Посещений:
ПРЕДОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА



Генетические нарушения

Anomalies in human sex determination provide unique insights into the complex genetic interactions of early gonad development
A. Bashamboo, C. Eozenou, S. Rojo, K. McElreavey
Clin.Gen. Volume 91, Issue 2 February 2017 Pages 143–156

Human sex determination (SD) involves complex mutually antagonistic genetic interactions of testis- and ovary-determining pathways. Here, we review genetic data generated through large-scale sequencing approaches that are changing our view of how this system works, including the recently described recurrent NR5A1 p.R92W mutation associated with testis development in 46,XX children. We also review some of the unique challenges in the field to establish that mutations, such as this are pathogenic. The impending surge of new genetic data on human SD from sequencing projects will create opportunities for the development of mechanistic models that will clarify how the system operates and importantly provide data to understand how selection and developmental processes interact to direct the evolution of SD across species.
У млекопитающих sex determination (SD) и развитие эмбриональных гонад является сложным молекулярным процессом, использующим большое количество генов и сетей, действующих синергично или антагонистически (Fig. 1). У людей во время эмбрионального развития урогенитальный гребень или adrenogonadal примордий развивается примерно спустя 4 недели после оплодотворения [1, 2]. Мезенхима генитального гребня растет за счет пролиферации, рекрутирования клеток из соседних первичных почек (mesonephros) и вторжения клеток из целомического эпителия. Несколько транскрипционных факторов являются критическими для развития недифференцированных бипотентных гонад во время эмбриогенеза. Несколько генов, включая Lhx9, Emx2, Wt1, Cbx2, Nr5a1, Gata4 и Six1/4 участвуют в становлении бипотентных гонад у самцов и самок, поскольку отсутствие этих генов приводит к неспособности развития гонад у эмбрионов самок и самцов [3].



Figure 1.

