Изменение экспрессии miRNAs в чувствительных к инсулину тканях пациентов с T2D подтверждает важную роль этих малых молекул РНК в осложнениях, связанных с состоянием диабета [1, 3, 31]. Более того, растут доказательства, что miRNAs присутствуют также в стабильной форме в некоторых жидкостях тела, включая кровь, указывая на то, что внеклеточные miRNAs могут служить новыми биологическими маркерами метаболических нарушений и/или ассоциированных с ними осложнений [1, 3, 31]. Кстати, ряд исследований выявил измененный профиль циркулирующих miRNAs при разных метаболических заболеваниях, таких как T2D[1, 3, 31]. Экспрессия miR-155 в PBMCs T2D пациентов снижена [11], это согласуется с нашими находками, что пониженные уровни miR-155 обнаруживаются в сыворотке T2D пациентов. Более того, циркулирующие в крови miR-155 были снижены в плазме пациентов с болезнью коронарных артерий плюс диабет [32], тогда как экспрессия miR-155 была редуцирована в диабетических почках, сердце, аорте, PBMCs и седалищном нерве диабетических крыс [33]. причинные взаимоотношения между снижением miR-155 и диабетом или диабетическими осложнениями, остаются неизвестны.

Более того, трудно сказать с уверенностью, где формируются сывороточные miRNAs, поскольку трудно сделать биопсию, чтобы понять в какой специфической ткани изменяются уровни кровяных miRNA у T2D пациентов. Хорошо известно, что живые ткани животных и человека могут высвобождать внутриклеточные miRNAs в кровообращение [1, 3, 31]. Когда опухоли человека имплантировали мышам, то специфические человеческие происходящие из опухоли miRNAs обнаруживались в плазме [34], тогда как циркулирующие в крови, происходящие из миокарда miRNAs могут быть использованы в качестве биомаркеров инфаркта [35-39]. В самом деле, циркулирующие miRNAs может дать представление об метаболическом профиле T2D пациентов, поскольку все чувствительные к инсулину ткани высвобождают упакованные miRNA в кровь [1, 3, 31]. У модельных T2DM крыс (obese high fat diet animals treated with streptozotocin), профиль miRNA был составлен из собранных в тесные кластеры молекул из тканей крыс, чувствительных к инсулину (скелетные мышцы, жировая ткань и печень, и из поджелудочной железы [40]. Кроме того, большинство изменений miRNA, выявляемых в этих тканях, используемых в пути передачи сигналов инсулина, было также выявлено в профиле miRNA крови [40]. Т.о.. мы заподозрили, что снижение экспрессии miR-155 в тканях, чувствительных к инсулину, (т.e., печени, жировой ткани и скелетных мышцах) могут вызывать снижение уровня miR-155 в крови пациентов с диабетом.

В данном исследовании глобальная избыточная экспрессия miR-155 у мышей ведет к гипогликемии, улучшению толерантности к глюкозе и усилению чувствительности к инсулину периферических тканей, тогда как мыши, лишенные miR-155 обнаруживают гипергликемию, непереносимость глюкозы и резистентность к инсулину, подтверждая целительные регуляторные роли miR-155 в гомеостазе глюкозы. Повышение чувствительности к инсулину и улучшение переносимости к глюкозе у RL-m155 может быть объяснено, по крайней мере, частично, усиленным потреблением глюкозы благодаря повышению фосфорилирования AKT, и благодаря усилению гликолиза, осуществляемого посредством усиления активности Gck и PKM2, и ослаблению PDK4. В целом наши находки впервые продемонстрировали, что miR-155 регулирует множественные аспекты метаболизма глюкозы. Важно. что наши находки полностью установили, что избыточность функции miR-155 приводит к гипогликемии и улучшению толерантности к глюкозе благодаря индукции нечувствительности к инсулину в периферических тканях, тем самым улучшается метаболизм глюкозы во всем теле.

