Refining strategies to translate genome editing to the clinic
 Nature Medicine 23, 415–423 (2017) | |
|---|---|
|
C открытия в 2012, что CRISPR-Cas может служить в качестве программируемой РНК-наводимой нуклеазы1, 2, редактирование генов с помощью преобразованных нуклеаз разрабатывалось бешенными шагами в разных областях3. Многие пре-клинические протоколы редактирования генов достигли стадии проверки концепции, а некоторые предложены для клиники (Box 1).
Box 1: Clinical applications of gene editing.
Full box Full box Table 1 Potential targets for gene editing in hematopoietic cells. Choosing the appropriate delivery vehicleo ...
Figure 1: Designer-nuclease-induced genome editing. Table 2 Clinical gene-editing trials. Choosing a suitable gene-editing platform
...
Figure 2 Improving the specificity of engineered nucleases. Gene editing in clinical trials Zinc-finger nucleases. Пока лишь горстка исследований по редактированию генома продвинулась на пути к клинике (Table 2). Большинство из этих испытаний базируется на преклинических исследованиях и демонстрирует, что понадобится не менее 5 лет для перехода от пре-клинической проверки концепции до отбора пациентов для клинических испытаний. Первым одобренным испытанием редактирования генов стало использование ZFNs нуклеаз в контексте HIV инфекции. Sangamo BioSciences разработало ZFNs, нацеленные на локус CCR5, кодирующий основной ко-рецептор HIV. ZFNs вводили в аутологические CD4+ T клетки ex vivo с помощью AdV векторов. Клинические результаты были опубликованы в 2014 (ref. 18) и продемонстрировали, что перенос Т клеток с отредактированным геном пациентам хорошо переносится и что CCR5-нокаутные клетки были защищены от инфекции с помощью CCR5-тропных HIV. Однако, в целом частота нокаута CCR5, а также абсолютные количества переносимых Т клеток, были слишком низкими, чтобы оказывать длительные терапевтический эффект. В последующей фазе 1/2 исследования, Sangamo и/или University of Pennsylvania провели исследование по увеличению дозы, чтобы увеличить количества клеток CD4+T с модифицированным геном, и попытались улучшить приживление отредактированных CD4+ (и CD8+) T клеток с помощью nonmyeloablative lymphodepletion (см. Table 2). Данные относительно клинического исхода не были описаны. На базе этих первоначальных испытаний Sangamo BioSciences было начато рекрутирование пациентов с HIV для изучения, что вызывает разрушение гена CCR5 в аутологичных CD34+ HSCs ex vivo. Нуклеазы доставлялись с помощью электропортации мРНК, кодирующих ZFN. Основным преимуществом использования HSCs перед T клетками является то, что все субнаборы HIV-чувствительных клеток, дифференцирующихся из популяции CD34+ после редактирования, включая макрофаги, оказывались защищенными от инфекции HIV.
В сотрудничестве с Pennsylvania, Sangamo BioSciences разработали также подходы по коррекции генов in vivo с целью воздействия на hemophilia B28. Этот подход базировался на доставке ZFNs с помощью factor-IX (F9)-кодирующих AAV векторов, чтобы целенаправленно вызывать интеграцию откорректированной F9 комплементарной ДНК (cDNA) в локус, кодирующий альбумин в печеночных клетках (NCT02695160). Ожидается вскоре разработка и введение в клинику сходных подходов для пациентов с гемофилией A и пациентов нарушениями лизосомного хранения.
Transcription activator-like effector nucleases. Пока только одно исследование использовало TALENs в CAR T клетках. Cellectis S.A. разработала набор аллогенных, универсальных CAR T клеток, которые нацелены на разные типы лейкемии. В этом специфическом случае, аллореактивность и чувствительность к aletuzumab были устранены с помощью разрушения локусов, кодирующих T cell-receptor α-chain (TRAC) и CD52 (ref. 19) (Fig. 3). Перед одобрением учреждением эти модифицированные CAR T клетки в Great Ormond Street Hospital for Children in London разрешены из-за сострадания у двух детей, не отвечающих на терапию с рецидивирующей B клеточной лейкемией. Не отмечено заметной токсичности или вызываемого цитокинами синдрома после введения, а костный мозг пациентов, как сообщалось, обнаруживал цитогенетическую ремиссию20.