Overview of genetic pathways of human/mouse sex determination. Human sex determination is a dynamic process, encompassing three crucial steps from fetal life to adulthood, chromosomal, gonadal and anatomical sex. The bipotential gonad develops independently of the chromosomal context and XX and XY embryos express the same set of genes at this stage. Under the influence of gonosomes, the bipotential gonad will form an ovary or a testis through female (left) or male (right) pathways.
Предопределение в направлении или мужских или женских гонад зависит от принятия клетками соотв. судеб, которое происходит в соматических клетках бипотенциальных гонад в детерминированные клетки Сертоли (мужские) гранулёзные (женские) клетки (Fig. 1). Этот выбор клетками судьбы является классическим, но не до конца понятным процессом. Имеющиеся данные подтверждают, что SD (sex determination) у млекопитающих использует сложные взаимно антагонистические генетические взаимодействия тестисы- и оварии-детерминирующих путей. Уникально, что возникновение SD достигается за счет супрессии альтернативной судьбы и поддержания у взрослых взаимно антагонистических двух представленных путей. Клетки Сертоли являются одним из первых клонов соматических клеток, дифференцирующихся во время формирования семенников. Клетки Сертоли координируют клеточные и морфогенетические события, приводящие к первичному SD. В XY гонадах, pre-Sertoli клетки экспрессируют SRY (sex-determining, Y chromosome). При осуществлении клеточно-автономных и клеточно-неавтономных механизмов экспрессия Sry гарантирует дифференцировку достаточного количества клеток Сертоли, необходимых для инициации развития семенников [4]. Несколько генов, включая Lhx9, Nr5a1, Wt1, Gata4 и Fog2, необходимы для развития раннего генитального гребня, при этом может быть также использована экспрессия детерминирующего семенники гена Sry [5]. CBX2 является белком группы polycomb, обнаруживаемых в polycomb-repressive complex 1, который контролирует экспрессию генов во время спецификации клеточных судеб и дифференцировки посредством модификации хроматина [6]. CBX белки содержат один chromodomain, который, как полагают, локализует CBX-комплексы посредством распознавания триметилированного гистона H3. Cbx2-/- XY мыши обнаруживают реверсию мужского пола в женский, а XX животные или лишены или имеют маленькие яичники [7, 8]. Наблюдение, что экспрессия Sry почти не обнаружима в XY Cbx2-дефицитных гонадах вместе с тем фактом, что фенотип может быть восстановлен с помощью принудительной экспрессии в гонадах Sry и Sox9 подтверждает, что CBX2 действует выше SRY и осуществляет связь между эпигенетикой и SD [7, 8]. Эта концепция подкрепляется наблюдением, что H3K9 деметилаза, Jmjd1a, позитивно контролирует экспрессию Sry путем регуляции H3K9me2 меток [9]. У мышей экспрессия Sry также позитивно регулируется с помощью пути передачи сигналов mitogen-activated protein kinase. XY мыши, лишенные Map3k4, обнаруживают изменение пола с подавлением экспрессии Sry [10]. Изменение пола у XY мышей наблюдалось также при отсутствии взаимодействующего с Map3k4 партнера Gadd45g, а также обеих p38α и p38β MAPK (mitogen-activated protein kinase) изоформ [11]. Будучи активированным, Sry активирует Sox9 выше критического порога и это является сигналом для инициации дифференцировки клеток Сертоли. Было подтверждено, что, по крайней мере, в семенниках мышей может быть определена за счет синергичного взаимодействия Sry и Nr5a1 активация экспрессии Sox9 посредством специфичного для тестисов энхансерного мотива, наз. Tesco. Nr5a1 обладает способностью соединяться со множественными сайтами внутри элемента Tesco и усиливать трансактивацию Sox9 репортерного гена в 5 раз [12]. Добавление Sry увеличивает трансактивационную активность в 10 раз. Др. ко-факторы, такие как WT1, GATA4 или FOG2 образуют часть сигнальной сети, активной во время образования гонад.
Sry инициирует также позитивную петлю обратной связи между Sox9 и Fgf9, которая приводит к усилению активности Fgf9 и репрессии овариального гена Wnt4 в семенниках [13, 14]. XY Fgf9/Wnt4 двойные мутантные мыши формируют семенники, подтверждая, что первичной ролью Fgf9 является репрессия Wnt4 [15]. Т.о., fgf9 может усиливать экспрессию Sox9 за счет негативной регуляции репрессора для Sox9. Хотя Sox9 является нижестоящей мишенью для Sry, возможно, что Sry может быть вовлечен в непосредственную модуляцию Dmrt1 или др. ещё нераспознанных факторов [16-18]. SOX9 регулирует продукцию anti-Müllerian hormone (AMH) клетками Сертоли и репрессирует генетические пути (WNT4/FOXL2), участвующие в развитии яичников. Точная роль DMRT1 (Doublesex and mab-3 related transcription factor 1) в половом развитии млекопитающих не совсем понятна. Доказательства указывают на то, что DMRT1 детерминирует пол у некоторых позвоночных, включая птиц, но недавние данные указывают на то, что его главной функцией у мышей является репрессия развития яичников. XY Dmrt1-/- мутантные мыши рождаются как самцы с семенниками, следовательно, детерминация семенников, по-видимому, не нарушена, но клетки Сертоли пролиферируют избыточно, неспособны принять соотв. дифференцированную морфологию и погибают постнатально [19]. У людей миссенс мутации в ДНК-связывающем домене человеческого DMRT1 были описаны в связи с полным отсутствием детерминации семенников, указывая, что этот ген участвует в первичном SD у людей, хотя механизм неизвестен [20].
Клетки Сертоли индуцируют развитие плодных клеток Лейдига посредством сигнального пути hedgehog, который на ст. 8-9 недель развития продуцирует андрогены и insulin-like factor 3 (INSL3). Testosterone и AMH вызывают регрессию Mullerian структур и дифференцировку Вольфовых протоков в эпидидимис, vas deferens и семенные пузырьки, тогда как INSL3 необходим для опускания яичек.
В противоположность семенникам овариальная соматическая SD, по-видимому, довольно лабильна с сохранением потенциала переключения на состояние семенников. Овариальная соматическая SD нуждается как в Rspo1/Wnt4/β-catenin, так и в Foxl2 сигнальных путях, хотя степень, с которой эти факторы функционируют, чтобы создавать инструктивное и/или пермиссивное окружение, неясны [21]. Полное или частичное обращение XX в самцов наблюдается у людей и мышей с мутациями потери функции генов Wnt4, Rspo1 и Foxl2 [21]. Имеющиеся данные подтверждают, что Rspo1 может кооперировать с Wnt4, чтобы стабилизировать β-catenin, помогая нейтрализовать становление Sox9/Fgf9 позитивной петли обратной связи во время развития яичников у мышей. Мыши, несущие постоянно активную форму β-catenin, обнаруживают обращение XY в женский пол [22]. Foxl2 необходим для поддержания фенотипа яичников на постнатальных стадиях, при целенаправленном удалении Foxl2 во взрослых яичниках происходит молекулярная транс-дифференцировка поддерживающих клеток яичников в поддерживающие клетки семенников, обнаруживающих экспрессию SOX9 [23]. Сходным образом, потеря Dmrt1 в клетках Сертоли мышей, даже у взрослых, приводит к активации экспрессии Foxl2, а клетки Сертоли транс-дифференцируются в гранулёзные и theca клетки, продуцирующие эстроген, а зародышевые клетки, по-видимому, становятся женскими (feminized) [24]. Т.о., развитие и поддержание гонад млекопитающих является необычным биологическим процессом, регулируемым с помощью двойной репрессивной системы, где равновесие взаимно антагонистических путей д. достигаться для нормального развития или семенников, или яичников. Изменения в этом деликатном балансе могут приводить к нарушениям половго развития (DSD) или к бесплодию у людей. Некоторые формы бесплодия у людей и DSD могут быть представлены в виде спектра гонадных фенотипов при одной и той же генетической причине.

Disorders of sex development


DSDs определяются как врожденные состояния, при которых развитие хромосомного, гонадного или анатомического пола атипично, и они соответствуют диапазону гонадных фенотипов [25]. DSD составляют группу редких и очень редких врожденных нарушений, затрагивающих развитие мочеполового тракта и в большинстве случаев затрагивается эндокринно-репродуктивная система. Показатели варьируют в разных этнических группах, напр., обнаруживается 1 на 5000 родов случай неоднозначных гениталий в год в Германии [26], и 1 на 2500 в некоторых Арабских популяциях. Причина этого может заключаться в высоком уровне кровного родства или эндогамии в некоторых сообществах, что может приводить к экспрессии рецессивных признаков [27, 28]. Однако, настоящие неоднозначные гениталии являются редким фенотипом с частотой 1:4500 родов. Более 80% случаев затронутых детей рождаются как мальчики и имеют предположительно или действительно XY кариотип [29]. 46,XY DSD включает 46,XY полный или частичный дисгенез гонад (ошибки детерминации семенников), или undervirilization или undermasculinization XY мальчиков из-за дефектов синтеза или действия андрогенов. 46,XX DSD включает дисгенез гонад или чаще всего overvirilization или masculinization XX индивидов из-за избытка андрогенов. Общая классификация категорий DSD и их наиболее распространенные фенотипы представлены в Табл. 1 . 

