Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОК СЕРДЦА



из плюрипотентных стволовых клеток

Probing early heart development to instruct stem cell differentiation strategies
Damelys Calderon, Evan Bardot, Nicole Dubois
Dev.Dyn. Volume 245, Issue 12 December 2016 Pages 1130–1144

Scientists have studied organs and their development for centuries and, along that path, described models and mechanisms explaining the developmental principles of organogenesis. In particular, with respect to the heart, new fundamental discoveries are reported continuously that keep changing the way we think about early cardiac development. These discoveries are driven by the need to answer long-standing questions regarding the origin of the earliest cells specified to the cardiac lineage, the differentiation potential of distinct cardiac progenitor cells, and, very importantly, the molecular mechanisms underlying these specification events. As evidenced by numerous examples, the wealth of developmental knowledge collected over the years has had an invaluable impact on establishing efficient strategies to generate cardiovascular cell types ex vivo, from either pluripotent stem cells or via direct reprogramming approaches. The ability to generate functional cardiovascular cells in an efficient and reliable manner will contribute to therapeutic strategies aimed at alleviating the increasing burden of cardiovascular disease and morbidity. Here we will discuss the recent discoveries in the field of cardiac progenitor biology and their translation to the pluripotent stem cell model to illustrate how developmental concepts have instructed regenerative model systems in the past and promise to do so in the future. Developmental Dynamics 245:1130-1144, 2016. © 2016 Wiley Periodicals, Inc.
Наше понимание того, как формируется 4-камерное сердце, серьезно продвинулось (Vincent and Buckingham, 2010; Meilhac et al., 2015). Главное недавнее открытие заключается в описании популяции предшественников с разными вкладами в сердце; выяснение клонального потенциала индивидуальных предшественников в ходе развития сердца; изучение лежащих в основе молекулярных механизмов спецификации клеточных судеб; и более формальные демонстрации, что спецификация сердечно-сосудистого клона происходит очень рано в развитии.
Сначала исследования развития сердца открыли дорогу для лучшего понимания врожденных пороков развития (Bruneau, 2008). Во-вторых, подходы по дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток (PSC) , а также стратегии по прямому репрограммированию в основном базируются на разработке концепции, которая предоставляет информацию о критических регуляторных механизмах, необходимых для образования кардиальных клеток и структур. Наконец, регенеративные подходы ко взрослому сердцу часто определяются свойствами и механизмами развития кардиальных клонов (Xin, Olson, and Bassel-Duby, 2013). Сердце взрослого человека является одним из органов с минимальной регенерацией, при очень ограниченной способности обновления сердечной ткани, необходимо знаать доступные источники, способные увеличить работоспособность сердца. Поэтому многие типы клеток были изучены в отношении их потенциала улучшать функцию сердца после повреждения, велючая мезенхимные стволовые клетки, гематопоэтические клетки и клетки миобластов. Наблюдаемые эффекты улучшения были преходящими и прежде всего базировались на паракринных эффектах, чем на интеграции новых клеток в сердце. Дифференцировка PSC и непосредственное репрограммирование появились как многообещающие технологии, нацеленные на эти проблемы; но оба подхода имеют узкое горлышко на пути достижения успеха в сердце паиентов. Все эти проблемы рассмотрены в нескольких обзорах (Qian and Srivastava, 2013; Nam, Song, and Olson, 2013; Foglia and Poss, 2016; Xiao et al., 2016).
Главной проблемой системы PSC становится генерация, увеличение и поддержание популяций предшественников; спецификация определенных подтипов сердечно-сосудистых клеток; и созревание клеток в культуре.

