Посещений:
СЛУХОВЫЕ ВОЛОСКОВЫЕ КЛЕТКИ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ




Факторы, способствующие планарной клеточной полярности и морфогенезу

Developmental regulation of planar cell polarity and hair-bundle morphogenesis in auditory hair cells: lessons from human and mouse genetics
" Lu, X. and Sipe, C. W.
WIREs Dev Biol, 5: 85–101. doi:10.1002/wdev.202

Hearing loss is the most common and costly sensory defect in humans and genetic causes underlie a significant proportion of affected individuals. In mammals, sound is detected by hair cells (HCs) housed in the cochlea of the inner ear, whose function depends on a highly specialized mechanotransduction organelle, the hair bundle. Understanding the factors that regulate the development and functional maturation of the hair bundle is crucial for understanding the pathophysiology of human deafness. Genetic analysis of deafness genes in animal models, together with complementary forward genetic screens and conditional knock-out mutations in essential genes, have provided great insights into the molecular machinery underpinning hair-bundle development and function. In this review, we highlight recent advances in our understanding of hair-bundle morphogenesis, with an emphasis on the molecular pathways governing hair-bundle polarity and orientation. We next discuss the proteins and structural elements important for hair-cell mechanotransduction as well as hair-bundle cohesion and maintenance. In addition, developmental signals thought to regulate tonotopic features of HCs are introduced. Finally, novel approaches that complement classic genetics for studying the molecular etiology of human deafness are presented.


Рисунки к статье


 |  Organization of lymphatic vasculature.


 | 



Потеря слуха является касается 48 миллионов взрослых и 2-3 из каждой 1000 детей с США (Hearing Loss Association of America). Огромное большинство врожденной потери слуха является нейро-сенсорного происхождения из-за дефектов аппарат преобразования звуков во внутреннем ухе. Доступное лечение потери слуха сегодня ограничено и развитие новых терапевтических вмешательств очень важно.
Превалирующие врожденные потери слуха могут быть синдромальными, когда потери слуха сопровождаются симптомами в др. органах, или несиндромальными, когда потери слуха являются единственным недостатком. Несиндромальная потеря слуха может быть подразделена на категории, исходя из характера наследования: DFNA для аутосомно доминантных, DFNB для аутосомно рецессивных, DFN для X-сцепленных форм и митохондриальные формы, которые наследуются только от матерей (see Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1434/ for more details). Описано более 400 генетических синдромов с потерей слуха и почти 100 генов, ответственных за наследуемые формы глухоты (deafness genes) (see Hereditary Hearing loss Homepage, http://hereditaryhearingloss.org/ for an updated deafness gene list).
Чтобы определить функцию генов глухоты человека важно использование животных моделей. Мыши являются особенно привлекательной моделью, поскольку анатомия и физиология слуховой системы сходны с таковыми человека и разработаны инструменты для генетических манипуляций. Мышиные нокауты генов, ортологов генам глухоты человека предоставляют важную информацию о нормальной функции генов и механизмах возникновения болезни. К этому следует добавить специфичные для внутреннего уха условные нокауты (cKO) др. важных генов для дальнейшего выяснения генетической сети и молекулярных путей. Более того, передовые генетические скрининги у мышей (и рыбок данио) выявили новые гены, важные для слуха.[6-8]

THE MACHINERY FOR SOUND TRANSDUCTION


The Auditory Sensory Epithelium


Слуховой орган внутреннего уха - это спиральной формы улитка. Она состоит из трех заполненных жидкостью камер, наз. scala vestibuli и scala tympani, заполненных перилимфой и отделенной от центральной камеры, scala media канал улитки, заполненный эндолимфой, в которой находятся апикальные поверхности сенсорного эпителия, наз. Кортиевым органом (OC) (Figure1). Эндолимфа богата K+ и бедна Na+ и имеет положительный потенциал по сравнению с перилимфой. Базальная поверхность OC аодергается действию перилимфы и располагается на базилярной мембране, эластической структуре, которая вибрирует в ответ на звук. OC состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток (IHCs) и трех рядов наружных волосковых клеток (OHCs) между которыми расположены несенсорные поддерживающие клетки (SCs) (Figure 2(a)). Волосковые клетки (HCs) являются сенсорными рецепторами звуков; IHCs передают информацию в головной мозг, тогда как OHCs умножают звуковые сигналы. У людей имеется около 3500 IHCs и 12,000 OHCs, а HCs, потерянные из-за генетических или средовых факторов не замещаются с помощью регенеративных процессов, приводя к постоянной потере слуха.

Figure 1.

Cross-sectional diagram of the cochlear duct. The scala media, or cochlear duct, is shaded light blue and contains potassium-enriched endolymph secreted from the stria vascularis. The scala vestibuli and scala tympani, separated from the cochlear duct by Reissner's membrane and the basilar membrane, respectively, are shaded pink and contain the perilymph. Auditory hair cells are colored blue, and supporting cells of the organ of Corti are orange. Efferent nerve fibers innervating inner hair cells are colored blue and afferent nerve fibers innervating all rows are red. Other cells types residing outside the organ of Corti are colored green. IHC, inner hair cell; OHCs, outer hair cells.

Figure 2. Organization of the organ of Corti and hair bundle. (a) En face diagram of the mammalian organ of Corti showing the mosaic pattern of hair cells (shaded white) and supporting cells (shaded gray). The mediolateral and longitudinal axes are indicated. Abbreviations indicate distinct cell types: IHC, inner hair cell row; OHC1-3, outer hair cell row; DC, Deiters' cell; OPC; outer pillar cell; IPC, inner pillar cell; IPhC, inner phalangeal cell. (b) Cross-sectional diagram of the hair bundle depicting five distinct populations of stereociliary links colored according to the accompanying key. Stereocilia rootlets are anchored in the cuticular plate (shaded gray). The kinocilium and underlying basal body are on the right. (c) En facescanning electron micrograph of the mouse organ of Corti at E18.5. White triangle indicates the kinocilium of an individual hair cell. (d) Left, an E18.5 hair bundle showing the kinocilium (white triangle) lying at the vertex of the hair bundle. Right, a P5 bundle showing the mature V-shape and staircase arrangement of the three stereocilia rows in an outer hair cell. Note that the kinocilium has been resorbed.