До сегодня очень немногие miRNAs, такие как miR-130a-3p[41], miR-26a[42] и miR-155 (this study), были обнаружены, как действующие в качестве позитивных регуляторов толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину in vivo . Интересно, что наше исследование установило, что избыточная экспрессия miR-155 у мышей на обычной диете приводит к упомянутым ранее множественным метаболическим фенотипам, тогда как избыточная экспрессия miR-26aприводит к снижению уровней глюкозы в крови, к лучшей толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину и к снижению продукции глюкозы печенью у мышей на диете с высоким содержанием жира, но не на обычной диете [42], подтверждая, что miR-155 и miR-26a могут выполнять разные роли в регуляции метаболизма глюкозы.

Как показано на Fig 8 и S11 Fig, данное исследование открыло частично молекулярные механизмы, лежащие в основе функций miR-155's в упомянутых выше множественных метаболических фенотипах. miRNAs являются критическими модуляторами метаболизма глюкозы и липидов за счет негативной регуляции экспрессии множественных генов мишеней [1, 3]. Наши исследования установили, что экспрессия генов мишеней для miR-155 (т.e. C/EBPβ, HDAC4 и SOCS1) и PDK4, непосредственная мишень для C/EBPβ[43, 44], негативно регулируются с помощьюmiR-155, а нокдаун C/EBPβ снижает экспрессию PDK4 в клетках hepa1-6 . И C/EBPβ-/- мыши [16, 22] и PDK4-/- мыши [45, 46] обнаруживают гипогликемию и повышенную чувствительность к инсулину. PDK4 играет критическую роль в утилизации глюкозы путем негативной регуляции активности pyruvate dehydrogenase complex (PDC) [43, 44]. Более того, активация передачи сигналов AKT с помощью инсулина супрессирует экспрессию PDK4 [43, 44]. Эти данные показывают, что фенотипические отклонения метаболизма у мышей с потерей функции C/EBPβ [16, 22] или PDK4 [45, 46] сходны с теми. что наблюдается после избыточной экспрессии miR-155 у мышей, и противоположны тому, что мы установили у miR-155-/- мышей. Следовательно, эти наблюдения подтверждают, что miR-155 может негативно регулировать PDK4 путем негативной модуляции экспрессии C/EBPβ, приводя тем самым к метаболическим фенотипам (Fig 8 and S11 Fig).

Fig 8. A proposed model on the positive roles of miR-155 in glucose metabolism by coordinated regulation of multiple genes.

Дефекты потребления глюкозы периферическими тканями связаны с резистентностью к инсулину. Мы установили, что избыточная экспрессия miR-155 снижает экспрессию гена мишени для miR-155 HDAC4 и увеличивает уровни GLUT4 в SM у RL-m155 мышей, и увеличивает потребление глюкозы изученными клетками (включая клетки C2C12), подобно тому, как это наблюдается для HDAC4 siRNA. HDAC4 ингибирует экспрессию GLUT4, непосредственной мишени для HDAC4 [47]. HDAC4 siRNA увеличивает уровни GLUT4 и потребление глюкозы адипоцитами [48]. Потеря класса IIa HDACs (HDAC4,5 и 7) в печени мыши приводит к снижению уровней глюкозы в крови, к увеличению хранилищ печеночного глюкогена, улучшению переносимости глюкозы и чувствительности к инсулину у мышей [23, 24]. Эти данные подтверждают гипотезу, что miR-155 усиливает экспрессию GLUT4 путем подавления экспрессии HDAC4, приводя тем самым к усилению потребления глюкозы в чувствительных к инсулину тканях (напр., SM), строго подтверждая, что miR-155 играет позитивную роль в регуляции чувствительности к инсулину в периферических тканях, по крайней мере, частично путем супрессии экспрессии HDAC4 (Fig 8). SOCS1, негативный регулятор глюкозы в крови и чувствительности к инсулину у мышей [19, 20, 25], сигнальный путь инсулина IRS-1/PI3K/AKT путем обусловленной убиквитином деградации IRS-1[26, 27].

