4 нокаутных мышей обнаруживается уменьшение количества клеток Пуркинье (Zhou et al. 2003). Более того, кондиционное устранение Smad4 посредством En1-Cre в мозжечке приводит к достоверному уменьшению Ki67+ пролиферирующих клеток в вентрикулярной зоне на ст. E11.5 и E13.5 (Fernandes et al. 2012), это, в свою очередь, препятствует продукции клеток Пуркинье (Zhou et al. 2003) и промежуточных нейронов. Ясно, что роли передачи сигналов BMP в регуляции ARL и VZ различны. Это может быть обусловлено различиями в BMP рецепторах; , однако, мало известно о дифференциальной экспрессии BMP рецепторов в развивающемся мозжечке. Необходим дальнейший анализ роли BMP/Smad в развитии VZ мозжечка, чтобы внести ясность, как передача сигналов BMP/Smad регулирует спецификацию двух пулов нейральных стволовых клеток в ARL и VZ и как они взаимодействуют др. с др.

Table 1. Summarizing publications on canonical BMP signaling components involved in embryonic cerebellum development 

Gene/Protein        Type        Year        Authors        Experiment        Findings

GDF7        Ligand        1998        Lee et al.        Mouse        Gdf7 was
expressed in the roof plate at E9.5
BMP7        Ligand        1999        Alder et al.        Primary cell culture
BMP7-treated ventral neural plate cells differentiated into mature granule cells in vivo
GDF7        Ligand        2006        Chizhikov et al.        Mouse        Conditional
 knockout of Gdf7 via ActB-Cre led to failure in the formation of roof plate and
 appearance of apoptotic cells at the most dorsal edges of rhombomere 1
BMP4        Ligand        2006        Su et al.        ES cells culture        BMP4 and Wnt3a
induced differentiation of ES cells to expressing cerebellar neuron precursors
BMP6/BMP7/Gdf7        Ligand        2007        Salero and Hatten        ES cells
culture        Treatment with BMP6/7 and GDF7 induced differentiation of
mouse ES cells to granule cells, which expressed MATH1, MEIS1, PAX6,
and PAX2, and CALB1-expressing Purkinje cells
Bmpr1a/Bmpr1b        Type I receptor        2002        Ming at al.        Chick
 (i) Expression of Bmpr1a and Bmpr1b in early embryonic cerebellum.
 (ii) Overexpression of constitutive active Bmpr1a in chick embryonic cerebellum
 resulted in morphologic anomalies and ectopic foci of granular cells
Bmpr1a/Bmpr1b        Type I receptor        2006        Qin et al.        Knockout mice
 Conditional knockout of Bmp1a and Bmp1b via Brn4-Cre in mouse cerebellum
(i) reduced mitotic ability of ARL-derivatives;
(ii) hampered granule cell generation and differentiation;
and (iii) disrupted Purkinje cell and granule cell migrations
Smad4        co-Smad        2003        Zhou et al.        Knockout mice
Conditional knockout of Smad4 via Nestin-Cre suppressed Purkinje neurogenesis
Smad4        co-Smad        2012        Fernandes et al.        Knockout mice
Conditional knockout of Smad4 via En1-Cre (i) suppressed neurogenesis in cerebellum;
(ii) reduced mitotic activity at ARL; and (iii) disrupted Purkinje cell migration.
hGFAP-Cre did not affect granule cell specification but migration
Smad4        co-Smad        2013        Tong and Kwan        Knockout mice
 Conditional knockout of Smad4 via En1-Cre does not affect cerebellum development
Smad1/Smad5        R-Smad        2013        Tong and Kwan        Knockout mice
      Conditional knockout of Smad1/5 via En1-Cre (i) reduced mitotic ability
      of neural stem cells in ARL; (ii) suppressed granule cell specification; and
      (iii) disrupted Purkinje cell migration
1. ARL, anterior rhombic lip; BMP, bone morphogenetic protein; ES cell, embryonic stem cell.

Is co-Smad required for canonical BMP signaling?