Hair-Bundle Structure and Function


HCs характеризуются присутствием пучков волосков (или пучков стереоцилий) выступающие из их апикальной поверхности. Пучки волосков состоят из трех рядов модифицированных микроворсинок, известных как стереоцилии, которые градированы по росту и расположены в виде лестничных ступенек (Figure 2(b) и (d)). Во время развития единственный, базирующийся на микротрубочках (MT) киноцилий представляет собой вершину V-образного пучка волосков, соседствующую с самым высоким рядом стереоцилий (Figure 2(c) и (d)). Стереоцилии это пальце-подобные проекции, заполненные сильно поперечно связанными наборами униформно поляризованных актиновых филамент. Основание каждой стереоцилии более узкоес конусом вблизи плазматической мембраны, где актиновые филаменты образуют корешок, проникающий в кутикулярную пластинку, плотную сеть актина в апикальном домене клетки. Актиновая сердцевина каждой стереоцилии позволяет ей двигаться как ригидная палочка. а точка опоры в её основании отвечает за звуковые вибрации.[9]
Стереоцилии внутри пучка волосков взаимосвязаны с помощью разного типа внеклеточных филамент, наз. связками (Figure 2(b)). Соседние ряды стереоцилий соединены с помощью концевых связок, которые идут от кончика короткой стереоцилии вверх к стороне более высокой соседней. Стереоцилии кроме того взаимосвязаны как внутри, так и между рядами с помощью горизонтальных top connectors, временных боковых связок или shaft connectors и угловых связок. Кроме того, связки с киноцилием соединяют киноцилий с соседними стереоцилиями. Сцепление и жесткость пучков волосков делают возможными связанные движения стереоцилий, важные для максимальной чувствительности к отклонениям.[10]

Mechano-Electrical Transduction in Cochlear HCs


Пучки волосков - это места механо-электрической трансдукции (MET). В улитке кончики самых высоких из ряда OHC стереоцилий проникают в текториальную мембрану, бесклеточный желатинозный матрикс, который находится поверх HCs, отходя от spiral limbus (Figure 1). Звуковые вибрации генерируют сдвигающие (shearing) движения между базилярной мембраной и текториальной мембраной, приводя в результате к отклонению (deflection) пучка волосков. Поляризованная лестнице-образная структура пучков волосков делает их чувствительными к направлению отклонения. Отклонение пучка волосков в направлении самых высоких стереоцилий (т.e., вдоль оси возбуждений), как полагают, увеличивает натяжение кончиковых связок, натягивая прикрепленную к ним мембрану и заставляет чувствительные к механическим воздействиям MET каналы открываться и приводить к деполяризации HC. Это в свою очередь вызывает высвобождение нейротрансмиттера в основании HC, вызывая потенциал действия в центростремительном кохлеарном нерве. Девиации пучков волосков в направлении наиболее коротких стереоцилий снижают вероятность открытия MET канала и, следовательно, интенсивность возбуждения кохлеарного нерва.[10]

HAIR-BUNDLE MORPHOGENESIS IN MICE


Поскольку время морфогенеза пучков волосков отличается у людей, у которых развиваются функциональные пучки волосков и могут слышать до рождения, и у мышей, чьи пучки волосков продолжают созревать в течение первых двух недель постнатального развития, хотя молекулярные и клеточные процессы, управляющие морфогенезом пучков волосков в основном одинаковы.

Planar Polarization of HCs


V-образные пучки волосков являются признаком присущей клеткам планарной клеточной полярности (PCP), которая определяется как полярность в плоскости, перпендикулярной апикально-базальной оси HC. Кроме того, HC PCP проявляется и на тканевом уровне: все пучки волосков униформно ориентированы вдоль медиально-латеральной оси OC, при этом их вершина обращена в направлении латерального края канала улитки (Figures 2(c) и 3(a)). HC PCP проявляется как в слуховом, так и вестибулярном сенсорном эпителии (see Ref [11] о регуляции PCP в utricle и saccule).
После выхода из клеточного цикла происходит дифференцировка HC в виде градиента вдоль от основания к верхушке и от медиальной к латеральной части оси улитки, начинаясь приблизительно на день эмбриогенеза (E) 15.5. Одним из самых ранних событий в дифференцировке HC является миграция киноцилия, специализированной первичной реснички от центра на апикальной поверхности HC в направлении латерального края апикальной поверхности HC (Figure 3(c)). Это сопровождается градированным постепенным удлинением стереоцилий вокруг киноцилия, и приобретаемая V-образная форма пучков волосков формируется на ст. E17.5, с киноцилием во главе. Киноцилий закреплен на базальном тельце непосредственно ниже апикальной поверхности HCs. Расположение базального тельца после того как оно мигрирует в направлении периферии волосковой клетки первоначально неточное; из-за склонности перемещения в направлении латерального полюса, он может оказаться расположенным в более широкой области, чем его финальное фиксированное положение на латеральном полюсе (Figure 3(b) and (c)). В результате формирующийся пучок волосков обладает рядом ориентаций и постоянно переориентируется, пока его вершина не окажется в точности на латеральном полюсе в первую неделю постнатального развития . Киноцилий затем редуцируется и отсутствует в в зрелом пучке волосков (Figure 2(d)). Т.о., киноцилий, по-видимому, играет онтогенетическую роль в регуляции формы и ориентации пучка волосков.

Figure 3.

Development of planar cell polarity in the organ of Corti. (a) En face view of the organ of Corti. Arrow indicates the kinocilium at the hair-bundle vertex. Acetylated tubulin, green; actin, red. (b) Planar-polarized arrangement of the basal body and the associated daughter centriole along the medial-lateral axis (arrow). The basal body is labeled by phospho-?-catenin staining (red) and centrioles are labeled by Centrin2-GFP (green). F-actin, cyan. (c) Schematic diagram of kinocilium/basal body movements and early apical morphogenesis in the mouse. At E15.5, the centrally placed kinocilium/basal body (green dot with red annulus) migrates to the cell periphery where it closely associates with the cortex. A bare zone (orange) devoid of microvilli (small gray dots) subsequently develops in the vicinity of the kinocilium. As the bare zone expands, the kinocilium/basal body relocalizes to a more central position where it aligns along the medial-lateral axis with the daughter centriole. Here, the nascent hair bundle forms with the kinocilium positioned at its vertex (large gray dots), abutting the expression domain of bare zone proteins. Daughter centrioles, blue dots.

Acquisition of the MET Machinery and Staircase Formation


Доказательства с помощью иммунолокализации, ультраструктурного и электрофизиологического анализа показали, что HCs приобретают свой аппарат MET в виде градиента от основания к вершине с постнатального дня P0 по P2.[10] Во время первой постнатальной недели, градированная высота стереоцилий становится очевидной, образуя ступенчато образный паттерн, характерный для волосков у взрослых (Figure 2(d)). Рост стереоцилий осуществляется за счет добавления новых актиновых мономеров к колючим концам филамент, которые добавляются к кончикам стереоцилий.[12] Более того, F-актиновый стержень становится всё более связанным поперечно и корешки образуются плотными актиновыми пучками, распространяющимися через ankle регион и проникающими в кутикулярную пластинку, увеличивая жесткость пучка волосков. Во время ранних постнатальных недель формируются и созревают также слуховые ленточные синапсы и восприятие звуков начинается приблизительно на ст. P12-P14.[10]

MOLECULAR PATHWAYS FOR HAIR-BUNDLE MORPHOGENESIS


Точная организация и ориентация пучков волосков находится под утонченным генетическим контролем. Реакционно-диффузионная модель морфогенеза пучков волосков предполагает, что клеточная граница и киноцилий являются двумя сигнальными центрами, которые генерируют паттерны морфогенов для установления формы пучка волосков.[13] Из-а неизбежного упрощения эта модель предоставляет пригодную основу для понимания сложного взаимодействия между присущими волосковой клетке факторами и межклеточными взаимодействиями, которые всё более очес blys благодаря генетическому анализу.