Table 1. Classification of human DSD  

Biological classification of DSDs   

Chromosomal DSD                                               46,XY DSD                                    46,XX DSD    

1.        DSD, disorders of sex determination.   


45,X (Turner syndrome and variants)            Ovotesticular DSD        Ovotesticular DSD   

47,XXY (Klinefelter syndrome and variants)
 Complete or partial gonadal dysgenesis,
 monogenic forms (caused by mutations
  in SRY, SF1, WT1 and others)                                                                  Testicular DSD


Other complex chromosomal rearrangements  


      Disorders of androgen synthesis

1. Syndromic (e.g. Smith-Lemli-Opitz syndrome)

2. Associated with congenital adrenal hyperplasia and early
 androgen biosynthesis defects (e.g. mutations and/or
  deficiencies in StAR, P450(scc), 3β-HSD II,
   P450R and CYP17A1)  

3. Associated solely with androgen biosynthesis defects (e.g.
mutations and/or deficiencies in SRD5A2 and HSD17B3)  

4. Associated with endocrine disruption disorders of androgen action 

5. Complete and partial androgen insensitivity


     Disorders of androgen excess
1. Congenital adrenal hyperplasia (mostly steroid 21-hydroxylase deficiency) 



                                                           Idiopathic hypospadias        Aromatase deficiency 

                                            Epispadias        Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser syndrome  

                                         Complex syndromic disorders        Complex syndromic disorders


Приблизительно 15% от всех случаев 46,XY полной дисгенезии гонад, возникающей в результате мутаций, затрагивающих ген SRY, в большинстве своем локализуются внутри HMG (high mobility group) ДНК-связывающего домена [30]. Др. генные мутации ассоциируют 46,XY гонадную дисгенезию с SOX9, GATA4, FOG2, NR5A1, WT1, DHH, CBX2, ATRX, MAP3K1 и FGF9 [rev. Ref. [21]]. Кроме того, было отмечено, что хромосомные перестройки, включая делеции, захватывающие DMRT1 (9p) или EMX2 (10q), также как и дупликации Xp21 (DAX1/NROB1) ассоциируют с 46,XY DSD [rev. Ref. [21]]. Генные мутации, ассоциированные с ошибками SD человека и ассоциированные с ними фенотипические отклонения детально представлены в Table 2.

Table 2. Gonadal phenotypes of human and mouse genes known to play a role in early gonad formation (см. оригинал статьи)
46,XX DSD включают overvirilization или masculinization XX индивидов из-за избытка андрогенов. Большинство таких случаев являются аутосомно рецессивными нарушениями, congenital adrenal hyperplasia (CAH). Самая распространенная форма CAH обусловлена дефицитом 21-hydroxylase, которая вызывается мутациями в гене 21-hydroxylase (CYP21A2) и объясняет 90-95% всех случаев CAH [31]. Частота дефицита 21-hydroxylase приблизительно 1 на 10000 до 1 на 15000 генеральной популяции. Более 100 мутаций в гене CYP21A2 было описано в качестве причины дефицита 21-hydroxylase, причем большинство из них возникают в результате обмена генетического материала между геном CYP21A2 и тесно сцепленным псевдогеном на хромосоме 6p21.3. Фермент 21-hydroxylase катализирует гидроксилирование 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) в 11-deoxycortisol в коре надпочечников. Снижение активности 21-hydroxylase в свою очередь снижает эффективность синтеза кортизола, с последующей гиперплазией коры надпочечников и подъемом концентрации адренокортикотропного гормона (ACTH). ACTH стимулирует потребление холестерина и синтез pregnenolone. Стероидные предшественники вплоть до и включая progesterone, 17-hydroxypregnenolone и особенно 17-OHP повышены и большие количества 17-OHP склоняются в конечном итоге к синтезу тестостерона, начиная с третьего мес. плодной жизни. Это приводит к virilization 46,XX индивидов.
Значительно более редкие формы XX DSD, которые вызываются ошибками первичной SD, включают 46,XX testicular DSD (TDSD) и 46,XX ovotesticular DSD (OTDSD). Эти формы DSD, как подсчитано, встречаются с частотой приблизительно 1:60000 родов [32]. 46,XX OTDSD обозначают индивидов, которые имеют как овариальную, так и тестикулярную ткань в гонадах, обычно как ovotestis, но менее часто как семенники (or ovotestis) на одной стороне и яичником на др. Внешние гениталии обычно двусмысленны или женские, при этом степень маскулинизации широко коррелирует с количеством присутствующей тестикулярной ткани. ПРи TDSD и OTDSD, гистологическая проверка гонад обнаруживает отличительные тубулярные структуры в семенник-подобной ткани и присутствие фолликулов в яичник-подобной ткани в случае OTDSD. Наше понимание генетических структур 46,XX DSD остается в младенчестве. Хромосомные перестройки, приводящие к образованию семенников на XX фоне самок, в основном ассоциированы с нарушениями регуляции экспрессии SOX генов (напр. SOX9, SOX3 и SOX10). Приблизительно 10% от всех SRY-негативных TDSD и OTDSD несет такие формы перестроек. Предполагается, что эти перестройки приводят к эктопической экспрессии SOX генов в развивающихся pre-granulosa клетках и что они эффективно действуют, как фактор, способствующий формированию самцов. У мышей HMG-box в Sry может быть замещен на HMG-box от Sox3 или Sox9 и возникающий в результате химерный белок может функционально замещать Sry и у XX трансгенных мышей приводить к развитию зачатка яичка, самцовомы паттерну экспрессии генов и появлению самцовых вторичных половых признаков [33]. Мутации Sox10 с избыточной функцией у XX также могут вызывать образование семенников и маскулинизацию [34].
В генах, которые являются 'pro-ovarian/antitestis' в пути передачи сигналов RSPO1/WNT, гомозиготные точечные мутации ассоциируют с очень сложными синдромальными формами 46,XX DSD. Сложность фенотипа обусловлена важной функцией этих белков во многих биологических путях. Напротив, гетерозиготные миссенс мутации в WNT4 ассоциированы с умеренным фенотипом синдрома Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser и hyperandrogenismу затронутых XX женщин [rev.Ref. [21]].

