Посещений:
КРАНИАЛЬНЫЙ НЕРВНЫЙ ГРЕБЕНЬ



Дифференциальная экспрессия генов в разных миграторных потоках

Transcriptome profiling reveals expression signatures of cranial neural crest cells arising from different axial levels
Rachael Lumb, Sam Buckberry, Genevieve Secker, David Lawrence and Quenten Schwarz
BMC Developmental BiologyBMC series – open, inclusive and trusted2017 V.17:5



Isolation of GFP-positive NCCs. a Wholemount E9.5 Wnt1Cre; Z/EG embryos immunolabelled for GFP identifies NCCs in the r1-2 (r2) and r4 migratory streams, and additional Wnt1 expression domains within the mid brain (mb). b Sox10 in situ hybridisation of wild type E9.5 embryos. c-f Schematic of work flow for isolation of GFP-positive NCCs from Wnt1Cre; Z/EG embryos. c Wnt1Cre; Z/EG embryos were dissected into r1-r2, r4 and trunk regions and dissociated in tryple express (d). e Trunk NCCs were used to set GFP gates for FACS. f GFP-positive NCCs were collected for each population and RNA extracted (g). h qRT-PCR was performed for Sox10 to confirm NCC isolation. ov, otic vesicle; e, eye. Scale Bars=500um