The Crucial Role of Kinocilium in Hair-Bundle Shape and Orientation


Роль киноцилия в развитии пучков волосков продемонстрирована с помощью генетического удаления киноцилия. В частности, удлинение и поддержание реснички зависит от транспорта частиц вдоль аксонемы с помощью консервативного аппарата intraflagellar transport (IFT) .[14] Специфичная для внутреннего уха делеция трех IFT генов,Ift88, Kif3a и Ift20, вызывает в HCs малорослый или отсутствие киноцилия и уплощенные пучки волосков, указывая на роль киноцилия в становлении V-формы пучка волосков.[15-17] Уплощенные или неправильной формы и циркулярные пучки становятся при отделении от киноцилия у мутантных мышей по генам, участвующим в цилиопатиях у людей, которые включают синдром Bardet-Biedl (BBS),[18] Meckel-Gruber syndrome (MKS) [19] и Alstrоm syndrome (Alms).[20] Кроме того, CEP250 и DCDC2, могут выполнять функции, связанные с ресничками, как недавно было установлено участвуют в возникновении врожденной глухоты у человека.[21, 22] Однако, их функции в морфогенезе пучков волосков неизвестны. Киноцилий связан с самыми высокими стереоцилиями посредством киноциллярных связок (Figure 2(b)). Сходны мутации ресничек у мышей с отсутствием CD2 изоформы protocadherin-15 (Pcdh15), компонента киноциллярных связок, приводят к тому, что киноцилий оказывается отделен от пуска волосков, это часто приводит к уплощенной или циркулярной форме пучков.[23] Т.о., киноциллярные связки необходимы для становления нормальной V-образной формы пучка волосков и может регулироваться генми ресничек, напр., транспортом компонентов киноциллярных связок.

Regulation of Hair-Bundle Polarity and Orientation by Rho Family GTPases


Rho семейство GTPases, включая RhoA, Rac и Cdc42, являются центральными регуляторами актинового и MT цитоскелетов.[24] В фибробластах они обеспечивают образование стрессовых волокон, ламеллиподий и филоподий, соотв. они также регулируют динамику MT и/или ориентацию MT organizing center (MTOC) с помощью разных эффекторов. Благодаря скоординированной регуляции динамики актина и MT, Rac и Cdc42 обладают эволюционно законсервированными функциями в управлении миграции клеток и полярности клеток. Не удивительно, что семейство Rho GTPases участвует в морфогенезе пучков волосков. Хотя RhoA сама по себе не оказывает непосредственного влияния на развитие пучков волосков, но мутации избыточности функции в Diaphanous 1 и 3, кодируют членов formin-семейства актин-нуклеирующих белков, активируемых с помощью RhoA, вызывают аутосомно доминантные формы потери слуха у человека. Поскольку formins взаимодействуют с колючими концами актиновых филамент , чтобы стимулировать их рост, то Diaphanous гены могут играть роль в росте и поддержании стереоцилий. Интересно, что мышиные модели с избыточной экспрессией Diaphanous 3 имеют удлиненные и слитые стереоцилии в IHCs, но не в OHCs, приводя к прогрессивной потере слуха.[25]
Используя условные мутации, было установлено, что Rac1, посредством своего эффектора p21-activated kinase (PAK), и Cdc42, посредством своего эффектора aPKC, оба играют ключевые роли в HC PCP и морфогенеза пучков волосков.[26, 27] В Rac1 cKO улитке пучки волосков дезориентированы и уплощены или имеют неправильную форму с аберрантно расположенным киноцилием. Сходные дефекты наблюдались после делецииCdc42 в OHCs и SCs в начале дифференцировки HC. Интересно, что делеция Cdc42 в HCs на более поздней стадии с использованием др. Cre драйвера не влияет на PCP или образование ступенчато-образной формы пучков волосков, а вместо этого вызывает дефекты поддержания стереоцилий в зрелых пучках волосков.[28] Эти данные указывают на неперекрываемость функций Rac1 и Cdc42 в образовании пучков волосков и на дополнительную роль Cdc42 в поддержании пучков волосков.

A MT-Mediated Machinery for Kinocilium/Basal Body Positioning


KIF3A является компонентом kinesin-II мотора, направленного к плюс концу, необходимым для цилиогенеза. В Kif3a cKO улитке базальные тельца обнаруживаются аномально расположенными по сравнению с базовой позицией в HCs и не связаны с ориентацией пучков волосков, чего не наблюдается у др. мутантов ресничек. Более того, KIF3A регулирует локальную активность Rac-PAK в кортексе HC после миграции базального тельца к латеральному полюсу. Если она концентрируется вдоль латеральных краев HCs дикого типа, то активность Rac-PAK диффузно располагается по краям HC в улитке Kif3a cKO.[16] Это уникальное фенотипическое отклонение указывает на функцию KIF3A, не связанную с ресничками, а специфически связанную с MT-обеспечиваемым внутриклеточным транспортом, с регуляцией позиции базального тельца и передачей сигналов Rac-PAK. Помимо создания основы для киноцилия, базальное тельце закрепляет и организует расположение цитоплазматических MT в HC. Эта сеть MTs, по-видимому, является динамичной во время эмбриогенеза и было предположено, что плюс-концы MT взаимодействуют с кортексом HC посредством механизма 'search and capture', [29] который закрепляет базальное тельце вблизи латерального полюса и индуцирует локальную активацию Rac-PAK в кортексе HC ; kinesin-II/KIF3A, скорее всего, облегчает активацию Rac путем доставки в кортекс пока неизвестного груза (Figure 4).

Figure 4. Model for establishment of hair-bundle polarity by microtubule-mediated hair cell-intrinsic machinery. Left, en face diagram of an individual hair cell showing the distribution of proteins implicated in basal body positioning, colored according to the key. The nascent hair bundle is colored pink with the basal body (gray circle) at its vertex. Centriolar microtubules are depicted as blue lines. Right, magnified view of the boxed area on the left. During development, cortical LGN/G?i recruits LIS1/dynein to exert force on centriolar microtubules, pulling the kinocilium/basal body toward the lateral hair cell cortex. Interaction of microtubule plus-ends with the hair cell cortex stimulates Rac-PAK signaling, likely through delivery of a kinesin-II cargo. In turn, localized Rac-PAK activity stabilizes microtubule cortical attachment to position the basal body appropriately. Plus and minus signs indicate the plus-end and minus-end of the microtubule, respectively.

Недавно получено строгое подтверждение этой модели с помощью функционального разложения эволюционно законсервированного пути асимметричных клеточных делений (asymmetric cell division (ACD)) и ориентации митотического веретена в HC PCP (see Box 1).