The Pluripotent Stem Cell Differentiation System: a Brief Overview of the Accomplishments and Current Challenges


Потенциал PSCs давать какой-либо тип клеток в нашем теле давно известен. В ходе последних лет генерация human PSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) эволюционировала от первоначально неэффективного базирующегося на сывортоке протокола дифференцировки к сегодняшним мощным стратегиям, дающим почти чистые культуры кардиомиоцитов (Kehat et al., 2001; Yang et al., 2008; Kattman et al., 2011; Lian et al., 2013; Burridge et al., 2014; Karakikes et al., 2014; Aguilar et al., 2015; Hwang et al., 2015). Важно отметить, что критические улучшения, сделавшие возможным прогресс, базировались на концепции репродукции развития в культуре, ведения клеток по их натуральному пути развития зависимым от времени и передачи сигналов способом.
Посредством оценки популяции PSC-CM было установлено, что популяция этих клеток гетерогенна и незрелая по природе. Электрофизиологическая оценка показала, что hPSC-CMs, продуцируемые посредством современного протокола, составляют смешанную популяцию разных подтипов кардиомиоцитов (atrial, ventricular и nodal-подобные клетки) (Maltsev et al., 1993), и что их характеристики остаются сходными с плодными кардиомиоцитами. Это в дальнейшем было подтверждено путем сравнения транскрипции и функциональные оценок, продемонстрировавших, что Ca2+-обеспечиваемые свойства PSC-CMs напоминают таковые плодных кардиомиоцитов человека (van den Berg et al., 2015) (16-18 недель беременности) и существенно отличаются от таковых у кардиомиоцитов взрослых (Liu et al., 2009; Liu et al., 2007; Satin et al., 2008). Несмотря на многие попытки очистить современные протоколы, осталось не совсем ясно, как функционально зрелые клетки четырехкамерного сердца могут возникать из PSCs. Преодоление этих препятствий стало критическим для исследований по трансплантациям, когда трансплантируемая смесь произошедших из PSC культур приводила к аритмиям (Chong et al., 2014), также как и подходы по моделированию болезней из induced pluripotent stem cells (iPSCs), когда кардиальные фенотипы, проявляющиеся позднее в жизни не могли быть воспроизведены в незрелых клетках.

Generating Cardiac Progenitor Populations From PSCs


Один из многообещающих подходов по спецификации клонов из PSCs состоит из изучения источника индивидуальных клонов и, следовательно, соотв. их популяций предшественников. Популяции предшественников, которые вносят вклад в развитие сердца, по прошествии времени состоят из популяции кардиальной мезодермы (вскоре после гаструляции, вносящей вклад во все клетки сердца), клеток первичного и вторичного поля сердца (FHF/SHF) (на стадии кардиального полумесяца; FHF: левый желудочек, часть правого желудочка, большинство, большая часть обоих предсердий; SHF: большая часть правого желудочка, часть обоих предсердий, тракт оттока), proepicardial organ (PEO) (стадия ранней сердечной трубки, вносит вклад в эпикард и происходящие из эпикарда клетки), и cardiac neural crest cells (cNCC) (ранняя сердечная трубка, вносит вклад в клапаны и гладкомышечные клетки тракта оттока). Идентификация и генерация разных популяций сердечно-сосудистых предшественников in vitro делает возможным исследования сигнальных путей и молекулярных механизмов, которые играют роль во время из спецификации, чтобы предопределить сердечно-сосудистые клоны, а также генерировать чистые популяции из разных типов клеток сердца.