Testis development associated with an NR5A1 missense mutation


Кстати, изменения специфических аминокислот в ядерном рецепторе NR5A1 является есдинственной моногенной мутацией, ассоциированной с не синдромными OTDSD/TDSD [35-37]. NR5A1 известен, как steroidogenic factor-1 (SF-1) является ядерным рецептором транскрипционного фактора, играющего крититческую роль в репродуктивном развитии и функции. Структура NR5A1 состоит из N-терминального региона, состоящего из двух классических ДНК-связывающих доменов цинковые пальчики. С-терминальный регион NR5A1 имеет 12-helix структуру, сходную с таковой, типичной для ядерных рецепторов. NR5A1 связывает ДНК как мономер. ДНК-связываюший домен, как полагают, стабилизируется с помощью 'A' box региона, соседствующего с ДНК-связывающим доменом. Изменения потери функции человеческого NR5A1 ассоциированы с широким спектром состояний, включая гонадный (тестикулярный) дисгенез, гипоспадию и неспособность к сперматогенезу у 46,XY мужчин, также как первичную недостаточность яичников у 46,XX женщин [38-42]
Недавно опубликованы 3 исследования, сообщающие о специфических recurrent точечных мутациях в NR5A1 (p.R92W), ассоциированных с возникновением OTDSD/TDSD у 46,XX индивидов в сложных семьях с разным происхождением [35-37]. Клинические детали этих случаев и способ наследования представлены в Table 3. Эта мутация не присутствует в ExAC базе данных с более 60000 секвенированных по экзому индивидов (http://exac.broadinstitute.org/) , указывая тем самым, что она ассоциирована с этим фенотипом. Однако, экспрессивность фенотипа изменчива у некоторых из затронутых ХХ индивидов, выросших как девочки, а др. как мальчики. Один XY мальчик с мутацией имел 46,XY частичный гонадный дисгенез. Семьи обнаруживали неполную пенетрантность фенотипа. В целом описано 12 кажущихся не затронутыми носителей мутации (6 XY мужчин 6 XX женщин). Хотя эти индивиды не были описаны, как имеющие недостаточную или избыточную virilization, остается неясным. действительно ли эти мутации не оказывают эффекта на своих носителей, как это происходит у гетерозигот по мутации NR5A1, известно только об уменьшении количества спермиев у мужчин и преждевременная недостаточность яичников у плодовитых женщин [39, 40]. Три семьи, описанные Baetens et al. [36] все находились в пределах радиуса в 70 км южной части Нидерланд, а анализ гаплотипа показал, что эта мутация основатель в этом регионе. Др. семьи происходили из Японии, Америки или Юж Азии и , по крайней мере, мутации в двух семьях возникли de novo. Все индивиды были SRY-негативными.

Table 3. Clinical presentation and mode of inheritance of NR5A1 R92W mutation associated with 46,XX TDSD/OTDSD

Как мутация p.R92W изменяет судьбу клеток с гранулёзных на Сертоли, неясно. В отличие от людей у мышей [35] Nr5a1 не экспрессируется в ранних развивающихся (pre)-granulosa клетках [43]. Не удивительно, что эти изменения аминокислот, вносящие множество остатков триптофана в A-box регион, приводят к неспособности мутантного белка соединяться с консенсусной последовательностью ДНК мишени [35]. Однако, прямо или косвенно мутация NR5A1 д. приводить к усилению экспрессии SOX9, который является ключевым для образования клеток Сертоли. Теоретически это может происходить одним из двух простых способов - прямой активации генов пути развития самцов и\или подавления генов самок со стороны самцового пути. Т.о., дерепрессия может приводить к усилению экспрессии SOX9. Отсутствуют доказательства, что мутация NR5A1 p.R92W непосредственно усиливает активность 'мужских' генов, включая SOX9. Было показано, что R92W белок лишен способности непосредственно усиливать экспрессию, используя AMH или Cyp11A1 промоторы или энхансер Sox9 Tesco. Прояснилось, что, по крайней мере, одна функция способствующих развитию оварий путей, такая как R-spondin-1/WNT4, активирует β-catenin. β-catenin считается ключевым регулятором полового развития у млекопитающих. Мыши, лишенные Rspo1, обнаруживают частичное обращение пола от женского к мужскому, фенотип, который может быть устранен путем стабилизации экспрессии β-catenin в соматических клетках яичников. С другой стороны, экспрессия и стабилизация β-catenin в гонадах XY мышей оказалась достаточной, чтобы нарушить мужской путь и способствовать развитию яичников [22]. Было установлено, что NR5A1 обладает способностью физически взаимодействовать с β-catenin белком м усиливать экспрессию серии генов мишеней [44]. Сюда вошли AMHR2, INHA, CYP19A1 и DAX-1/NR0B1. Было установлено, что NR5A1 R92W мутант обнаруживает пониженную способность взаимодействовать с β-catenin, чтобы синергично активировать активность репортерного гена (Fig. 2). Этого не наблюдается, когда используется др. NR5A1 мутант, R92Q. Это аминокислотное изменение приводит к образованию тестисов у XX девочек, даже в гомозиготном состоянии [45]. Эти данные показывают, что R92W NR5A1 вариант переключает судьбу органа с яичников на семенники путем нарушения специфичных для яичников путей, которые обычно подавляют развитие семенников скорее. чем активирую пути, способствующие образованию pro-testis (Fig. 2).