BOX 1. ACD IN DROSOPHILA NEUROBLASTS

Recent advances into understanding the molecular machinery for cell-intrinsic polarity have been informed by seminal investigations in the Drosophila neuroblast, where cortical polarity proteins act in concert with cytoplasmic dynein and astral MTs to orchestrate ACD.[30] Neuroblasts give rise to the central nervous system of the fly through repeated rounds of asymmetric divisions to produce another neuroblast and a smaller daughter cell with limited proliferative and fate potential. In Drosophila neuroblasts, asymmetric apical enrichment of the Par3/Par6/aPKC complex serves as a cortical polarity cue for spindle orientation (Figure 5). Binding of the adaptor protein, Inscuteable (ortholog of mammalian INSC), links the Par complex to Pins (ortholog of mammalian LGN/GPSM2 and AGS3/GPSM1). Pins, in turn, bind the membrane-anchored heterotrimeric G-protein G? and the MT and dynein-binding protein Mud (ortholog of mammalian NuMA), thereby coupling cell polarity with the mitotic spindle. Mud engages the cytoplasmic dynein motor to generate pulling force on astral MTs, which appropriately orients the mitotic spindle for subsequent asymmetric division. The dynein regulator Lis1 is also required for neuroblast spindle orientation and regulates MT dynamics as well as cortical targeting of dynein.[30] This spindle orientation machinery is highly conserved in mammals.


Figure 5. Mechanisms for asymmetric cell division of Drosophila neuroblasts. Several protein complexes localize to the apical neuroblast cortex during mitosis to regulate asymmetric cell division. INSC links the Baz/Par6/aPKC complex to Pins, which in turn forms a complex with G?i and Mud, thereby coupling cell polarity with mitotic spindle orientation. Mud engages the cytoplasmic dynein motor to exert force on astral microtubules to orient the spindle.

Удивительно, пертурбации в LIS1, Gαi, LGN или INSC приводят к дефектам позиционирования базального тельца, к дефектам формы и ориентации пучков волосков, демонстрируя необходимость консервации пути ориентации веретена для PCP в пост-митотических HCs.[31-33] Известно, что мутации в GPSM2, гомологе LGN у человека, вызывают синдром Chudley-McCullough, наследственное заболевание человека, характеризующееся глухотой и аномалиями головного мозга, подчеркивая важность этого пути в головном мозге и для развития HC.[34]
В улитке многие из этих белков обнаруживают поляризованное распределение на апикальной поверхности HCs. LGN, INSC и Gαi расположены в латеральной 'bare zone' , лишенной микроворсинок (Figures 3(c) and 4), которой противостоит комплементарный медиальный домен из aPKC-Par6b. Эти домены примыкают к основанию формирующегося пучка волосков. В одном исследовании Par3 был локализован в латеральной голой зоне и клеточном соединении, указывая, что Par3 может привлекать LGN/Gαi в латеральную часть кортекса клетки путем соединения с INSC, аналогично его роли в нейробластах Drosophila.[33] Расположение Par3 на стороне клетки, противоположной aPKC-Par6b [33] подтверждает, что регуляция сигналов кортикальной полярности в HCs может отличаться от таковой в нейробластах Drosophila или у зигот C. elegans.[30] Асимметричное расположение кортикальной aPKC в HCs регулируется с помощью Gαi и Cdc42.[27, 32] Более того, модуль LGN/Gαi/dynein, скорее всего, образует позитивную петлю обратной связи с кортикальной передачей Rac-PAK, чтобы устанавливать положение базального тельца, т.к. LIS1-дефицитные HCs обнаруживает пониженную активность Rac-PAK, что коррелирует с дефектами организации MT.[31]
Итак, эти данные подтверждают, что передача сигналов Rac-PAK, передача сигналов Cdc42-aPKC и путь LGN/Gαi/dynein скоординированно регулируют расположение базального тельца, способствуя отлавливанию MT на латеральном полюсе HCs (Figure 4). Хотя взаимодействия между, присущими клетке, путями изучены недостаточно, они предполагают формирование ими позитивной петли обратной связи, в результате отлавливание кортикальных MT стимулирует локальную активность Rac-PAK, это в свою очередь стабилизирует закрепление кортикальных MT, важное для позиционирования базального тельца (Figures 4 and 6).

Figure 6. A two-tier model of the establishment of planar cell polarity. Coordinated kinocilium/basal body positioning and hair-bundle orientation is achieved through the integration of intercellular signaling (blue box) with microtubule-mediated, hair-cell intrinsic polarity machinery (green box).

G-Protein Signaling-Mediated Migration of the Kinocilium/Basal Body


Хотя механизмы позиционирования базального тельца проясняются, менее известно о том, как инициируется центробежная миграция киноцилия и базального тельца, поскольку одни и те же генетические мутации не устраняют существенно миграции киноцилия. Однако, обработка эксплантов улитки коклюшным токсином, который ингибирует передачу сигналов Gα, частично нарушает миграцию киноцилия.[32] Небольшая фракция обработанных HCs образует циркулярные пучки волосков с центрально расположенным киноцилием. Очевидно, что добавление к Gαi, других G белков используется для миграции киноцилия и базального тельца.

Coordination of Hair-Bundle Orientation by Intercellular Interactions


Поскольку HCs отделены др. от др. вставленными SCs, то униформная ориентация пучков волосков вдоль медиально-латеральной оси улитки д. использовать межклеточные взаимодействия между HCs и SCs. В последнее время идентифицированы три сигнальных пути, участвующие в PCP ориентации в OC.

The Wnt/PCP Pathway


Первым открытым у дрозофилы был эволюционно законсервированный основной PCP путь, регулирующий поведение поляризованных клеток во время тканевого морфогенеза, включая движения конвергентного удлинения во время удлинения оси и закрытия нервной трубки. Стержневые компоненты PCP включают трансмембранные белки Frizzled (Fzd), Van Gogh (Vangl) и Flamingo/Celsr, а также цитоплазматические белки Disheveled (Dvl1-3), Prickle и Diego/Ankrd6. Во внутреннем ухе млекопитающих стержневые PCP белкиs FZD3/6, VANGL1/2, DVL2/3, and Ankrd6 обнаруживают асимметричное расположение в мембране в OC, а нарушения PCP пути вызывают характерное нарушение ориентации пучков волосков и укорочение канала улитки.[35, 36] Передача сигналов Wnt/PCP обеспечивает ориентацию пучков волосков с помощью пространственно скоординированных асимметричных кортикальных доменов передачи сигналов Rac-PAK и регулирует E-cadherin-обеспечиваемую межклеточную адгезию.[26, 37] В дополнение к HC PCP, Vangl2, как было установлено, регулирует позицию и форму фалангиальных отростков Deiters' клеток (see Figure 2(a)) во время постнатального развития.[38]
Идентифицирован ряд генов в качестве модуляторов главного PCP пути. Они включают рецепторные тирозин Ryk и Ror1/2, белок апикально-базальной полярности Scribbled, COPII оболочечный белок Sec24b и E3 убиквитин лигазы Smurf1/2.[39, 40] Отметим, хотя большинство мутантов, связанных с ресничками, не затрагивают асимметричной локализации стержневых PCP белков, белки ресничек BBS8 и IFT20, как было установлено, взаимодействуют со стрежневым PCP белком VANGL2 и регулируют его локализацию, подтверждая возможную не связанную с ресничками функцию в целенаправленной доставке VANGL2.[17]