Mesoderm progenitor cells


Mesp1 является жизненно важным транскрипционным фактором, широко экспрессируемым в латеральной пластинке мезодермы, из которой возникают кардиальная мезодерма и впоследствии большая часть сердечно-сосудистых клеток во время развития (Devine et al., 2014; Saga et al., 1999; Bondue et al., 2008; Lescroart et al., 2014). В качестве таковой она становится ключевой мишенью множества попыток понять самые ранние события спецификации сердечно-сосудистого клона. Напр., первое проспективное мечение кардиальных предшественников с использованием маркеров было проведено с использованием отслеживания Mesp1-управляемого клона (Saga et al., 1999). Экспрессия Mesp1, как было установлено с помощью Mesp1-lacZ, ограничена регионом первичной полоски (primitive streak; PS) и вновь формируемая мезодерма и регионы, отслеживаемые с помощью метки Mesp1-Cre, включали кранио-кардиальную мезодерму. Спустя 15 лет после этого первоначального открытия два независимых исследования исследовали далее спецификацию и вклад индивидуальных Mesp1 клеток предшественников и пришли к выводу, что эти клетки во время гаструляции ограничиваются клонами или FHF, или SHF (Lescroart et al., 2014; Devine et al., 2014). Поскольку было установлено, что Eomes непосредственно индуцирует экспрессию Mesp1 в презумптивной кардиальной мезодерме, то широкий набор мезодермальных тканей, происходящих из клеток, экспрессирующих Eomes показал, что он не действует как особый кардиальный регулятор (Costello et al., 2011). Принимая во внимание раннюю спецификацию Mesp1+ клеток, которые, скорее всего, еще полностью не детерминированы, это подтверждается наблюдением, что висцеральная энтодерма необходима для формирования фокусов сокращений из культивируемых мезодермальных эксплантов (Arai, Yamamoto, and Toyama, 1997).
Эти находки оказались очень ценными для нашего знания потенциала дифференцировки мезодермальных клеток предшественников и предоставили фундаментальные инструменты для изучения нижестоящих событий спецификации. Работа с системой mESC существенно расширила наши знания о действии Mesp1 на молекулярном уровне и показала, что Mesp1 индуцирует экспрессию кардиальных транскрипционных факторов, тогда как репрессирует позитивные регуляторы др. клеточных судеб (Bondue et al., 2008; Bondue et al., 2011). В системе PSC человека MESP1+ клетки были изолированы и охарактеризованы во время дифференцировки с использованием двойной MESP1mCherry/NKX2-5eGFP репортерной линии. Её производные составляют популяцию, обогащенную клетками, экспрессирующими NKX2-5 и Troponin T, указывающими на предпочтительную дифференцировку в кардиомиоциты. Получена также небольшая фракция гладкомышечных и эндотелиальных клеток, это согласуется с данными на мышах, демонстрирующих, что Mesp1+ клетки вносят вклад в эти клоны (Den Hartogh et al., 2015; Saga et al., 1999).

Cardiac mesoderm progenitor cells


Во время и сразу после гаструляции популяции кардиальной мезодермы характеризуются экспрессией специфического гена и белка клеточной поверхности. Домены экспрессии Pdgfra, Kdr (известен также как Vegfr2 или Flk1) (Yamaguchi et al., 1993), и cKit были продемонстрированы как отличительные признаки мезодермальных популяций у мышей. Kdr является одним из самых ранних распространенных маркеров мезодермальной дифференцировки для сосудистого эндотелия и гематопоэтических клеток, а Pdgfra экспрессируется в большинстве мезодермальных клеток эмбриона; однако, только одновременная экспрессия Kdr и Pdgfra характеризует популяцию мезодермы, специфицированную стать кардиальным клоном (Kataoka et al., 1997). Pdgfra+Kdr+ клетки, отсортированные из эмбрионов мышей или из мышиных PSC, эффективно дифференцируются в сердечно-сосудистые клетки, что подтверждено их детерминацией в кардиальный клон (Kataoka et al., 1997; Kattman, Huber, and Keller, 2006; Kattman et al., 2011). Эта стратегия недавно была перенесена на дифференцировку PSC человека, при этом экспрессия KDR и PDGFRA определяла кардиальную мезодерму, т.е. популяцию, которая эффективно дифференцируется в клетки сердечно-сосудистого клона (Kattman et al., 2011; Yang et al., 2008). KDR+/PDGFRA+ происходящие из PSC клетки обогащены экспрессией ISL1 и являются мультипотентными, на что указывает их потенциал дифференцировки в три клона, кардиомиоцитов, эндотелиальные и гладкомышечные клетки (Kattman et al., 2011). Недавние исследования получили преимущества своей способностью генерировать определенные и онтогенетически ранние популяции кардиальных клеток in vitro для изучения эпигенетической регуляции кардиальной спецификации и привели к открытию детальных сетей регуляторных генов для детерминации сердечно-сосудистых клонов (Paige et al., 2012; Wamstad et al., 2012).
Были идентифицированы receptor tyrosine kinase-like orphan receptor семейство (ROR2) и aminopeptidase-N (CD13) в качестве дополнительных маркеров клеточной поверхности, которые часто встречаются на мезодермальных предшественниках (Drukker et al., 2012) и была повышено временное разрешение предшественников детерминированных клонов, возникающих во время кардиальной дифференцировки hPSC. CD13 и ROR2 экспрессируются в MESP1+ клетках, указывая на то, что комбинация этих маркеров характеризует раннюю мезодермальную популяцию, которая, скорее всего, предшествует KDR+PDGFRA+ мезодерме (Den Hartogh et al., 2015). Будучи трансплантированными в сердце мышей клетки CD13+ROR2+ дифференцируются в кардиомиоциты, фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки, представляя тем самым популяцию сердечно-сосудистых предшественников с потенциалом мультиклональной дифференцировки (Skelton et al., 2016). Принимая во внимание этот потенциал, популяции ранних сердечно-сосудистых предшественников вселяют огромные надежды в качестве потенциального источника клеток для регенеративного клеточного замещения, что подтверждается успешными трансплантациями CD13+ROR2+ клеток в крупных животных (Skelton et al., 2016).