Наше исследование эмбрионального развития мозжечка предположило наличие атипической канонической передачи сигналов BMP, которая не нуждается в co-Smad (Tong & Kwan 2013). Современная общая модель канонической передачи сигналов BMP утверждает, что co-Smad необходим для образования гетеротримера R-Smad-co-Smad (Miyazono et al. 2005; Sieber et al. 2009). Следовательно, устранение co-Smad д давать, по крайней мере, тот же самый фенотип, что и при устранении R-Smad. По крайней мере, два исследования по устранению co-Smad в эмбриональном мозжечке выявили очень легкие фенотипические отклонения (Zhou et al. 2003; Tong & Kwan 2013), тогда как одно исследование выявило тяжелые дефекты, когда инактивировался co-Smad (Fernandes et al. 2012). Т.о., в определенных случаях каноническая передача сигналов BMP нуждается только в R-Smad, но не в co-Smad.
Наблюдение, что независимая от co-Smad каноническая передача сигналов BMP действительно может обнаруживаться в др. исследованиях и др. тканевых системах, впервые было сделано при изучении раннего эмбрионального развития сердца, при котором BMP регулируемый ген, Nkx2.5 экспрессируется в отсутствии Smad4 (Chu et al. 2004). Кроме того, двойная кондиционная инактивация Smad1 и Smad5 в кости посредством Col2a-Cre приводит к тяжелой потере скелетных компонентов (Retting et al. 2009). Однако, кондиционная инактивация Smad4 посредством того же самого Col2-Cre вызывает лишь легкие дефекты кости (Zhang et al. 2005). Более того, исследования развития хрусталика показали, что Smad1 и Smad5, но не Smad4 необходимы для формирования хрусталика (Rajagopal et al. 2009). Изучение развития зубов продемонстрировало, что R-Smad необходим для экспрессии Msx1 независимым от Smad4 способом (Yang et al. 2014). Итак, имеются, по крайней мере, пять систем органов, обладающих независимой от co-Smad канонической передачей сигналов BMP во время развития. Важно. что сходные наблюдения описаны у Drosophila. У мутантов medea (Smad4 ортолог), omb может всё ещё экспрессироваться, при том, что omb является зависимым от mad (R-Smad ортолог) геном (Wisotzkey et al. 1998). Функция co-Smad в передаче сигналов BMP может быть ткане-специфической. Следовательно, роль co-Smad как центрального игрока в канонической передаче сигналов BMP д. быть пересмотрена.
С др. стороны, считается. что потеря Smad4 вызывает противоречивые результаты в эмбриональном мозжечке (Fernandes et al. 2012; Tong & Kwan 2013). Ранее мы объясняли это различиями в генетическом фоне используемых мышей (Tong & Kwan 2013). Было предположено, что независимость от co-Smad также может варьировать между разными генетическими фонами.

Does BMP function as a morphogen in cerebellum development?


Bone morphogenetic белки были идентифицированы как морфогены в разных процессах эмбрионального развития, при этом концентрационный градиент BMP приводил к разным реакциям реципиентных клеток (Sieber et al. 2009; Plouhinec et al. 2011). В случае развития эмбрионального мозжечка не было четких исследований роли BMPs как морфогена. Однако, было продемонстрировано, что BMPs , экспрессируются в верхней пластинке нервной трубки, тогда как антагонист BMP, NBL1, экспрессируется в Atoh1-позитивных клетках ARL (Krizhanovsky & Ben-Arie 2006). Это указывает на то, что концентрационный градиент BMP формируется внутри региона ARL. Т.о., морфогенетический эффект BMPs может существовать во время эмбрионального развития мозжечка.

Models for explaining anterior rhombic lip specification mechanism


Хотя хорошо известно, что мозжечковая ARL отвечает за генерацию разных типов глютаматергических нейронов в виде временной волны (Wilson & Wingate 2006; Yamada et al. 2014), механизм спецификации этих нейронов недостаточно охарактеризован. ARL продолжает воспринимать сигналы BMP из верхней пластинки нервной трубки и хороидного сплетения в ходе своего развития. Во время процесса спецификации, первая волна специфицированных клеток из ARL становится ядерной переходной зоной. Вторая волна спецификации дает гранулярные клетки. И последняя волна генерирует однополярные brush клетки (Wang et al. 2005b). Разные функциональные исследования по инактивации разных компонентов передачи сигналов BMP в мозжечке выявили потерю клонов ARLи дефекты в ARL (Qin et al. 2006; Fernandes et al. 2012; Tong & Kwan 2013). Исходя из этих исследований было предположена модель механизма спецификации ARL (Fig. 3).