The PTK7/SFK Pathway


Ген Protein tyrosine kinase 7 (Ptk7), который кодирует консервативную receptor-tyrosine pseudokinase, был идентифицирован с помощью отлавливания генов в качестве нового регулятора PCP у позвоночных.[41] Поскольку Ptk7 необходим для многих из одних и тех же онтогенетических процессов, контролируемых с помощью Wnt/PCP пути, включая конвергентное удлинение, закрытие нервной трубки и HC PCP, то генетический и молекулярный анализ показал, что PTK7 действует параллельно пути Wnt/PCP и передаче сигналов посредством Src family kinases (SFK), чтобы регулировать сократимость актомиозина и межклеточное натяжение в OC.[42, 43] Чувствительный к натяжению актин-связывающий белок vinculin преимущественно поставляется на медиальные края HCs зависимым от PTK7 способом, предоставляя доказательства неоднородности (anisotropic) натяжения в OC. Эти данные привели к созданию модели взаимодействий в виде упорной конкурентной борьбы ('tug-of-war') между HCs и SCs, покоящейся на MT-обеспечиваемом аппарате позиционирования базального тельца, чтобы ориентировать PCP; повышение напряжения на медиальные границы HCs может локально ингибировать отлавливание кортикальных MT, способствуя тем самым отлавливанию MT на латеральном полюсе.

Nectin-Mediated Cell-Cell Adhesions


Nectins являются Ca2+-независимыми IG-подобными молекулами клеточной адгезии, осуществляющими активацию Rac и Cdc42.[44] Nectin-1 и -3 дифференциально экспрессируются в HCs и SCs, соотв., и их гетеротипические взаимодействия необходимы для клеточной мозаики в OC. У дефицитных по Nectin-3 мышей некоторые HCs аномально контактируют др. с др., что сопровождается дефектами морфологии пучков волосков и положения киноцилия, сходные с фенотипическими отклонениями у Rac1 cKO.[45] Эти результаты подтверждают, что nectin-обеспечиваемая адгезия HC-SC может активировать Rac, чтобы контролировать HC PCP. Напротив, и активность Rac и локализация nectin-1/nectin-3 редуцированы у Lis1 cKO OC, подтверждая, что Rac может регулировать локализацию нектина.[31]

A Two-Tier Signaling Hierarchy Mediates HC PCP in the OC


Как тканевой уровень передачи сигналов PCP интегрируется с присущим клеткам MT-опосредованным аппаратом (machinery)? Накапливаются доказательства, строго подтверждающие двухярусную иерархию регуляции планарной полярности в HC (Figure 6). PCP индивидуальных HCs, включая поляризованное расположение базального тельца и V-образную форму пучка волосков, устанавливается с помощью присущего клеткам исполнительного аппарата из LGN/Gα/dynein, Rac-PAK и Cdc42-aPKC модулей. Эти присущие клеткам пути способны оперировать в отсутствие сигналов тканевой полярности, чтобы управлять планарной поляризацией индивидуальных клеток, т.к. стержневые PCP гены или Ptk7 не нужны для характеристик планарной полярности индивидуальных HCs. Также не поляризуется распределение внутренне присущих белков полярности, нарушаемое у мутантов стержневого PCP.[26, 32, 33] Жесткость процесса внутренне присущей поляризации, скорее всего, гарантируется с помощью взаимодействий обратной связи среди упомянутых выше модулей. Тканевой уровень передачи сигналов PCP накладывает внешние или тканевые сигналы полярности в HCs посредством межклеточных взаимодействий, которые, в свою очередь, интерпретируются с помощью присущего клеткам исполнительного аппарата (effector machinery). Хотя точный механизм этого взаимного влияния неизвестен, Rho семейства GTPases, такие как Rac и белки кортикальной полярности, такие как Par3, прекрасно расположены, чтобы интегрировать информацию о тканевой полярности. Интересно, что имеются доказательства того, что тканевого уровня и присущий клеткам передачи сигналов PCP могут иметь не перекрывающиеся пространственные и временные домены. В частности, кортикальные LGN/Gαi и aPKC занимают более апикальный домен, чем Vangl2 вдоль апикально-базальной оси в HCs в P0 OC, указывая на пространственную сегрегацию двух систем на этой стадии.[32] Более того, присущий клеткам путь необходим для поддержания планарной полярности HC, на что указывает постнатальная делеция Lis1.[31] Эта активность, скорее всего, вносит вклад в постнатальное преобразование HC PCP, которое происходит независимо от стрежневого PCP пути.[38]

Transient Stereociliary Links That Regulate Hair-Bundle Cohesion


Transient Lateral Links


Образование пучков волосков совпадает со становлением PCP, во время которого стереоцилии и киноцилий внутри формирующегося пучка волосков должны двигаться вместе как связанная единица благодаря связкам стереоцилий, чтобы возникла нормальная PCP. Мыши, моделирующие Usher syndrome (USH, see Box2) послужили инструментом для идентификации молекулярного состава связок стереоцилий. В дополнение к киноциллярным связкам, стереоцилии в формирующемся пучке волосков взаимосвязаны посредством кончиковых связок и временных боковых связок (Figure 2(b)). Все три типа связок формируются с помощью гетерофильных адгезивных комплексов, состоящих из гомодимеров Usher syndrome type 1 (USH1) белков PCDH15 и cadherin-23 (CDH23) (Table 1). Нулевые мутации в Cdh23 и Pcdh15, а также в треж др. USH1 генах, вызывают фрагментацию и неправильную ориентацию формирующихся пучков волосков, что сопровождается аномальным расположением киноцилия, указывая на роль USH1 генов в организации коноциллярных и между стереоцилиями связок, которые поддерживают сцепление пучков волосков и и связки между стереоцилиями, которые поддерживают сцепление пучков волосков во время становления и поддержания PCP.[46]

BOX 2. USHER SYNDROME Usher syndrome is the leading genetic cause of combined hearing and vision loss in humans.[22] It is categorized into three types, based on the degree of hearing loss, vestibular deficits, and vision loss. USH1 is characterized by severe-to-profound hearing loss, vestibular deficits, and early onset vision loss. Usher syndrome type 2 (USH2) is characterized by mild-to-severe hearing loss and normal vestibular function. USH3 manifests with progressive hearing loss and variable onset of vision loss. USH2 is most common, followed by USH1 and USH3. To date, six genes have been implicated in USH1, which encode PCDH15, CDH23, the scaffold proteins harmonin and SANS, the actin motor protein myosin VIIa, and the calcium and integrin-binding protein CIB2. The three USH2 genes encode the transmembrane protein usherin, the adhesion G-protein coupled receptor GPR98 (also known as VLGR1), and PDZ-domain containing scaffold protein whirlin, respectively. One USH2 modifier encodes the scaffold protein PDZD7. The USH3 genes are clarin-1 (CLRN1) and histidyl-tRNA synthetase (HARS). Finally, CEP250, which encodes a centrosome-associated protein, is mutated in atypical USH.