ISLET1/NKX2-5 progenitor cells


После того как клетки кардиальной мезодермы покидают PS, они мигрируют на переднюю сторону эмбриона и организуются в структуру, наз. кардиальным серпом на ст. E8.0 (Buckingham, Meilhac, and Zaffran, 2005; Camp and Munsterberg, 2011; Zhen et al., 2012). Последние работы со многими модельными системами существенно продвинули наши знания клеток предшественников внутри кардиального серпа, это привело к пересмотру простой модели линейной трубки и к выявлению первого и второго полей сердца. Базируясь на этой модели, клетки FHF и SHF дают большую часть миокарда сердца, при этом левый желудочек, большая часть предсердий и часть правого желудочка возникают из FHF; а SHF дает правый желудочек, тракт оттока и часть предсердий (Fig. 1a) (Kelly, Brown, and Buckingham, 2001; Cai et al., 2003; Zaffran et al., 2004; Yamagishi et al., 2001; Srivastava et al., 1997; Hami et al., 2011; Yuan and Schoenwolf, 2000).

Figure 1. Schematic illustration of early heart development as translated to PSC differentiations to the cardiovascular lineages. A: Specification and differentiation of cardiac precursors during development of the mouse embryo. Cardiac progenitors are first specified at gastrulation in a manner that is both temporally and spatially relevant. The first population to ingress (blue) will migrate anteriorly and establish the cardiac crescent. The cells that migrate later can be divided in an anterior-posterior manner, with the anterior-most (red) proceeding to the anterior region of the anterior heart field. Cells that ingress more posteriorly (purple) will form the posterior heart field. BMP, FGF, and Wnt consist of the key signaling pathways that regulate early cardiogenesis. Upon formation of the primitive heart tube, the most anterior populations, which will have entered the tube first, will take up residence in the prospective ventricular areas, while the posterior heart field continues to feed cells into the heart tube. These cells will contribute to the atria and outflow tract of the fully differentiated heart. Endocardium and epicardial cells actively influence the process of specification, trabeculation, and compaction of the myocardium mainly through activation of the Notch, BMP, EGF, and retinoic acid signaling pathways. B: PSC differentiation recapitulates cardiogenesis in the embryo. Most of the signaling pathways involved in heart development in vivo are equally critical in vitro to achieve generation of human cardiomyocytes. Manipulation of the signaling pathways in black has been described in the human system to be required to induce differentiation of PSCs to cardiac progenitors, cardiomyocytes, epicardial cells, smooth muscle cells, and endothelial cells. Signaling pathways in blue represent observations made in the embryo but not yet studied in the PSC system.