Figure 2.

(a) Schematic representation of the structure of the NR5A1 protein, showing the position of the A-box and evolutionary conservation of the R92 residue. (b) A model of how the NR5A1 R92W protein may cause testis formation in an XX individual. This is based on in vitro experimental data (35). Left: In a 46,XY individual NR5A1 synergizes with the SRY protein to upregulate SOX9 expression. This leads to Sertoli specification and testis formation. Left center: In 46,XX individuals, NR5A1 syngerizes with ?-catenin to upregulate the expression of antitestis genes. For example, this could be the DAX-1/NR0B1 gene. Right center: In the 46,XY disorders of sex determination (DSD) case raised as a female (Table 3, case 4.1) the R92W mutant shows a reduced ability to upregulate SOX9 gene expression leading to a lack of testis formation. Right: In a 46,XX child with testicular DSD (TDSD)/Ovotesticular DSD (OTDSD), the same mutant shows reduced ability to synergize with ?-catenin to upregulate the expression of antitestis genes. As a consequence of this lack of repression, the expression of pro-testis genes (e.g. SOX9) is upregulated leads to Sertoli/testis formation.

Становится ясно, что развитие пола чрезвычайно чувствительно к зависимым от дозы эффектам в ключевые моменты времени. Если достигается критический порог функции тестис-детерминирующего фактора (eнапр. SOX9), тогда путь развития семенников будет, по-видимому, давать результат. Неполная пенетрантность, наблюдаемая в этих семьях, четко показывает это, при этом возможно участие временного и пространственного порогов, а также генетической вариабельности. Последнее может касаться общераспространенных или редких вариантов белков партнеров, последовательностей ДНК мишеней или вариантов в одном и том же или сцепленных онтогенетических путях. Мутация NR5A1 p.R92W не только выявляет новую генетическую причину OTDSD/TDSD у людей, но и также показывает, что изменение одной аминокислоты в ключевом транскрипционном факторе может переключать онтогенетическую судьбу ткани в ранней эмбриональной жизни. Становится также ясным, что генетический фон оказывает важное воздействие на проявление фенотипа. Это может объяснить, почему 12 индивидов, несущих мутацию p.R92W не обнаруживают выраженных фенотипических проявлений. Это может также объяснить, почему гетерозиготные мутации с гене FGFR2 человека были описаны как ассоциированные с краниосиностозом и XY гонадным дисгенезом. Мутации в FGFR2 вызывают разные синдромы краниосиностоза, включая Crouzon и Pfeiffer, но ошибки в детерминации семенников не описаны. Bagheri-Fam et al. описали пациента с краниосиностозом и 46,XY полным GD и гетерозиготной мутацией c.1025G>C (p.C342S) [46]. Однако, описанная замена C342 на S у пациента с синдромом Crouzon и Pfeiffer не обнаруживала гонадного фенотипического отклонения. Авт. предположили влияние генов модификаторов, которые усиливают тестикулярный фенотип.

New approaches to understand the genetics of human SD


Хотя общая генетическая структура развития тестисов и оварий становится всё яснее, вклад этих генов в DSD у людей остается не совсем понятным. Также остаются не до конца понятными молекулярные механизмы, использующие взаимодействия генов, участвующих в развитии гонад, а также пути передачи сигналов. Использование новых omics технологий для анализа большого количества пациентов с DSD, и тщательная оценка возникающих в результате баз данных может привести к идентификации новых генетических факторов, влияющих на проявления DSD.
Генетические изменения. приводящие к DSD трудно определить и наше понимание этой группы состояний отстает от понимания др. врожденных заболеваний. Имеется этому несколько причин. Трудно использовать обычные генетические подходы. Семейные случаи некоторых DSD фенотипов редки, так что анализ сцепления для идентификации патогенетических вариантов просто невозможен. Показатель определенных DSD фенотипов, таких как дисгенез гонад или OTDSD, низкий и выявит новый патогенетический вариант затруднительно. Для др. форм DSD, генетика может быть сложной. Гипоспадия, одно из наиболее распространенных врожденных нарушений у мальчиков, возникает с частотой 1:200-1:300 рождений мальчиков. Гипоспадия обнаруживает образование семейных кластеров, при этом 7% случаев затрагивают родственников первой, второй и третьей степени родства. Шансы, что брат затронутого мальчика также будет иметь гипоспадию составляет 9-17%. Исследования семей, а также близнецов известной зиготности, позволило подсчитать, что 57-77% фенотипической изменчивости может быть приписано генетической изменчивости, а остальные обусловлены факторами внешней среды. Genome Wide Association Studies, проведенные в отношении хирургически подтвержденной гипоспадии и контрольных групп из Дании дали ограниченный результат, выявив 18 регионов генома, обнаруживающих независимую ассоциацию (p < 5 х 10-8), которые вместе могут объяснить 9% увеличение риска развития гипоспадии [47]. Генетический и средовой интерфейс изучен недостаточно при слабых формах DSD таких как hypospadias/cryptorchidism.
Др. проблема понимания генетических путей, участвующих в SD, является отсутствие эволюционно законсервированной системы. Генетические данные от модельных организмов, таких как дрозофила и нематоды не могут быть непосредственно перенесены на человека, поскольку большая часть систем сильно отличается. Хотя мышиные модели вполне пригодны для понимания многих генетических и молекулярных путей, участвующих в SD системе мышей, они не воспроизводят в точности механизмы SD и поддержания in vivo у людей. Различия между обоими организмами при SD и развитии очевидны. Напр., пространственно-временная экспрессия Sry сильно ограничена у мышей в момент детерминации тестисов в клетки предшественник Сертоли, тогда как у людей экспрессия SRY поддерживается в течение всей жизни в соматических и зародышевых клетках [48]. Более того, имеются гены, не обнаруживающие одинаковую биологическую функцию в развитии гонад у двух видов, напр., случай с MAP3K1, который ассоциирован с 46,XY DSD гонадным дисгенезом у людей, но мыши не имеют гонадных фенотипических отклонений [49]. Однако, др. член MAPK семейства: Map3k4, как было установлено, вызывает гонадный фенотип у мышей в случае его отсутствия [10]. Сходные делеции в хромосоме 9p, включающие DMRT1, оказались сцепленными с 46,XY DSD у людей [50], тогда как Dmrt1-/- мыши не обнаруживали изменения первичного пола, т.к. рождались с семенниками; но позднее они подвергались аномальной дифференцировке [19].
Некоторые гены, участвующие в образовании и развитии гонад млекопитающих, такие как SRY, WT1 и SOX9, напр., были впервые идентифицированы при детальном анализе клинически хорошо описанных случаев DSD [21]. Др. проблема, препятствующая идентификации генетических причин DSD - это сложность аккуратного определения многих из фенотипов [26]. В самом деле, исключая случаи, где биохимические профили указывают на специфические ошибки в steroidogenesis, было подсчитано, что специфическая молекулярная диагностика касается 25% случаев DSD и только 50% детей 46,XY с DSD могут получить качественную клиническую диагностику [51].