Table 1. Summary of Stereociliary Link Types in Mouse and Their Associated Human Deafness Loci

Более того, мыши, дефицитные по Usher syndrome type 3 (USH3) гену Clrn1 имеют фрагментированные пучки волосков с циркулярными миникластерами стереоцилий и прогрессирующей дегенерацией OHC и SC, приводящей к раннему началу потери слуха. Clrn1 кодирует four трансмембранный белок, который располагается на пучках волосков и может регулировать сцепление волосков в пучках вместе с USH1 генами.[22]
Nherf1, PDZ доменовый белок, взаимодействующий с ERM (Ezrin, Radixin, and Moesin) с семейством линкеров между цитоскелетом и плазматической мембраной, также участвует в в контроле формы и сцепления волосков пучков. Nherf1 локализуется в стереоцилиях и взаимодействует с CDH23. Nherf1-дефицитные мыши обнаруживают дизморфию пучков волосков OHC с неправильно расположенным киноцилием в базальном и срединном регионе улитки, приводя в результате к дефициту слуха.[47]

Ankle Links


Щиколоточные (Ankle) связки расположены выше базальных конусов стереоцилий (Figure 2(b)). Они присутствуют только во время первой постнатальной недели в HCs улитки млекопитающих, но сохраняются в зрелых вестибулярных HCs (Table 1). Функциональная важность щиколоточных связок продемонстрирована на мышиных моделях для USH2 (see Box 2). USH2 белки, usherin и GPR98/VLGR1, образуют щиколоточные связки путем гетеротипического взаимодействия. PDZ-домен содержащие белки whirlin и PDZD7 взаимодействуют с usherin и GPR98 и совместно формируют взаимозависимый комплекс щиколоточных связок, который может также содержать трансмембранный белок vezatin и adenylyl cyclase AC6. Важно, что разрушение USH2 белков или PDZD7ведет к дезорганизации пучков волосков и врожденной глухоте, показывая. что щиколоточные связки играют важную роль в созревании и сцеплении волосков в пучки.[22]

Interstereociliary Links in the Adult Hair Bundle


The Tip Links and the MET Machinery


Помимо киноциллярных и временных боковых связок, USH1 белки обеспечивают образование кончиковых связок, которые сохраняются в пучках волосков взрослых и участвуют в механическом открывании ворот MET каналов, расположенных на их низшей точке инсерции, а именно на кончиках самых коротких стереоцилий.[10] Гомодимеры из PCDH15, особенно из CD2 сплайс-изоформы, и гомодимеры из CDH23 образуют нижнюю и верхнюю части кончиковых связок, соотв.[48] Трансмиссионная ЭМ подтверждает, что кончиковые связки прикреплены к электрон-плотным участкам, расположенным под мембраной. Белки USH1 harmonin, SANS, myosin VIIa и CIB2 расположены в этих участках и могут играть роль в прикреплении кончиковых связок. Потеря USH1 белков приводит к нарушениям механотрансдукции и потере слуха, демонстрируя важность кончиковых связок для MET.[48]
Было предположено, что канал MET непосредственно связан с кончиковой связкой и, скорее всего, формирует комплекс с PCDH15. Хотя молекулярный состав каналов MET всё ещё неизвестен, недавние успехи идентифицировали несколько трансмембранных белков, критически необходимых для механотрансдукции в HC и действующих в тесной ассоциации с MET каналами.[10] В частности, многопроходные трансмембранные белки, кодируемые генами глухоты TMC1, TMC2,TMIE и TMHS/LHFPL5, все они взаимодействуют с PCDH15 и возможно с субъединицами канала MET. TMC1/2, как полагают, является пору формирующей субъединицей канала MET, хотя эта модель всё ещё спорна и ждет подтверждения. TMIE и TMHS/LHFPL5 могут скреплять MET канал с кончиковыми связками. Если TMIE безразличен для сборки кончиковых связок, то TMHS/LHFPL5 обладают предположительно многими функциями, включая обеспечение сборки кончиковых связок, доставки на стереоцилии PCDH15 и TMC1, и служат в качестве аллостерического регулятора MET канала.[49, 50]
В то время как кончиковые связки безусловно участвуют в нормальной механотрансдукции в HC, имеются некоторые доказательства, что HCs м. всё ещё трансдуцировать механические стимулы и в их отсутствие, для этого могут быть использованы др. типы внеклеточных связок. Напр., у myosin-XVa-дефицитных мышей, хотя IHCs имеют почки волосков с аномально коротким стереоцилиями, у которых отсутствуют кончиковые связки, они всё ещё могут генерировать токи MET в ответ на отклонения с помощью жесткого зонда.[51] Более того, аномальные трансдуцируемые токи с обратной механочувствительностью всё ещё могут вызываться в отсутствии кончиковых связок или предполагаемых субъединиц канала MET, подтверждая, что эти условия могут изменять нормальные свойства каналов MET или демаскировать др. каналы, которые также вносят вклад в механочувствительность.[10]

Horizontal Top Connectors


Горизонтальные верхушечные соединители располагаются вблизи кончиков стереоцилий и поддерживают сцепление волосков пучков зрелых OHC. Stereocilin, кодируемый геном, вызывающим глухоту DFNB16, располагается на и необходим для формирования горизонтальных верхушечных коннекторов. Stereocilin также обеспечивает сцепление между самыми высокими стереоцилиями и текториальной мембраной. Интересно, что т.к. развитие пучков волосков и их функции первоначально нормальны, включая образование кончиковых связок, дефицитные по stereocilin мыши обнаруживают прогрессирующую потерю слуха, сопровождаемую прогрессирующей потерей кончиковых связок и разъединением стереоцилий. Т.о., стереоцилии важны для сцепления и жесткости пучков волосков во взрослых OHC и для стабильности кончиковых связок.[52]

Hair-Bundle Maintenance


Stereocilia Base-Apical Plasma Membrane Attachment


Подразделение мембраны стереоцилий на самостоятельные домены вдоль их длины, каждый содержит специфические липиды и белки.[53] Сиаловую кислоту содержащие glycosphingolipids, также наз. ганглиозидами, концентрируются в конусовидном домене основания стереоцилий. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, с др. стороны, отсутствует в базальной части конусовидного региона, но располагается в кончике и стержне стереоцилии.
Белковый комплекс, расположенный в основании стереоцилий и в апикальной мембране HC, играет критическую роль в закреплении актиновых филамент в плазматической мембране. Он включает PTPRQ, рецептор-подобную inositol lipid phosphatase, члена ERM семейства radixin, CLIC5, цитоскелетный линкер и новый белок taperin. Локализация этого комплекса в конусовидном регионе обеспечивается с помощью на направленного на заостренный конец мотора myosin VI, который действует как транспортер и линкер между цитоскелетом и плазматической мембраной.[54] Более того, ганглиозид GM3 необходим для компартментализации PTPRQ и myosin VI в основании стереоцилий.[55] Мутации, затрагивающие любой из этих белков, или GM3 synthase ST3GAL5, вызывает врожденную глухоту у людей и/или мышей. Общим фенотипическим отклонением для этих мутантных мышей является дегенерация стереоцилий в OHCs и слияние стереоцилий в IHC, начинающиеся со второй постнатальной недели и приводящий к прогрессивной потере HC.[55] Сходные фенотипы наблюдались у мышей с HC-специфической делецией Cdc42 при использовании Atoh1-Cre драйвера или дефицита Nherf1 паралога Nherf2.[28, 47] Итак, эти наблюдения подтверждают, что мембранные и цитоскелетные белки в конусовидном регионе участвуют в активном процессе, регулируемом с помощью Cdc42, который стабилизирует соединения между плазматической мембраной и актиновым цитоскелетом в основании стереоцилий.
PTPRQ, как полагают, также участвует в формировании стержневых коннекторов (shaft connectors), функционально сходных с временными боковыми связками. Интересно, что miR-96, первая microRNA, сцепленная с наследственной глухотой, обеспечивает постнатальное морфологическое и функциональное созревание HCs улитки, по крайней мере, частично посредством усиления экспрессии Ptprq.[56]