Клетки нервного гребня (NCCs) являются клетками мультипотентной популяции, которая возникает в дорсальных регионах нервной трубки во время ранних стадий эмбрионального развития [1]. Благодаря их чрезвычайной важности для широкого круга тканей, дефицит NCCs лежит в основе сильно распространенной группы врожденных нарушений, наз. нейрокристапатиями, включающими черепно-лицевые аномалии и дефекты тракта оттока сердца [2].
Разные популяции NCCs определяются их позицией, которую они занимают вдоль переднезадней оси. Краниальные NCCs возникают кпереди от сомита 5 и дают кости, хрящи и сухожилия головы, а также сенсорные и симпатические нейроны GYC/ Вагусные NCCs возникают между сомитами 1-7 и дают нейроны и глию энтерической нервной системы, а кардиальные NCCs, которые формируют гладкомышечную выстилку сосудов артерий фарингеальных дуг и также вносят вклад в аортико-пульмональную перегородку. Туловищные NCCs возникают позади 4-го сомита и дают нейроны и глию сенсорной и симпатической нервной системы, Шванновские клетки и меланоциты [3].
Внутри этих широко определяемых осевых регионов NCCs могут подразделяться далее на субпопуляции, исходя из их миграторного пути и онтогенетической судьбы. Напр., краниальные NCCs, занимающие регион между mid-diencephalon и 5-м сомитом, сегрегируют на самостоятельные миграторные потоки, которые отражают временную сегментацию нервной трубки на клонально ограниченные единицы, такие как ромбомеры диэнцефалона, среднего мозга и заднего мозга (r) [4, 5]. Краниальные NCCs эмигрируют от каждого осевого уровня, следуя самостоятельными путями, это обеспечивает сегрегацию на самостоятельные миграторные потоки, которые поддерживаются, т.к. эти клетки управляют краниальной мезенхимой. Т.о., NCCs возникают кпереди от r3, включая те, что из диэнцефалона, среднего мозга и r1-r2, мигрируют в фронто-назальный отросток, верхнюю челюсть и первую фарингеальную дугу (PA1), тогда как происходящие из r4 NCCs мигрируют в PA2. NCCs занимают эти регионы, давая также специфические структуры, такие как Меккелев хрящ, наковальня, молоточек и тройничный ганглий (Vth) в PA1, и кеосточки среднего уха и стремечко, подъязычную кость и facioacoustic ганглии (VIIth/VIIIth) в PA2 [6].
Миграция краниальных NCCs с помощью этих самостоятельных потоков находится под контролем клеточных внутренне присущих и средовых сигналов, включающих несколько пар лиганд-рецептор типа Eph/Ephrin [7, 8, 9], ERBB/Neuregulin [10], SDF/CXCR [11] и VEGFA/Semaphorin/Neuropilin сигнальных путей [12, 13, 14, 15, 16, 17]. Neuropilins (NRP1 и NRP2) являются трансмембранными ко-рецепторами для наведения молекул класса 3 semaphorin (SEMA3) семейства и heparin связывающих изоформ vascular endothelial growth factor VEGFA [18]. Во время ранних стадий развития краниальных NCC экспрессия NRP1 ограничивается NCCs внутри миграторного потока от r4, тогда как NRP2 ограничивается NCCs внутри миграторного потока от r1-r2 [16]. Используя индуцибельную Cre/LoxP систему отслеживания клонов, экспрессирующих Nrp2, краниальные NCCs, как было установлено, дают также происходящие из r1-r2 структуры, такие как тройничные ганглии (Vth cranial ganglia) [19]. Мыши, нокаутные по Nrp1 и Nrp2 продемонстрировали далее значительную потребность в этих рецепторах, способствующих миграции NCCs в разных потоках. Т.о., происходящие из r4 NCCs мигрируют аномально у Nrp1 нокаутных мышей, а происходящие из r1-r2 NCCs мигрируют аномально у Nrp2 нокаутных мышей [12, 16]. У кур, Nrp1 также экспрессируется NCCs миграторного потока из r4 и контролирует миграцию в направлении поверхностной эктодермы, секретирующей VEGFA [20]. Хотя Neuropilins рекрутируют передачу сигналов ко-рецепторов, таких как A-type plexins (PLXNA1-4) и VEGF рецепторы (VEGFR1-R2) чтобы контролировать наведение аксонов [21], рост сосудов [22] и миграцию двигательных нейронов [23], передача сигналов ко-рецепторов, рекрутируемых в NCCs, остается неизвестной.
Позиционные характеристики NCCs вдоль переднезадней оси, как полагают, приобретаются ещё до миграции и находятся под контролем гомеодоменовых транскрипционных фаткоров, которые способствуют сегментации и формированию паттерна ромбомеров, из которых возникают NCCs [4, 24, 25]. Т.о., уникальная комбинация Homeobox (HOX) генов вдоль переднезадней оси, скорее всего, имеет в основе молекулярные отличия в разным миграторных потоках. В самом деле, самостоятельные профили экспрессии Hox были также идентифицированы в NCCs, возникающих на разных уровнях оси. Однако, поскольку экспрессия Hox в NCCs находится под контролем разных энхансеров, то генетический Hox код в NCCs отличается от такового в исходной ромбомерной ткани [5, 24, 25]. Т.к. различающиеся профили экспрессии Hox генов и Neuropilins демонстрируют, что NCCs из разных миграторных потоков различаются молекулярно, однако, степень этих различий регуляторных сетей, контролирующих их уникальные качественные особенности, остается неизвестной.
В целом анализ транскриптома выявил более 120 транскриптов, дифференциально экспрессирующихся между NCCs, возникающими впереди r3 и r4 миграторных потоков. 8 из этих генов, дифференциально экспрессирующихся между этими популяциями, были оценены с помощью RT-PCR , из них два далее были исследованы с помощью гибридизации in situ. Исследовали также экспрессию Neuropilins (Nrp1 и Nrp2) и их корецепторов и показали, что A-type Plexins экспрессируются дифференциально в разных потоках краниальных NCC. Наш анализ RNA-seq, RT-PCR и гибридизации in situ выявил множество ранее непонятных транскриптов, обнаруживающих дифференциальную экспрессию между этими самостоятельными потоками клеток. Мы также исследовали экспрессию потенциальных Neuropilin ко-рецепторов и установили, что A-type Plexins дифференциально экспрессируются между этими краниальными потоками NCC. Наш анализ выявил большое количество генов, дифференциально экспрессирующихся между краниальными NCCs, возникшими на разных уровнях оси.
Итак, выявлено большое количество генов, дифференциально регулируемых между краниальными NCCs, возникающими на разных уровнях. Эти данные предоставляют всеобъемлющее описание генетического ландшафта во время расхождения самостоятельных потоков краниальных NCC и дают новую информацию о регуляторных сетях, контролирующих образование специфических скелетных элементов и механизмы, способствующие миграции вдоль разных путей.