Next-generation sequencing and DSD


Поскольку генетические причины DSD слабо определены, они становятся фокусом подходов next-generation sequencing (NGS) , нацеленных на идентификацию новых генов и геномных локусов, ассоциированных с DSD фенотипами. Большинство исследований секвенируют все кодирующие регионы генома человека (секвенирование экзома) или скринируют большую панель генов мишеней, которые включают гены, участвующие в DSD, а также возможные кандидаты.
Мутации в нескольких новых генах были описаны в ассоциации с синдромными формами DSD или аномалиями развития яичников. Сюда входят мутации в TBC1D1 и TBX18 у пациентов с врожденными аномалиями почек и мочевого тракта (CAKUT) [52, 53]. Некоторые генетические причины 46,XX дисгенеза оварий были идентифицированы, включая мутации в гене nucleoporin-107 [54] и гомозиготные мутации HSD17B4. Последние мутации также ассоциированы с несколькими фенотипами потери слуха и атаксии Perrault Syndrome [55]. Пальмитоилирование sonic hedgehog катализируется с помощью Hedgehog acyltransferase (Hhat), многократно пронизывающего трансмембранного фермента, принадлежащего O-acyltransferase (MBOAT (membrane bound O-acyl transferase)) семейству. Секвенирование экзома выявило гомозиготную G287V миссенс мутацию в MBOAT домене HHAT (hedgehog acyltransferase) в одиночном спорадическом случае 46,XY гонадного дисгенеза и хондроплазии [56]. Мутация нарушает способность HHAT белка palmitoylate Hh белки, включая DHH и SHH (sonic hedgehog) белки, подтверждая патогенность процесса. Hhat экспрессируется в соматических клетках мышиных XX и XY гонад во время SD. Hhat-/- мыши обнаруживают тяжело нарушенное развитие плодных клеток Leydig, аполярность клеток Сертоли, также как и собственно формирование зачатков яичек, указывая тем самым, что Hhat необходим для инициации образования клеток Leydig.
Наш опыт секвенирования экзома более тяжелых форм DSD показал, что около 20% случаев или ошибочный диагноз или атипическое клиническое проявление, ассоциированное с хорошо охарактеризованными генами, участвующими в SD или дифференцировке (K. McElreavey, unpublished). Однако, этот подход безусловно очень мощный как диагностический инструмент, так и для изучения влияния среды. Он позволил нам идентифицировать гетерохзиготные миссенс мутации в GATA4 партнере по взаимодействию с FOG2/ZFPM2 в качестве новой генетической причины 46,XY DSD [57]. Мы идентифицировали две независимые мутации в FOG2 у двух не связанных родством девочек с 46,XY гонадным дисгенезом. Функциональные исследования показали, что мутантные белки лишены способности взаимодействовать с GATA4 [57].
Др. новые гены были идентифицированы в качестве причины DSD с помощью секвенирования экзома. Белок mechanistic target of rapamycin (MTOR) принадлежит семейству phosphatidylinositol kinase-related kinases, которые обеспечивают клеточные реакции на стрессы. включая повреждения ДНК и пищевое голодание. С избыточной функцией, аутосмоно доминантные мутации MTOR были описаны у двух братьев с микропенисом, мегалэнцефалией и аномалиями развития нервов [58]. Синдром Robinow является генетически гетерогенным нарушением, характеризующимся mesomelic укорочением конечностей, гипоплазией гениталий и характерными лицевыми признаками. Недавно, WES (whole exome sequencing) выявило 6 самостоятельных мутаций сдвига рамки считывания в гене DISHEVELED 1 (DVL1), связанных с синдромом Robinow. Все мутации были гетерозиготными укороченными вариантами по предпоследнему экзону в DVL1 [58]. DVL1 кодирует три человеческих гомолога белка сегментной полярности у Drosophila disheveled. Соединение Wnt лигандов с Frizzled и low density lipoprotein receptor-related protein 5 and 6 (LRP5/6) рецепторами приводит к активации Dvl, который супрессирует деградацию β-catenin. Т.о., β-catenin накапливается в цитозоле и затем транслоцируется в ядро, чтобы регулировать гены мишени для Wnts.
В диагностическом наборе, NGS оказывают большое влияние на DSD. Экзомное секвенирование расширяет фенотипический спектр, ассоциированных с мутациями генов, известных как связанных с DSD. Сюда входят мутации генов FGFR1, LHCGR, DHH, ARX [59-62]. NGS становится диагностическим инструментом для DSD. Baxter et al. установили, что с помощью WES скрининга установлена генетическая диагностика в 14 из 40 (35%) случаев группы 46,XY DSD пациентов, которые представляли широкий спектр фенотипов [63]. Во втором исследовании Dong et al. [64], генетическая диагностика достигала 38% от DSD случаев, и варианты с неопределенным клиническим значением были найдены ещё в 14%.