Figure 3. Schematic diagrams illustrating the differences between the progressive specification model and the early allocation model in cerebellum anterior rhombic lip (ARL) development. (a1) Progressive specification model, wherein primitive stem cells are specified into different type of cells upon time. (a2) Early allocation model, wherein primitive stem cells are specified in early stages and gradually lose potency. Specified stem cells retain proliferative potential for generating more of them. (b) Illustration of the final destinations of ARL-derivatives from different stem cell pools (labeled by number in A1 and A2).

Progressive specification model


Модель прогрессивной спецификации (Molyneaux et al. 2007; Komada 2012; Greig et al. 2013), описывает генерацию разных типов нейронов посредством непрерывной спецификации нервных стволовых клеток. применив эту модель к ARL, мы предположили, что ARL содержит популяцию неспецифицированных нервных стволовых клеток, которые продолжают пролиферировать во время развития. Более ранние клетки, выходящие из ARL, подвергаются действию более низких уровней передачи сигналов. Напротив, клетки, позднее выходящие из ARL, подвергается действию более высоких уровней передачи сигналов. Клетки не специфицируются на очень ранних стадиях, а специфицируются только в то время, когда они близки к своему выходу из ARL. Следовательно, сигналы, воспринимаемые клетками пропорциональны продолжительности пребывания клеток в ARL перед выходом. Рано специфицированные клетки подвергаются действию низких уровней сигналов в ARL и становятся клетками NTZ. Позднее выходящие клетки из ARL становятся гранулярными клетками. На поздней ст. эмбрионального развития клетки ARL подвергаются действию наивысшего уровня сигналов и становятся однополярными brush клетками. Эта модель предсказывает, что ARL содержит примитивные нейральные стволовые клетки, которые обладают потенцией становиться каким-либо типом глютамаергических нейронов. Уровни сигналов д. быть способны манипулировать типами генерируемых нейронов.

Early allocation model


Мы также предложили др. модель, которая предполагает, что нервные стволовые клетки в ARL специфицируются на ранней стадии, чтоб дать разные популяции специфицированных типов нейрональных клеток. Непрерывная пролиферация ARL стволовых клеток увеличивает количества специфицированных клеток в разных популяциях типов нейронов. Сигналы от хороидного сплетения необходимы для поддержания стволовости ARL или ранней спецификации. В этой модели ARL нейральные стволовые клетки становятся гетерогенными на ранних эмбриональных стадиях. Некоторые исследования ARL обнаруживают определенный тип гетерогенности внутри ARL стволовых клеток, это подтверждает модель (Chizhikov et al. 2006, 2010; Cheng et al. 2012; Hagan & Zervas 2012).

Anterior rhombic lip heterogeneity


Как упоминалось ранее, стволовые клетки в ARL гетерогенны. Из разных генетических исследований следует, что имеются разные домены экспрессии генов внутри ARL. Эти домены может быть важны для спецификации стволовых клеток ARL.

Anterior rhombic lip heterogeneity classified by gene expression domain


Многие гены были описаны в качестве маркеров для ARLво время эмбрионального развития мозжечка. Однако, домены экспрессии этих генов несколько отличаются один от др. Эти различия строго указывают на то, что ARL может состоять из гетерогенных популяций стволовых клеток. В разных исследованиях, гены, включая Pax6 (Engelkamp et al. 1999), Atoh1 (Machold et al. 2011), Lmx1a, Msx1/2 (Chizhikov et al. 2010), Wnt1 (Hagan & Zervas 2012), Otx2 (Di Giovannantonio et al. 2014), Gdf7 (Landsberg et al. 2005) и др. строго экспрессируются в ARL.
Исследование Chizhikov четко продемонстрировало, что имеются различия в доменах экспрессии между Lmx1a, Wnt1, Gdf7, Msx1/2 и Atoh1 на ст. E12.5 в мозжечке (Chizhikov et al. 2006, 2010). Gdf7 экспрессируется в верхней пластинке нервной трубки и в очень каудальной области ARL (Cheng et al. 2012). Wnt1 экспрессия определяется в каудальной части ARL и передней части верхней пластинки нервной трубки (Hagan & Zervas 2012). Домен экспрессии Lmx1a сходен с таковым для Wnt1, но ещё более ограничен внутри верхней пластинки нервной трубки и каудальном регионе ARL (Hagan & Zervas 2012). Домен экспрессии Otx2 также сравним с таковым для Wnt1. Otx2 ещё более ограничен, чем домен для Wnt1 в каудальной части ARL (Hagan & Zervas 2012). В отличие от них Atoh1 экспрессируется в ростральном регионе ARL, обнаруживая лишь незначительное перекрывание с Lmx1a. Кроме того, Msx1/2 также может маркировать ARL, но в виде более широкого домена, покрывающего каудальную и рострпльную области ARL (Chizhikov et al. 2006). Разные домены генной экспрессии в ARL мозжечка суммированы на Figure 4. Однако, важнро упомянуть, что не все клетки внутри определенных доменов экспрессии генов обязательно экспрессируют все эти гены.