Клетки FHF, как известно, специфически экспрессируют Tbx5 и Hcn4, а отслеживание клонов с использованием Hcn4-Cre драйвера демонстрируют специфический вклад в левый желудочек (Bruneau et al., 2001; Spater et al., 2013; Liang et al., 2013). SHF expresses high levels of экспрессирует высокие уровни Isl1, который активно используется для отслеживания клонов и анализа производных SHF во многих модельных системах (Cai et al., 2003; Yuan and Schoenwolf, 2000; Hami et al., 2011). Эти данные были в дальнейшем подкреплены наблюдением за энхансерным регионом гена Mef2c, который активен в SHF и может быть индуцирован с помощью Isl1 (Dodou et al., 2004; Verzi et al., 2005). Однако, отслеживание клонов с помощью Isl1-Cre с помощью более чувствительной репортерной системы подтвердило широкую экспрессию Isl1, возможно включая производные FHF (Ma, Zhou, and Pu, 2008). Т.о., возможно, что некоторые молекулярные различия, наблюдаемые между полями сердца, являются результатом ограниченного пространственно-временного разрешения, присущего эмбриональным исследованиям и что поля сердца отражают временную ступень во время перехода от предшественников, специфицированных во время гаструляции к дифференцированным клеткам сердечной трубки. По этим причинам попытки воспроизведения ступеней развития, чтобы сгенерировать клетки FHF и SHF в культуре, делают довольно маловероятным, что они могут служить в качестве самостоятельных популяций предшественников, а скорее их следует рассматривать последовательно возникающие популяции во время кардиальной дифференцировки.
В соответствии с этой идеей помимо присутствия маркеров для SHF клеток на стадии кардиального серпа, хорошо известно, что Isl1 экспрессируется на высоком уровне в пролиферирующих клетках и что его экспрессия подавляется, когда клетки вступают в сердечную трубку и дифференцируются (Cai et al., 2003), указывая, что Isl1 регулирует пролиферацию, экспансию и миграцию сердечно-сосудистых предшественников. Недавняя работа продемонстрировала, что Nkx2-5 непосредственно соединяется с Isl1 энхансером и репрессируют транскрипционную активность Isl1 (Dorn et al., 2015), подтверждая последовательную необходимость в этих факторах во время экспансии и дифференцировки предшественников. Во время миграции в сердечную трубку субнабор клеток усиливает экспрессию атипичного гомеодоменовго белка Hopx, который детерминирует клетки к выбору судьбы кардиомиобластов посредством интеграции передачи сигналов BMP и Wnt (Jain et al., 2015). Hopx+ клетки увеличиваются в количестве непосредственно перед дифференцировкой, принимая судьбы кардиомиоцитов, и располагаются в миокарде. Благодаря своей перспективной двойственности, как клон-детерминированных подобных предшественникам, и как пролиферативных клеток, делались попытки в PSC полк воспроизвести эти промежуточные популяции в культуре.
Для достижения этой цели была создана первая линия репортерных PSC клеток человека с NKX2-5-GFP (Elliott et al., 2011). Эта репортерная линия стала новым инструментом по изучению стратегий дифференцировки и кардиальной физиологии (Elliott et al., 2011; Skelton et al., 2014; Dubois et al., 2011; Kempf et al., 2014; Birket et al., 2013). Более того, она облегчила выделение и характеристику NKX2-5+ клеток предшественников, а также более дифференцированных кардиомиоцитов из PSC differentiations. Это впервые предоставило возможность изучения происходящих из PSC кардиомиоцитов человека в деталях.
Чтобы специфически сгенерировать SHF клетки предшественники, была использована Isl1-nlacZ knock-in mES клеточная линия, для успешного выделения и экспансии Isl1+ кардиальных предшественников in vitro , а их клональный анализ выявил мультипотентную способность этих клеток (Moretti et al., 2006). Сходная популяция была выделена с использованием ISL1-βgeo бактериальных искусственных хромосом (BAC) или отслеживающих клоны линии человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC). Эти ISL1+ сердечно-сосудистые предшественники давали клоны кардиомиоцитов, гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток in vitro (Bu et al., 2009).
Информация об онтогенетических модельных системах продолжает подчеркивать важность корректного определения ранних популяций предшественников для развития сердца. Несколько исследований продемонстрировали, что разные популяции предшественников, идентифицированные in vitro могут быть сгенерированы и выделены во время дифференцировки PSC в культуре, помогая улучшить протокол дифференцировки для генерации отдельных типов сердечно-сосудистых клеток.