Establishing causality


Поскольку технология продолжает быстро прогрессировать, количество генетических данных увеличивается драматически. Сюда входят новые варианты и гены, ассоциированные с DSDs. Одним из наиболее мешающих аспектов остается определение причинности для кандидата варианта. Нижестоящая интерпретация данных по вариации последовательностей является труднопреодолимым барьером для понимания значения генетической изменчивости фенотипов. В некоторых условиях интерпретация может быть прямолинейной, если мутации в генах с хорошо установленной причинной связью с фенотипом. Однако, в др. случаях взаимоотношения между вариантом и фенотипом могут быть менее ясны. Функциональные подходы могут быть использованы для определения, влияют ли варианты на функцию генного продукта. Широкий диапазон функциональных методов доступен и выбор метода зависит от ряда критериев, включая известную функцию белка, несущего мутацию (напр. транскрипционный фактор, лиганд или трансмембранный рецептор), расположение мутации в гене или белке (напр. ДНК-связывающий домен, домен межбелкового соединения, промотор мутации, сплайс-сайт мутации и т.д.) или выбор может зависеть от самой мутантной аминокислоты, поскольку некоторые аминокислоты подвергаются специфическим пост-трансляционным модификациям.
Использование мышей, моделирующих DSD и in vitro клеточных моделей, в частности мышиных моделей, используемых для целенаправленного мутагенеза и трансгенеза внесли существенный вклад в наше понимание функции генов и в расшифровку молекулярных сетей в развитии и поддержании пола (Table 2). Наше понимание путей и механизмов формирования и дифференцировки гонад с использованием мышиных моделей повлияло недавнее использование геномного редактирования. Система Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9 является мощной технологией, делающей возможным редактирование части генома путем рассечения, замещения или добавления части последовательности ДНК. Использование этой системы для внесения точно измененных аминокислот, наблюдаемых и в случае DSD у людей, может быть передано мышам и биологические последствия этого могут быть охарактеризованы.
Недавно получение эктопических ксенотрансплантаций стало удобной моделью для индукции сперматогенеза в незрелой тестикулярной ткани. Подкожные трансплантации кусочков тестикулярной ткани иммунодефицитным хозяевам позволило достичь полного сперматогенеза в свежей и крио-законсервированной неонатальной и pre-pubertal тестикулярной ткани от разных видов, включая макак резус и человека в хозяевах мышах [65]. Ксенографы пригодные модели для изучения сперматогенеза, токсикологических эффектов, влияния облучения и крио-консервации тестикулярных тканей [66]. Эта техника может быть модифицирована для изучения генов, участвующих в SD и развитии семенников in vitro. У людей исследования показали, что тестикулярная ткань плодов человека в тканевых ксенографах nude мышам обнаруживает экспрессию клеточных маркеров семенников; однако, они обнаруживают низкую жизнеспособность и жизнеспособность постнатальных тканевых ксенографов также ограничена, хотя не полностью зрелые спермии были описаны.
Разные линии гонадных клеток созданы, охарактеризованы и используются с ограниченным успехом. Мышиные линии клеток, такие как TM4 (Sertoli-like) и TM3 (Leydig-like) [67], Leydig-like клональные клеточные линии, первично культивируемые клетки из E 11.5 гонад [68] существуют и иммортализованные линии гонадных клеток от трансгенных мышей или эмбрионов с избыточной экспрессией SV40 T-антигена. Однако, из-за видо-специфического временного паттерна экспрессии Sry после SD, эти иммортализованные клеточные линии не экспрессируют Sry или др. стадио-специфические факторы, участвующие в дифференцировке семенников. TM3 и TM4 клеточные линии не экспрессируют Sry в долговременных культурах [68, 69]. Использование линий человеческих клеток более желательно, учитывая существенные отличия в белках SRY между мышами и человекам. В самом деле, линия NT2/D1 человеческих мультипотентных тестикулярных эмбриональных клеток карциномы, как было установлено, экспрессирует 35 из 39 специфичных для семенников генов; но гены, такие как WT1 и DAX-1/NR0B1 не экспрессируются и некоторые овариальные гены, такие как Fst, экспрессируются, подтверждая возможность того, что клетки NT2/D1 могут воспроизводить раннюю стадию SD у млекопитающих; однако, необходимы дальнейшие исследования для четкого понимания профиля генной экспрессии в NT2/D1 клетках [70]. Использование клеточных линий, происходящих из опухолей и синдромов, обнаруживающие отличающие профили и регуляцию пол-детерминирующих генов/сетей может предоставить важную альтернативу для понимания развития человеческих гонад.
Недавно Buganim et al. [71] получили индуцированные эмбриональные Сертоли-подобные клетки (ieSCs) путем прямого перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с помощью dox индуцированной экспрессии 5 транскрипционных факторов Nr5a1, Wt1, Gata4, Sox9 и Dmrt1. Эти исследования показали, что экспрессия Nr5a1, Wt1 и Dmrt1 инициирует клеточную пролиферацию и мезенхимно-эпителиальные переход, тогда как Nr5a1, Wt1 и Sox9 индуцируют агрегацию клеток. ieSCs имеют уникальный, но сходный паттерн экспрессии с паттерном с клеткми Сертоли плодов, имеют нормальный кариотип и способны поддерживать жизнеспособность зародышевых клеток в культуре и вносят вклад в in vivo популяции клеток Сертоли. Более того, ieSCs являются мигрирующими эпителиальными клетками, обладающие способностью агрегировать, формировать канальце-подобные структуры и рекрутировать эндотелиальные клетки [71]. Однако, ieSCs не способны расти в течение продолжительного периода в отсутствии dox без потери характеристик клеток Сертоли. Кроме того, маркер клеток Сертоли Fgf9 не экспрессируется на высоком уровне, а экспрессия Sox9 вариабельна в ieSCs. Получение клеточных линий, подобных тем, что воспроизводят аккуратно in vivo процесс развития гонад, открывает не только возможность получения клеточной модели для осуществления биохимических и генетических исследований SD и дифференцировки, но и также DSD.
Хотя ранние генетические и морфологические события во время развития гонад были охарактеризованы, молекулярные механизмы, участвующие в SD человека понятны недостаточно. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) предоставляют практическую систему для прямой дифференцировки индивидуальных специфических клеток в клеточные клоны по выбору. Более того, подходы с транс-дифференцировкой могут открывать альтернативу iPSCs , т.к. они делают возможной превращение детерминированных клеток в клоны по выбору без дополнительных манипуляций, необходимых для их превращения в основное состояние. Разработка новых клеточных моделей, базирующихся на биоматериале от пациентов с DSD и их незатронутых членов семьи позволят лучше понять выбор клетками судеб во время SD, а, следовательно, механизм развития болезней из-за ошибок SD.