Regulation of Hair-Bundle Morphogenesis by GTPase Signaling


Появляются доказательства, указывающие на дополнительные пути передачи сигналов GTPaseв морфогенезе пучков волосков. Члены семейства белков engulfment and cell motility (ELMO), ELMOD1 и ELMOD3, участвуют в возникновении наследственной глухоты у мышей и людей.[57] ELMOD3 динамически экспрессируется в HCs и концентрируется в стереоцилиях, киноцилии и апикальной голой зоне. Мутации Elmod1 вызывают дегенерацию стереоцилий в OHCs и слияние стереоцилий в IHC во время постнатального развития, приводя к глухоте и нарушению баланса. ELMOD1-3 обладает активностью GTPase-activating protein (GAP) против ARL2, из Arf семейства малых GTPase, регулирующей динамику MT. Т.о., ELMOD белки могут регулировать целостность пучков волосков путем модулирования передачи сигналов малых GTPase в стереоцилиях и киноцилии, хотя соответствующие малые GTPases в HCs не установлены.
TBC1D24, др. предполагаемый регулятор передачи сигналов GTPase, участвующий в возникновении синдромальной глухоты DOORS (onychodystrophy, osteodystrophy, mental retardation, and seizures) и не синдромальной DFNB86.[58] Более того, миссенс мутации в TBC1D24 сцеплены с аутосомно доминантной потерей слуха.[59] TBC1D24 взаимодействует с и может регулировать ARF6, малую GTPase, важную для мембранного трафика. TBC1D24 располагается на стереоцилиях во время развития и также экспрессируется в нейронах спирального ганглия. Следовательно, TBC1D24 может выполнять множественные функции в улитке, которые нуждаются в дальнейшем исследовании.
Недавно мутации FAM65B, кодирующего цитоплазматический белок, взаимодействующего и ингибирующего RhoA,[60] удалось связать с наследственной формой глухоты у людей. FAM65B находится на стереоцилиях и апикальной мембране HC. Нокдаун fam65b у рыбок данио приводит к пониженному количеству HCs и потере слуха. Однако, его точная роль в морфогенезе пучков волосков неизвестна.[61]

Regulation of Stereocilia Length and Stability


Многочисленные регуляторы полимеризации и образования пучков актина участвуют в возникновении глухоты, указывая, что длина актиновых филамент и их оборот тонко контролируются, чтобы гарантировать нормальную функцию пучков волосков. Стереоцилии содержат β-actin и γ-actin, а отсутствие любого приводит к дефектами стереоцилий и прогрессивной потере глухоты.[62]
Получение изображений вживую и количественный анализ показали, что оборот актина стереоцилий очень медленный, за исключением кончиков стереоцилий и рада коротких стереоцилий, имеющих более высокую скорость оборота.[12, 63] Несколько белков регулируют актины, среди них моторы, транспортирующие миозин в кончики стереоцилий и регулирующие длину стереоцилий во время развития. В частности, espin 1, изоформа белка, образующего пучки актина, espin, транспортируется с помощью myosin IIIa, чтобы обеспечивать удлинение стереоцилий. [64] Др. верхушечный комплекс, необходимый для удлинения стереоцилий, состоит из myosin XVa и его грузов, каркасного белка whirlin и actin capping/bundling protein EPS8.[65] Отсутствие любого из компонентов этого комплекса приводит к укорочению стереоцилий и глухоте. В то время, как EPS8 необходим для удлинения стереоцилий во время развития, его паралог, EPS8L2, участвует в прогрессирующей потере слуха и регулируют длину и поддержание стереоцилий в улитке взрослых.[66] Кончиковые связки могут оказывать положительный эффект на длину стереоцилий в коротком и среднем рядах, поскольку их потеря во время развития вызывает укорочение рядов стереоцилий. С др. стороны длина стереоцилий взрелых пучках волосков негативно регулируется с помощью myosin VIIa и twinfilin, актиновые мономеры связывающего и доставляющего на колючие концы белка. Показано, что myosin VIIa транспортирует twinfilin-2 преимущественно на кончики ряда самых коротких стереоцилий, где он подавляет полимеризацию актина.[67]
Кроме того, длина и стабильность стереоцилий регулируется с помощью ряда белков, образующих пучки и связывающих их поперек, расположенных по всей длине стереоцилий. Espin, участвует в возникновении наследственной глухоты, это главный белок образующий пучки актина, необходимый для роста и поддержания стереоцилий во время постнатального развития.[68] TRIOBP, образующий пучки актина белок, располагается на корешках стереоцилий, он необходим для образования корешка и жесткости стереоцилий, которые важны для механотрансдукции.[69] Др. поперечно связывающие и образующие пучки актина белки, играющие роль в поддержании стереоцилий, включают fascin-2, plastin 1 и Xin-actin-binding-repeat containing protein 2 (XIRP2). В отсутствие этих поперечно связывающих элементов стереоцилии часто обнаруживают прогрессирующее укорочение и дегенерацию, приводящие к потере слуха.[70-72]