Cardiac progenitor proliferation


Помимо генерации чистых и функциональных популяций из PSCs, параллельной задачей является генерация больших количеств клеток для будущих стратегий по клеточному замещению. Дифференцированные кардиомиоциты из PSCs, подобно их аналогам в сердце, обладают очень ограниченной способностью к пролиферации. Следовательно, пролиферативные клетки предшественники, представленные детерминированными клонами, являются идеальной популяцией мишенью для таких стратегий. В противоположность популяциям предшественников из энтодермальных и эктодермальных клонов (Cheng et al., 2012; Ziegler et al., 2014), были предложены протоколы по увеличению определенных клеток кардиальных предшественников, в основном на базе сигнальных путей, идентифицированных по их связи с пролиферацией кардиальных предшественников in vivo (Zhang et al., 2016; Lalit et al., 2016; Birket et al., 2015; Bu et al., 2009).
У модельных животных путь передачи сигналов Wnt/β-catenin широко используется в раннем кардиальном развитии и росте (Bejsovec, 2005; Clevers, 2006; Tzahor, 2007). В эмбриональном развитии мышей и человека Wnt обнаруживает высоко стадио-специфические эффекты на спецификацию мезодермальных и кардиальных предшественников. Передача сигналов Wnt необходима для образования PS (Haegel et al., 1995; Rivera-Perez and Magnuson, 2005; Barrow et al., 2007), тогда как позднее во время развития ингибирование Wnt необходимо для спецификации мезодермальных предшественников в кардиальные предшественники (Schneider and Mercola, 2001; Rivera-Perez and Magnuson, 2005). Инактивация β-catenin в мультипотентных Isl1 клетках предшественниках приводит к частичной потере этой популяции во время эмбрионального развития (E7.0-E9.5), тогда как постоянная экспрессия β-catenin в этих мультипотентных предшественниках приводит к экспансии (Ai et al., 2007; Cohen et al., 2007; Kwon et al., 2007; Qyang et al., 2007; Bu et al., 2009). Недавно получены мутации специфичного для кардиомиоцитов β-catenin с потерей или избыточной функцией, подтвердившие, что пролиферация вентрикулярных миоцитов контролируется с помощью β-catenin во время развития и перинатального периода (Buikema et al., 2013).
Во время дифференцировки мышиных PSC активация путей Wnt и JAK/STAT (BIO, LIF) или использование коктейля из BACS (BMP4, Activin A, CHIR99021 и SU5402), как было установлено, способствует экспансии индуцированных кардиальных предшественников ьез изменения их потенциала дифференцировки in vitro или in vivo (Zhang et al., 2016; Lalit et al., 2016). Сходные результаты описаны с использованием происходящих из hPSC кардиальных предшественников. Экспансия ISL1+ клеток была достигнута путем совместного культивирования клеток с питающими клетками, секретирующими Wnt3a или путем обработки клеток с помощью BIO (Bu et al., 2009), тогда как экспансия мезодермальных SSEA1 предшественников была достигнута путем манипуляций с путями Wnt, BMP и Activin/Nodal (Cao et al., 2013), снова воспроизводя концепции развития, описанные in vivo. В то время как отсутствие отражения процессов in vivo избыточной экспрессии онкогена c-myc в присутствии IGF1, Hedgehog активаторов, TGF-β/Activin/BMP ингибиторов и bFGF было продемонстрировано при аресте кардиальных предшественников на pre-NKX2-5+ мультипотентной стадии и при облегчении их экспансии (Birket et al., 2015). Итак, эти данные демонстрируют, что экспансия происходящих из PSC клеток кардиальных предшественников возможна и что стратегии могут варьировать в зависимости от стадии развития популяции индивидуальных предшественников. Однако, активация канонического пути передачи сигналов Wnt, по-видимому, является общераспространенным критическим фактором, необходимым для экспансии всех кардиальных предшественников, это наблюдается в разных модельных системах in vivo . Дополнительные механизмы, такие как VCAM-1 (Kwee et al., 1995), α-integrin (Yang, Rayburn, and Hynes, 1995) и передача сигналов Jak2/Stat3 (Marrero et al., 1998; Liu et al., 2015) , как полагают, влияют на пролиферацию кардиомиоцитов.
В качестве альтернативы пролиферации клеток кардиальных предшественников можно предложить значительные знания о кардиальной регенерации в миокарда взрослых по индукции пролиферации в дифференцированных кардиомиоцитах. Поскольку этот процесс считается менее эффективным в клетках мышей и человека, то информация о высоко регенеративных модельных рыбках данио может представить интересных кандидатов и подходы (Garry et al., 2005; Foglia and Poss, 2016).