Наши результаты показали. что miR-155 негативно регулирует экспрессию генов мишеней для SOCS1 в чувствительных к инсулину тканях и клетках печени, а избыточная экспрессия miR-155 приводит к усилению фосфорилирования IRS-1 и AKT в SM и жировой ткани RL-m155 мышей после воздействия инсулина. Мы полагаем, что miR-155 может активировать инсулиновый путь IRS-1/PI3K/AKT путем ингибирования экспрессии SOCS1, это, по крайней мере, частично вносит вклад в упомянутые выше метаболические фенотипы (Fig 8 and S11 Fig).

Как показано на Fig 8 и S11 Fig, мы предлагаем рабочую гипотезу, объясняющую роль miR-155 в индукции множественных фенотипических изменений у мышей и лежащие в их основе механизмы. Хотя мы не можем исключить возможность, что др. известные (такие как CES3) [8] и неизвестные гены мишени для miR-155 (S5 Table) вносят вклад в метаболизм глюкозы, мы полагаем. что скоординированная регуляция генов мишеней для miR-155 (C/EBPβ, HDAC4 и SOCS1) д. сильно влиять на профиль экспрессии генов, связанных с метаболизмом глюкозы, модулируя тем самым упомянутые выше метаболические фенотипы. Эти результаты и недавнее сообщение [42] демонстрируют, что одна miRNA, такая как miR-155 (this study) и miR-26a [42], могут регулировать множественные метаболические фенотипы in vivo путем скоординированной регуляции многих генов. Эти эффекты miR-155 д. существенно консолидировать и усиливать взаимодействие между метаболизмом глюкозы и передачей сигналов инсулина, указывая, что небольшие изменения экспрессии miR-155 могут иногда вызывать крупные физиологические эффекты на метаболические фенотипы. Соотв. минорное или умеренное увеличение экспрессии miR-155 у мышей может оказаться достаточным, чтобы вызывать множественные фенотипические изменения.

Помимо упомянутых выше мишеней для miR-155, многие метаболические гены, лишенные предполагаемых сайтов мишеней для miR-155, обнаруживают изменения экспрессии при модулировании экспрессии miR-155.

Эти, связанные с метаболизмом глюкозы, гены участвуют в метаболизме гликогена (Gys2), гликолизе (Gck, PDK4, PKM2 и Ldha), транспорте глюкозы (GLUT1, GLUT2, GLUT4, Slc1a2 и Slc3a2). Скорее всего, эти по-разному экспрессируемые гены действуют ниже генов мишеней для miR-155. В самом деле, PDK4[43, 44] является геном мишенью для C/EBPβ , а GLUT4[47] является геном мишенью для HDAC4.

Более того, имеются доказательства, что miR-155 участвует также в дифференцировке адипоцитов [49], адипогенезе [50, 51] и липидном метаболизме [8, 52]. In vivo избыточная экспрессия miR-155 у трансгенных мышей вызывает снижение массы коричневой жировой ткани и ухудшает функцию коричневой жировой ткани, тогда как ингибирование miR-155 у мышей приводит к гиперактивации коричневой жировой ткани и индукции фенотипов, подобных коричневым адипоцитам ('browning') в белых адипоцитах [49]. Эктопическая экспрессия miR-155 существенно снижает адипогенез in vitro [50, 51]. Ранее мы показали, что специфичная для печени избыточная экспрессия miR-155 трансгена приводит к достоверно сниженным уровням в сыворотке общего холестерина, триглицеридов (TG) и высокой плотности липопротеина (HDL), а также к заметному понижению содержания печеночных липидов, TG, HDL и свободных жирных кислот у Rm155LG/ Cre трансгенных мышей [8], указывая на то, что miR-155 негативно модулирует составы уровней печеночных и сывороточных липидов и вызывает активность, снижающую липиды. Итак, miR-155 оказывает влияние на многие аспекты метаболизма глюкозы и передачи сигналов инсулина, липидный метаболизм и дифференцировку адипоцитов, регулируя важные метаболические гены.