Stereocilia Repair/Regeneration Following Noise-Induced Damage


Воздействие на OC повреждающих громких шумов приводит к noise-induced hearing loss (NIHL). Деструкция волосковых клеток улитки и повреждения пучков волосков являются главными повреждающими факторами при NIHL. В зависимости от уровня шума и продолжительности воздействия, NIHL может быть временной и может репарироваться. Однако, потеря становится постоянной, если поврежденные HCs или нейроны отмирают, на сегодня нет фармакологического лечения.
Ощущения натяжения кончиковых связок в ответ на звуки, следовательно, и вызывает склонность к нарушениям, вызываемым шумами. Разрывы кончиковых связок обычно устраняются в течение 24 ч. Недавнее исследование установило, что регенерация кончиковых связок протекает в два этапа, которые воспроизводят их образование во время развития.[73] Первоначально, PCDH15 формирует оба конца новой кончиковой связки с последующим замещением на CDH23 белка PCDH15 на верхнем конце, восстанавливая тем самым MET.
Др. ранним признаком акустического повреждения пучков волосков является появление разрывов в актиновой сердцевине стереоцилий. Интересно, что γ-actin, но не β-actin, оказывается в точках разрыва и обеспечивает репарацию актиновых пучков. γ-actin необходим также для рутинного поддержания и репарации стереоцилий, вызываемых не шумами. [74]
В OC млекопитающих, поврежденные HCs могут выживать в течение недели после акустической травмы, при этом наблюдается ограниченная репарация пучков волосков.[75] Т.о., стимуляция заживления волосковых клеток посредством генетических и химических вмешательств может устанавливать баланс между гибелью волосковых клеток и функциональным восстановлением, облегчая тем самым постоянную потерю слуха. bHLH транскрипционный фактор ATOH1, как было установлено, способствует репарации пучков волосков в улитке взрослых с акустическими повреждениями.[75] Важно, что трансфекция Atoh1 перед существенной гибелью волосковых клеток, значительно стимулирует репарацию пучков волосков и восстановление порога слышимости. Выяснение механизмов ATOH1-обеспечиваемой репарации пучков волосков, которые могут отличаться от функции ATOH1 в регенерации волосковых клеток, позволит идентифицировать новые терапевтические мишени для репарации пучков волосков.

DEVELOPMENT OF TONOTOPY IN THE OC


Удивительным свойством слуховой системы млекопитающих является топологическая представленность разных частотных компонентов звуковых сигналов или tonotopy. Тонотопическая организация начинается в улитке и поддерживается как в периферических, так и центральных слуховых путях. Тонотопическая организация OC такова, что наивысшие частоты звуков стимулируют HCs в основании улитки, тогда как звуки низких частот стимулируют верхушку, подобно расположению клавиш пианино. Вдоль тонотопической или продольной оси улитки HCs обнаруживают систематические морфологические и физиологические отличия, делающие возможным точную тонкую настройку к частотам. Это и длина стереоцилий и их количества на пучок, уровни экспрессии и изоформ разных ионных каналов, а также проводимости MET каналов (Figure 7). Интересно, что этот тонотопический градиент проводимости, как недавно было установлено, зависит от TMHS/LHFPL5 и TMC1, обеспечивающих тонотопическую изменчивость состава MET каналов.[50] Механизмы, с помощью которых тонотопические градиенты устанавливаются и поддерживаются, изучены плохо и не описаны врожденные болезни, связанные с дефектами тонотопии. Некоторые исследования слухового органа кур (basilar papilla или BP), где также развита тонотопия, предоставили некоторые указания на лежащие в основе молекулярные пути. Напр., Delta/Notch-like EGF-related receptor (DNER), новый Notch лиганд, экспрессируется в HCs в виде проксимо-дистально увеличивающегося градиента, а его пертурбации вызывают дефекты морфологии и ориентации пучков волосков.[76] Параллельные исследования показали, что проксимо-дистально увеличивающийся градиент Bmp7 взаимно усиливается градиентом передачи сигналов ретиноевой кислоты (RA) для обеспечения дистальных характеристик.[77, 78] Передача сигналов , Sonic Hedgehog (Shh), как было установлено, устанавливает позиционные качественные характеристики в BP кут и улитке мышей, хотя посредством не законсервированных нижестоящих мишеней. Поскольку передача сигналов Shh усиливает экспрессию Bmp7 в BP, тонотопический градиент Bmp7не обнаруживается, а пути Bmp подавляются с помощью Shh в развивающейся улитке мыши.[79] Итак. подтверждается, что множественные сигнальные градиенты кооперируются в раннем развитии, чтобы установить первоначальные региональные характеристики, которые служат прообразом тонотопической организации зрелой улитки.

Figure 7. Schematic representation of tonotopic gradients along the basal-apical axis of the mammalian cochlea. Graded differences in morphological and molecular features underlie regional differences in the mechanical and electrical properties of hair cells.

NEW APPROACHES FOR STUDYING HC DEVELOPMENT AND FUNCTION


Технологии секвенирования следующего поколения делают возможной быструю идентификацию новых генов глухоты у мышей и человека. Появилось несколько технологий с многообещающими перспективами в отношении функционального анализа и вычленения механизмов генов глухоты. Напр., недавнее исследование с использованием профилирования экспрессии генов в одиночных клетках сделали возможной тонкую реконструкцию пространственной и временной динамики путей передачи сигналов в развивающихся нейробластах зачатка внутреннего уха.[80] Использование транскриптомного анализа на одиночных клетках будут особенно полезны для профилирования редких или гетерогенных популяций клеток внутреннего уха. Комплементарным подходом служит разработка immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) клеток, которые могут само-обновляться и сохраняют свою способность дифференцироваться в функциональные HCs и нефроны.[81] Эти клетки являются удобным инструментом in vitro для идентификации факторов дифференцировки, необходимых для специфических клонов клеток внутреннего уха, а также для высоко-производительного скрининга агентов, способствующих репарации и регенерации HC.
Для анализа in vivo функции слуховых генов, интересен ткане-специфический нокдаун генов посредством прямых инъекций siRNAs во внетреннее ухо.[82, 83] Однако, у этого подхода имеются затруднения. Трансформативные новые технологии для целенаправленного инжинеринга генома клеток прокариот и эмбрионов, связаны с бактериальной CRISPR/Cas системой,[84] обладающей огромным потенциалом для изучения нарушений слуха и баланса у человека. Эта система использует RNA-guided эндонуклеазную активность Cas9, чтобы вносить сайт-специфические разрывы двойной нити, которые могут быть репарированы с помощью соединения негомологичных концов или гомологом управляемой репарации. Эта технология может позволить быструю генерацию целенаправленных мутаций в генах глухоты у модельных животных, мышей, рыбок данио и морских свинок. у которых не разработаны трансгенные методы. В самом деле технология CRISPR успешно использована для выяснения функции белка пучков волосков XIRP2 для поддержания стереоцилий и слуха у мышей.[72] Недавно прямая модификация HCs млекопитающих была достигнута с помощью in vivo совместной доставки Cas9 и guide РНК, подтверждая удивительный терапевтический потенциал этого подхода для потери слуха у людей. [85]

CONCLUSION


To transduce sound signals faithfully, HCs develop a suite of precise features, including the planar polarized hair bundle that harbors the MET channel. Genetic analysis in humans and model organisms has greatly advanced our understanding of this complex developmental process. In particular, intercellular PCP signaling impinges on a MT-mediated cell-intrinsic machinery to establish the polarized shape and orientation of the hair bundle. Moreover, USH proteins are required for different types of stereociliary links critical for hair-bundle cohesion and HC mechanotransduciton. Several subunits of the MET channel have been identified and shown to interact with the tip-link component PCDH15. Finally, BMP, RA, and SHH gradients in the developing OC regulate aspects of tonotopy.
In the future, a multidisciplinary approach combining genetics with modern molecular and cell biology tools will continue to shed light on unresolved questions in hair-bundle morphogenesis, including the nature and origin of tissue polarity signals, integration of PCP signaling and staircase formation, the molecular composition of the MET channel, and the development and maintenance of tonotopy.