Generating Cardiovascular Lineages of the Differentiated Heart


Одной из главных надежд по генерации и изучению сердечно-сосудистых предшественников в культуре является их потенциал дифференцироваться во множественные клоны сердца (кардиомиоциты, гладкомышечные клетки, фибробласты эндотелиальные клетки и эпикард). Как регенеративные стратегии, так и подходы по моделированию болезней, являются критическими для генерации чистых, определенных и функциональных клеток сердечно-сосудистого клона. Это обеспечивает надежность и эффективность трансплантаций определенных функциональных клеток в сердце крупных животных и человека, но также позволяет понять механизмы болезней зависимым от клеток способом. Главный прогресс был достигнут в воспроизведении клон-специфической дифференцировки в культуре.

Myocardium


Генерация сокращающихся клеток из PSCs в культуре стала стандартной процедурой во многих лабораториях; однако, сердце состоит из разных типов миокардиальных клеток, включая предсердные и вентрикулярные кардиомиоциты и клетки проводящей системы.
В работающем миокарде предсердные и вентрикуляные кардиомиоциты отличаются по морфологическим, молекулярным и физиологическим свойствам (Wagner et al., 2014; Volkova, Drapkina, and Ivashkin, 2006; Walden, Dibb, and Trafford, 2009), пока механизмы их спецификации плохо понятны, а их источник не может быть приписан исключительно какой-то из ранее охарактеризованных популяций предшественников. Недостаток механистической информации об этом процессе делает их специфическую генерации в культуре особенно загадочной. Базируясь на электрофизиологическом анализе выявляются клеток, похожие на предсердные или вентрикулярные, в культурах с помощью современных протоколов дифференцировки, но их соотношение варьирует и их выделение и характеристика удаются не столь широко (Josowitz et al., 2014). Выделение субтипов кардиомиоцитов затруднено из-за отсутствия специфических поверхностных маркеров. Разрабатываются новые подходы по очистке клеток с помощью целенаправленного воздействия мРНК с молекулярными метками. Используя подобные подходы, были выделены вентрикулярные кардиомиоциты с помощью IRX4 молекулярных меток (Ban et al., 2015). Хотя этот подход не является идеальным для клинического использования, такие изолированные вентрикулярные клетки могут быть использованы для моделирования болезни или разработки лекарств.
Специфичная для типов клеток экспрессия может быть связана с соотв. механизмами спецификации миокардиальных подтипов; однако, большинство камер-специфичных генов экспрессируется униформно по всей ранней сердечной трубке и не обнаруживают регион-специфичной экспрессии на ранних стадиях кардиогенеза млекопитающих (De Groot et al., 1989; Sassoon et al., 1988; Lyons et al., 1990; Lyons, 1994). Экспрессия Irx4 и Mlc2v ограничивается вентрикулярным сегментом линейной сердечной трубки перед образованием определенных камер серца (O'Brien, Lee, and Chien, 1993; Bruneau et al., 2000; Christoffels et al., 2000). Irx4-дефицитные сердца подтверждают, что хотя Irx4 не обязателен для образования вентрикулярных камер, но он необходим для становления некоторых из компонентов специфичной для желудочков программы генной экспрессии (Bruneau et al., 2001).
Mef2c и Hand2 играют важную роль в образовании желудочков сердца. Mef2c- и Hand2-нулевые эмбрионы имеют одиночную гипопластичную вентрикулярную камеру на ст. E9.5 и погибают от сердечной недостаточности на ст. E10. Однако, Mlc2v и Mlc2a были соотв. образом локализованы и обнаруживали нормальные уровни экспрессии, указывая тем самым, что спецификация предсердия-желудочки не изменена. Скорее всего, Mef2c и Hand2, как полагают, контролируют развитие правого желудочка путем спецификации субпопуляции кардиогенных клеток внутри сердечной трубки и путем регуляции экспансии и жизнеспособности этой популяции (Lin et al., 1997; Srivastava et al., 1997; Tsuchihashi et al., 2011). Контролируемая экспрессия Hand1 в левом желудочке также важна собственно для развития желудочков, на что указывают нарушение образования перегородки между желудочками и слабое развитие миокарда компактной зоны у Hand1/eHand knock-in эмбрионов. Однако, Hand1 не является главным регулятором спецификации желудочков-предсердий (Togi et al., 2004).