Более того, эти находки выявляют снижение массы BAT и функцию у miR-155 трансгенных мышей, а предварительные данные указывают на усиление потребления глюкозы и гликолиза и на стимуляцию инсулином фосфорилирования AKT в BAT RL-m155 мышей. Но влияние на снижение массы и функции BAT, вызываемой избыточной экспрессией miR-155 у мышей на метаболизм глюкозы (включая чувствительность к инсулину во всем теле) остается неизвестным. Необходимы дальнейшие исследования этого вопроса.

Кроме того, необходимы дальнейшие эксперименты на приматах для оценки роли miR-155 улучшения толерантности к глюкоза и чувствительности к инсулину и к последующему понижению в крови уровней глюкозы, что могло бы помочь лечению резистентности к инсулину и T2DM.

Помимо многочисленных функций miR-155 важны и некоторые др. аспекты. Во-первых, miR-155 регулирует многие компоненты метаболизма глюкозы. Во-вторых, наши и др. результаты [8] выявляют снижение активности глюкозы крови и активности липидов, вызываемое miR-155. В-третьих, miR-155 трансген является универсально экспрессируемым на относительно низких уровнях в печени, WAT, BAT, SM, поджелудочной железе и изолированных островках у RL-m155 мышей и в печени Rm155LG/Alb-Cre мышей [8], тогда как трансген miR-155 экспрессируется на довольно высоких уровнях в головном мозге, семенниках и сердце RL-m155 мышей. Но наши результаты показывают, что относительно низкие уровни экспрессии трансгена miR-155 в главных органах мишенях для инсулина (печень, жировая ткань и SM) достаточны, чтобы индуцировать фенотипы, описанные выше и в [8], показывая. что умеренная избыточная экспрессия miR-155 может быть безопасна; в подтверждение этой идеи физиологические и паталогические побочные эффекты избыточной экспрессии miR-155 не обнаруживаются у RL-m155 и Rm155LG/Alb-Cre мышей в возрасте до одного года. Т.о., низкая или умеренная избыточная экспрессия miR-155 может снижать риск туморогенеза. В-четвертых, глобальная (this study) или специфичная для гепатоцитов [8] избыточная экспрессия miR-155 у мышей не вызывает избыточного веса, избегает крупных побочных эффектов от повышенной чувствительности к инсулину и может быть использована для лечения диабета [54]. Учитывая мощное влияние miR-155, в том числе и на метаболизм липидов [8, 52], эти находки подтверждают, что miR-155 является многообещающей новой мишенью для лечения T2DM.

Итак, мы впервые установили, что (1) miR-155 регулирует множественные аспекты нормального метаболизма глюкозы и передачу сигналов инсулина путем скоординированной регуляции критических метаболических генов у мышей; (2) miR-155 является позитивным регулятором чувствительности к инсулину; и (3) miR-155 физиологически необходима для нормального гомеостаза глюкозы в крови у мышей. Кроме того, miR-155 обладает активностью снизать активность в крови глюкозы и липидов у мышей. Важно, что наши наблюдения строго подтверждают, что miR-155 осуществляет контроль за всеми 3 характерными признаками T2DM, а именно, за резистентностью к инсулину, избыточностью HGP, которая прежде всего возникает в результате устойчивого глюконеогенеза [55], и за повышенный синтез липидов. Хотя механизмы того, как miR-155 контролирует гомеостаз глюкозы, нуждается в дальнейших исследованиях, полученные находки подтверждают, что терапевтическая избыточность функции miR-155 может стать пригодной стратегией контроля гликемии, чтобы лечить резистентность к инсулину и T2DM.