Figure 4. Summary on gene expression domains at early anterior rhombic lip (ARL) and roof plate. Different colors are used to illustrate gene domains, Atoh1 in green, Msx1/2 in red, Wnt1 in blue, Otx2 in yellow, Lmx1a in purple and Gdf7 in orange. Areas of ARL and roof plate are separated by dotted line. Rostral to caudal axis within ARL is indicated with double arrow-ended dotted line. Importantly, cells within a certain domain do not necessarily express all the genes of that domain.

Anterior rhombic lip stem cell primitiveness


Многие исследования были сфокусированы на спецификации клеточных судеб и свойствах стволовых клеток ARL. Однако, гетерогенность стволовых клеток внутри ARLизучена недостаточно. Из экспериментов по отслеживанию клонов с использованием Atoh1-CreERT2мыгей, ранние инъекций tamoxifen не могли пометить все гранулярные клетки мозжечка, поскольку они не все метились tamoxifen при инъекциях на поздних стадиях (Machold & Fishell 2005). Этот эксперимент показал, что на ранних стадиях развития мозжечканекоторые нейральные стволовые клетки являлись Atoh1-негативными, но позднее превращались в Atoh1-позитивные. Следовательно, популяция наиболее примитивных стволовых клеток д. присутствовать в ARL для генерации Atoh1-позитивных стволовых клеток.
Тот же самый принцип может быть использован для интерпретации эксперимента по отслеживанию клонов с использованием Wnt1-CreERT2 мышей. Инъекции tamoxifen Wnt1-CreERT2 мышам в разное время заставляют разные популяции клеток становиться меченными. На ранних стадиях (E10.5), метится только хороидное сплетение. Однако, инъекции на ст. E12.5 могут метить большое количество гранулярных клеток. Это подтверждает, что на ст. E12.5 Wnt1-позитивные ARL стволовые клетки не генерируются из популяции E10.5 Wnt1-позитивных стволовых клеток (Hagan & Zervas 2012). Следовательно, должна быть др. популяция примитивных стволовых клеток для генерации E12.5 Wnt1-позитивных клеток во время раннего развития ARL.
Эти два эксперимента подтвердили, что каудальная и ростральная часть ARL, это некие популяции примитивных стволовых клеток, которые не экспрессируют специфичные для регионов гены, необходимы для генерации и пополнения специфичных ARL стволовых клеток. Однако, мало что известно об этих гипотетических примитивных популяциях стволовых клеток, включая их анатомическое расположение, профили генной экспрессии и их клональное происхождение.