Figure 3: Production of an off-the-shelf CAR T cell product.  A CAR is an artificial construct typically based on an extracellular monoclonal-antibody domain directed against a tumor (or tumor-associated) antigen, which is fused to a signaling domain on the inside of the cell that promotes cell proliferation when the engineered T cell encounters its target tumor cell. A notable advancement in the CAR T cell field is the effort to manufacture these immune cell therapies ahead of need, so that they can be transfused on demand to a wide range of patients. Such universal, nonalloreactive CAR T cells can be produced by knocking out the TRAC locus that encodes the T cell receptor (TCR) α chain19, 20. This approach can be combined with a knockout of the CD52 locus that renders the CAR T cells resistant to alemtuzumab, a monoclonal antibody used in the treatment of various T cell malignancies. To manufacture such an off-the-shelf product, T cells are collected from a healthy donor through apheresis. After the addition of the CAR by lentiviral gene transfer, TALEN-encoding mRNA are transferred to the cells to disrupt the TRAC and CD52 loci. After depletion of TCR-positive cells, the fully modified CAR T cells are expanded and stored until needed. CRISPR-Cas. первые академические клинические испытания с участием CRISPR-Cas в Китае и США имели целью сходные мишени и оба использовали нарушения programmed death 1 (PD-1)- и/или T клеточный рецептор кодирующего генов в CAR T клетках, чтобы осуществить более эффективную противораковую иммунотерапию для лечения рака легких или множественной миеломы (see trial numbers in Table 2). Более того, некоторые биотехнологические компании объявили о попытках первых клинических испытаний с использованием CRISPR-Cas, которые будут начаты в начале 2017.
Funding. Принимая во внимание, что академические учреждения не всегда находят финансовые средства для проведения таких клинических испытаний, поэтому многие клинические исследования по редактированию генов финансово поддерживаются фармацевтическими компаниями. Это позволяет осуществлять разработку терапии для редких болезней с небольшим количеством пациентов.
Clinical development and regulation of gene-editing products Важно учитывать при разработке продуктов для генного редактирования соотношение риска и пользы. Напр., пациент страдает смертельной болезнью, то рискованная статегия, такая как двойной нокаут в CAR T клетках, с теоретическим риском транслокацией вызываемой трансформации этих клеток, может считаться приемлемым. Но если обычная терапия уже доступна, такая как лечение инфекции HIV, то подход по генному редактированию в гематопоэтических стволовых клетках в комбинации с предполагаемой цитотоксичностью, то режим д. убедительно продемонстрировать надежность изготовленного продукта в виде стволовых клеток и его потенциал по достижению благоприятного уровня д. превышать существующее лечение. Тщательная проверка соотношения риска и пользы д. помочь избежать серьезных побочных эффектов от этих многообещающих подходов.
Как только решается вопрос о клинической разработке, то Investigational Medicinal Product Dossier (IMPD), в Европе, или Investigational New Drug (IND), в США, то подход подвергается клинической экспертизе. Досье содержит относящуюся к делу документацию, которая включает детальное описание (i) результатов преклинических испытаний от good laboratory practice (GLP), включая in vivo и/или in vitro исследования, демонстрирующие проверку концепции; (ii) данные по фармакокинетике, которые включают исследования по биораспределению; (iii) токсикологические исследования, в частности, генотоксичности, связанной с разработанной нуклеазой, и туморогенности; (iv) данные по оценке любых потенциальных иммуногенетических или иммунохимических эффектов, возникающих в результате введения чужеродных белков и/или нуклеиновых кислот; и (v) детальная разработка ранней фазы в соответствии с good clinical practice (GCP) и good manufacturing practice (GMP) для генерации клеточного продукта, гарантриующего мощь, качество, чистоту и собственно идентификацию финального продукта. Отсутствуют специальные инструкции и руководства в использовании продуктов генного редактирования в Европе и США. Имеются инструкции, разработанные для advanced-therapy medicinal products (ATMPs), которые включают обычно и генотерапию, а также продукты геномного редактирования клеток. Первые рекомендации будут базироваться на опыте первоначальных клинических испытаний с использованием продуктов геномного редактирования и смогут привести к руководствам по стандартизации и validated методов оценки таких продуктов, включая методы на генотоксичность и протоколы по тестированию специфичности и надежности искусственно созданных нуклеаз (Fig. 4).
Figure 4: Roadmap: translating targeted genome editing into the clinic. POC, proof of concept; CMC, Chemistry, Manufacturing, and Controls; IND, Investigational New Drug; FDA, Food and Drug Administration; IMPD, Investigational Medicinal Product Dossier; EMA, European Medicines Agency. Целенаправленное геномное редактирование с использованием искусственно созданных нуклеаз вносит новые перспективы в лечение пациентов с угрожающими жизни болезнями. Хотя многие узкие места, связанные с активностью и специфичностью нуклеаз уже прояснены, инстументы по доставке отредактированных генов in vivo всё ещё составляют множество проблем. Доставка с некоторые органы, такие как печень и глаза, осуществляется успешно с помощью AAV веторов28, 37, но много проблем с введением в др. органы, такие как мышцы и головной мозг. Ещё два вопроса остаются нерешенными: как мы будем контролировать выбор пути репарации ДНК и как будем оценивать биологический риск ассоциированных с нуклеазами эффектов вне мишени? Мы всё ещё ожидаем клинического подтверждения, что редактирование генов действительно способно лечить болезни и что генотоксичность является реальной проблемой.
Мы обоснованно полагаем, что редактирование генов провозглашает новую эру в лечении наследственных и благоприобретенных болезней. Мы надеемся на преодоление стоящих перед этим проблем.
|