M. Elzaiat, A.-L. Todeschini,S. Caburet, R.A. Veitia The genetic make-up of ovarian development and function: the focus on the transcription factor FOXL2. Clin.Gen. Volume 91, Issue 2 " DOI: 10.1111/cge.12862




Overview of follicular development. The main genes implicated in folliculogenesis are represented [120]. Genes expressed in the somatic compartment are shown in orange, oocyte genes are shown in blue. NOBOX is expressed in both somatic and germ cells. FST cellular expression site has not been assigned. AMH, anti-M?llerian hormone; ATM, ataxia telangiectasia mutated; BAX, BCL2-associated X protein; BCL2, B-cell/lymphoma 2; BMP15, bone morphogenic protein 15; EGFR, epidermal growth factor receptor; ESR, estrogen receptor; FIGLA, factor in the germline alpha; FOXL2, Forkhead box L2; FOXO3A, Forkhead box O3; FSHR, follicle-stimulating hormone receptor; FST, follistatin; GDF9, growth differentiation factor 9; GJA1, gap junction protein, alpha 1; INHA, inhibin alpha; KITL, KIT ligand; LHR, luteinizing hormone receptor; NOBOX, newborn ovary homeobox protein; SOHLH, spermatogenesis and oogenesis specific helix loop helix.
У 46 XY индивидов присутствие Y хромосомы, содежащей testis-determining factor (SRY) запускает детерминацию и дифференцировку семенников. У 46 XX индивидов отсутствие SRY и активация генов, ассоциированных с женским путем развития приводит к развитию яичников. Последний процесс длительное время рассматривался как самопроизвольный, воспроизводимый по умолчанию, путь. Однако, недавние исследования поселили сомнения относительно этой догмы. В работе после краткого рассмотрения основных ступеней развития яичников, основное внимание было уделено трем генам WNT4, RSPO1 и FOXL2, важным для детерминации, дифференцировки и/или поддержания яичников. Особе внимание было уделено FOXL2, чти мутации ответственны за синдром blepharophimosis, часто связанного с бесплодием женщин и раком. Была подчеркнута кооперация WNT4, RSPO1 и FOXL2 внутри регуляторной сети.




Model of the genetic networks underlying testis and ovary determination, differentiation and maintenance. In XY individuals, SRY located on the Y chromosome upregulates SOX9 and triggers testis differentiation. In XX individuals, the absence of SRY and the activation of RSPO1, WNT4 and FOXL2 lead to ovarian differentiation. The maintenance of gonadal identity is ensured by a constant repression of the alternative pathway. Notably, FOXL2 represses testis differentiation in the XX gonad, in cooperation with estrogens to inhibit SOX9, or via direct or indirect inhibition of DMRT1, a promising candidate to regulate SOX9.
FOXL2 Играет центральную роль в физиологии гранулярных клеток (GC), как и др. члены этого семейства, такие как FOXO1A и FOXO3A. Мутации у человека показывают, что они перекрываются не полностью. Экспрессия и активность FOXL2 регулируется на транскрипционном и пост-трансляционном уровнях, а их нарушения ответственны за палатологию яичников. Нельзя исключить сущестование регуляторных мутаций, специфически затрагивающих экспрессию FOXL2 в яичниках и которые были бы ответственны за случаи мужских признаков у XX индивидов. FOXL2 взаимодействует с эффекторами нескольких сигнальных путей, результаты таких взаимодействий всё ещё плохо охарактеризованы.
Известно, что клон-детерминирующие транскрипционные факторы не действуют по отдельности и что они часто внедрены в сложные регуляторные сети. Это верно и для FOXL2, взаимодействие которого с передачей сигналов beta-catenin, по-видимому, является очень важным. Центральное положение FOXL2 в поддержании качественных особенностей гранулёзных клеток заставляет обратить особе внимание на его взаимодействие с передачей сигналов estrogen.