Relationship between ARL heterogeneity and the two models for ARL specification


Предложены два механизма спецификации ARL, а именно, модель прогрессивной спецификации и модель раннего распределения. В последней судьба стволовых клеток д. специфицироваться на ранней эмбриональной стадии. Обнаружение различных доменов экспрессии в ARLна ранних ст. эмбриогенеза согласуется с моделью, что разные популяции ARL стволовых клеток могут иметь отличающиеся профили генной экспрессии. Более важно, что отслеживание клонов с использованием Rosa26R, показало,. что разные домены генной экспрессии в ARL д. предопределять финальную позицию их клонов. Lmx1a экспрессируется в каудальной части ARL на ранней стадии, а гранулярные клетки клонов Lmx1a-Creмогут быть обнаружены только в задней части мозжечка, но не в какой-либо передней части (Chizhikov et al. 2010). Сходным образом, Wnt1 экспрессируется в каудальной части ARL на ранней стадии и в гранулярных клетках клона Wnt1-CreERT2, концентрируясь в основном на задней половине мозжечка (Hagan & Zervas 2012). Эти результаты подтверждают, что ARL уже имеет определенное распределение стволовых клеток в их финальных позициях на ранних стадиях. В противовес Lmx1a и Wnt1, Atoh1 экспрессируется в ростральной части ARL. Индукция с помощью tamoxifen Atoh1-CreERT2 на ст. E12.5 метит только гранулярные клетки в переднем регионе мозжечка (Machold & Fishell 2005), что противоположно мечению Wnt1-CreERT2в задней части мозжечка. Это подтверждает, что ранняя ARL распределена на разные домены.
В др. модели прогрессивной спецификации ARL стволовые клетки еще не являются полностью специфицированными вплоть до поздних эмбриональных стадий. Хотя наблюдение различающихся доменов генной экспрессии в ARL противоречит этой модели, предполагается, что гипотетические примитивные стволовые клетки (discussed in 'Anterior rhombic lip stem cell primitiveness') фактически подтверждают эту модель. Эта модель утверждает, что ARL стволовые клетки д. быть не полностью специфицированы вплоть до поздних стадий. Популяция гипотетически примитивных стволовых клеток не должна экспрессировать Math1 или Wnt1, и поэтому они не специфицированы на ранних стадиях. Т.о., подтверждается. что спецификация является уже идущим процессом в ARL.
Гетерогенность ARL стволовых клеток предоставляет много информации для понимания двух разных моделей спецификации ARL.

BMP/Smad signaling and ARL heterogeneity


Каноническая передача сигналов BMP необходима для развития ARL стволовых клеток. Устранение передачи сигналов Smad в мозжечке приводит к дефектам всех клонов ARL. Это может быть объяснено наблюдением, что Msx2 теряется тотально у наших Smad1/5 двойных мутантов (Tong & Kwan 2013). Поскольку Msx1/2 экспрессируются в ростальной и каудальной частях ARL (Chizhikov et al. 2006), то потеря домена Msx2 у мутантов Smad1/5 четко указывает на то, что передача сигналов Smad необходима всей ARL.
Однако, действительно ли передача сигналов BMP/Smad регулирует гетерогенность ARL или она контролирует пропорции доменов экспрессии разных генов, известно недостаточно. Поскольку BMPs являются морфогенами, то доза или продолжительность действия BMP могут приводить к разным последствиям. У мутантов по Smad или BMP рецепторам, каноническая передача сигналов BMP полностью устраняется. Эти данные не могут отвечать дефекты дозы BMP в регуляции спецификации ARL. Следовательно, кондиционная инактивация разных BMP лигандов важна для изучения морфогенетических эффектов BMP в ARL и в развитии мозжечка.

Conclusion and further questions


Yet, there are many questions still not answered in regard to both BMP signaling and embryonic cerebellum development. One of the most important questions is the co-Smad independent canonical BMP signaling that was demonstrated via the embryonic cerebellum development. This co-Smad independency has been shown in several systems. Thus, it challenges the current model of canonical BMP signaling, which places co-Smad in an essential position. In regard to this, two research directions may help. The first is to find out more systems that display co-Smad independent canonical BMP signaling. Secondly, an understanding of the fundamental molecular differences between co-Smad dependency and co-Smad independency is needed.
Regarding the role of BMP signaling in embryonic cerebellum development, there are still some unknowns. First, the role of BMP signaling in the VZ development has not yet been clearly dissected. Although it eventually affects the total number of Purkinje cells, the exact cellular and molecular mechanisms are not defined. On the other hand, whether BMPs function as morphogens during the cerebellum development has not yet been clearly elucidated. The current genetics analysis on the cerebellum development completely ablated the BMP signaling. Therefore, the effects of morphogens gradients on ARL cannot be studied. Thus, conditional knockouts on the ligands or antagonists may provide new insights on the roles of gradient of BMPs in regulating ARL stem cells.
In addition, we raised some issues about the current understanding of cerebellum ARL stem cell development. In regard to the ARL stem cell specification mechanism, we proposed two models, the progressive specification model and the early allocation model. Both models have some supporting evidence, but no strong evidence has been published. Research towards validating these models will be important for understanding the neural stem cell specification mechanism and thus the stem cell biology. Based on the lineage tracing research using CreERT2 mice, we suggested that a primitive ARL stem cell population may be present during early development. These hypothetic stem cells have not been identified yet. Research into proving or disproving this hypothesis will be essential.