Посещений:
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕСНИЧКА-ЦЕНТРОСОМА

Динамика белковых взаимодействий

A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface
Gagan D. Gupta, Etienne Coyaud, Joao Gon?alves, Bahareh A. Mojarad, Yi Liu, Qianzhu Wu, Ladan Gheiratmand,David Comartin, Sally W.T., Mikhail Bashkurov, Monica Hasegan, James D. Knight, Zhen-Yuan Lin, Markus Schueler, Friedhelm Hildebrandt, Jason Moffat, Anne-Claude Gingras, Brian Raught, Laurence Pelletier
Cell Volume 163, Issue 6, 3 December 2015, Pages 1484–1499

  • BioID conducted on 58 centriole, satellite, and ciliary transition zone proteins
  • Centriole-cilium interface map comprises >1,700 unique components, >7,000 interactions
  • Microscopy and functional screens confirm new centriole-cilium regulatory modules
  • Dynamic modulation of interaction landscape observed during ciliogenesis program


    • Summary The centrosome is the primary microtubule organizing center of the cells and templates the formation of cilia, thereby operating at a nexus of critical cellular functions. Here, we use proximity-dependent biotinylation (BioID) to map the centrosome-cilium interface; with 58 bait proteins we generate a protein topology network comprising >7,000 interactions. Analysis of interaction profiles coupled with high resolution phenotypic profiling implicates a number of protein modules in centriole duplication, ciliogenesis, and centriolar satellite biogenesis and highlights extensive interplay between these processes. By monitoring dynamic changes in the centrosome-cilium protein interaction landscape during ciliogenesis, we also identify satellite proteins that support cilia formation. Systematic profiling of proximity interactions combined with functional analysis thus provides a rich resource for better understanding human centrosome and cilia biology. Similar strategies may be applied to other complex biological structures or pathways.

    Figure
    Центросома состоит из 9 симметричных центриолярных пар, окруженных около-центриолярным материалом, и действует как центр, организующий первичные микротрубочки (МТ)в клетках млекопитающих. В неделящихся клетках, центриоли могут также служить матицей для образования первичной реснички на плазматической мембране. Материнская центриоля специфически снабжена субдистальными придатками, необходимыми для закрепления МТ и дистальными придатками, которые влияют на удержание центриоли и базального тельца на плазматической мембране во время формирования реснички. Дистальные придатки функционируют в переходной зоне (TZ),в т.наз., ассоциированным с мембраной субдомене реснички, выполяняя функцию "ворот", контролирующих поступление и выход из собственно ресничики. Саттелиты центриолей - это электрон-плотные структуры, которые накапливаются вблизи центросом, участвуя в зависимой от МТ доставке центросомных и цилиарных белков, регулируя тем самым образование реничики и биогенез центросомы. Неспособность собственно регулировать функцию центросом сопровождается анеуплоидией и первичной микроцефалией ( Godinho, Pellman, 2014; Sir et al., 2011) и нарушения функции ресничек могут приводить к цилиопатиям (Reiter et al., 2012).
    Shotgun (ружьё) протеомный, биоинформационный и геномный подход идентифицировал многие белки оесничек и центросом. Однако, в основном из-за нерастворимой природы центросомой и ресничкой генерируемая сеть межбелковых взаимодействий остается в основом непонятной. Недавно разработанная техника proximity-dependent biotinylation (BioID) может быть использована для выяснения белковых взаимодействий в живых клетках. Интересующий полипептид сливается in-frame с мутантным Escherichia colli биотин-конъюгирующ0им энзимом (BirA R118G или BirA*), это влияет на биотинилироание соседних аминогрупп на соседних белках. В результате сильно лизиса клетки биотинилированные полипептиды могут быть очищены, используя streptavidin resin, и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (MS). Мы использовали BioID, чтобы генерировать in vivo сложную карту близости белка в интерфейсе центросома-ресничка человека. Большой субнабор этой сети затем стал предметом высоко разрешающего скрининга и функционаьного анализа, чтобы установить взаимодействия, которые играют критическую роль в биологии центросомы и реснички

    Обсуждение


    Мы установили профили близости 58 компонентов интерфейса (зоны разделения) центросома-ресничка и центриолярныз саттелитов, образующих сеть из более 7000 взаимодействий между 1700 уникальных белков, чтобы установить соразмерность ранее неизвестного пространства взаимодействий. Вследствие получения суб-дифракционного изображения 20 вновь описанных белков центриоли, саттелитов и реснички оказалось возможным определить или уточнить локализацию, подтвердив, что дальнейшая разработка этой большой базы данных даст дополнительную важную информацию относительно высокого порядка организации этих структур. Наша BioID карта уже довоьно богата функциональными белками: содержит более 30% новых составляющих сети центросома-реничка, чтобы сделать серию функциональных screens (картин)(удвоения центриоли, образования ренички или морфологии сателлитов), позволяя нам описать предполагаемые функции по регуляции в центриоле и ресничке 335 полипептидов.
    112 белков обнаруживали фенотипические изменения в 2-х из 4-х функциональных подходов, подтверждая, что регуляция биогенеза центриолей, образование реснички и центриолярных сателлитов интимно связаны. Ещё раньше было установлено, что сателлитные белки регулируют образование реснички и сборку центриолей. Принимая во внимание высокую степень связей (Рис. S3D) и их многочисленные специализированные роли в биогенезе центриолей и реснички, центриолярные сателлиты привлекли особое внимание.
    Наконец, анализ interactomes от нереснитчатых и реснитчатых клеток позволил нам начать понимать высокого порядка изменеия в близости белков во время формирования реснички. В соответствии с более ранними ступенями цилиогенеза, происходящими на дистальном конце центриоли, наблюдалось множество драматических изменений в Pxls для белков придатков bait (напр., CEP128 и др.). Также обширные взаимодействия в TZ bait белках, включая взаимодействия Tz1-дистального придатка, которые наблюдались даже в клетках без ресничек. В самом деле, некоторые TZ белки, как известно, располагаются на центросоме и центриолярных сателлитах или ассоциируют с МТ перед образование реснички, а белки IFT, Bardet-Biedl syn (BBS) и dynein плеч и в комплексах радиальных спиц (spoke), могут быть предварительно собраны перед образование реснички. Это согласуется с нашими функциональными данными, напр., нокдаун некоторых TZ белков, расположенных на центросоме, затрагивают морфологию центриолярных сателлитов в клетках, не имеющих ресничек. Это обширное функциональное взаимодействие подтверждает, что сборка TZ белков, скорее всего, закладывается ('primed') в клетках без ресничек посредством координаци между сателлитами и дистальным концом центриоли. Усиление плотности взаимодействий между Tz1, Tz2 и стержневыми группами и реорганизация TZ белков в ответ на сывороточное голодание может затем управлять процессом образования реснички.
    Итак, наши результаты продемонстрировали, что BioID вместе с направленным функцирональным скринингом может составлят основу для лучшего понимания чрезвычайно сложных внутриклеточных субструктур, таки как центросомы, и важных биологических процессов, таких как цилиогенез. В самом деле комбинация профилей Pxl, исследования по локализации и функциональной геномике могут быть использованы для изучения многих др. клеточных структур, органелл или процессов.