В терминах передачи сигналов путь ретиноевой кислоты (RA), как полагают, обладает камер-специфическим регуляторным потенциалом в отношении развития предсердий-желудочков (Xavier-Neto et al., 1999; Moss et al., 1998; Niederreither et al., 2001; Xavier-Neto et al., 2000). Передача сигналов RA необходима для развития предсердий, но не для генерации клеток желудочков у эмбрионов. В частности, работа с использованием RAREhsplacZ трансгенных мышей, у которых lacZ экспрессировался в ответ на RA, продемонстрировала, что экспрессия фермента retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2) локализуется в том же месте, что и эндогенный ответ на RA в сино-атриальной ткани со ст. E8.25 по E12.5, тогда как вентрикулярная ткань остается лишенной метаболизма RA вплоть до E12.5. Исходя из этих данных, было установлено, что экспрессия RALDH2 является надежным показателем синтеза RA в развивающемся сердце, а его раннее ограничение сино-атриальной структурой подтверждает, что передача сигналов RA участвует в спецификации кардиальных клеток (Moss et al., 1998). Более того, блокирование синтеза RA на ст. E7.5 вызывает отсутствие в сердце каер предсердий, а подавление RA в вентрикулярных предшественниках достаточно для корректной спецификации желудочков (Xavier-Neto et al., 1999).
Некоторые исследования недавно перенесли эту концепцию на PSC систему и продемонстрировали, что воздействие на клетки RA во время образования мезодермы увеличивает число атриальных клеток в культуре (Devalla et al., 2015; Zhang et al., 2011; Gassanov et al., 2008). Определение профиля экспрессии генов продемонстрировало усиление активности специфичных для предсердий транскриптов. таких как COUP-TFII, SLN, NPPA и PITX2 одновременно с подавлением вентрикулярных транскриптов, таких как HAND1, HEY2, IRX4 и MYL2 (Devalla et al., 2015). Механистически индукция пути передачи сигналов RA in vitro, по-видимому, изменяет активность передачи сигналов Wnt. В частности, RA усиливает экспрессию лигандов и рецепторов не канонического пути Wnt (Wnt5a, 7a, Fzd2 и Fzd6), при этом одновременно подавляется канонический путь (Osei-Sarfo and Gudas, 2014), это может действовать синергично с Wnt ингибиторами. чтобы индуцировать кардиальную мезодерму.
Манипуляции с путями передачи сигналов RA и WNT представляют собой многообещающий старт по спецификации подтипов кардиомиоцитов; однако, дополнительные сигнальные пути или регуляторные механизмы, скорее всего, участвуют в спецификации и дифференцировке камер-специфичного миокарда. Исследования рыбок данио показали, что подавление передачи сигналов BMP во время спецификации кардиальных предшественников приводит к значительной редукции размеров предсердий, не влияя на желудочки, указывая на передачу сигналов BMP как потенциальные регулятор пропорциональности камер. Однако, дифференциальное воздействие только BMPs опять же недостаточно для формирования паттерна униформного поля предшественников в атриальные и вентрикулярные популяции (Marques and Yelon, 2009). Передача сигналов FGF способствует пролиферации вентрикулярных миоцитов в сердце рыбок данио (Marques et al., 2008; Reifers et al., 2000). Эксперименты с использованием разных conditional Fgf8 мутантных аллелей выявили потребность в передаче сигналов Fgf8 на стадии серпа, подтверждая участие в образовании сердечной трубки, правого желудочка и тракта оттока, а также в образовании петель сердца. Ранняя потеря Fgf8 влияет на образование желудочков и предсердий (Park et al., 2006). В соответствии с этими находками, использование экзогенных FGF2 или FGF4 у эмбрионов кур способствовало экспрессии гена ventricular myosin heavy chain 1 (VMHC1) и снижению экспрессии atrial myosin heavy chain (AMHC1) (Lopez-Sanchez et al., 2002).
Вскоре после образования петель сердечной трубки камеры желудочков начинают увеличиваться и подвергаются трабекуляции, процессу, необходимому для развития стенки желудочков полной толщины и для формирования камер. Поскольку относительно мало известно о механизмах трабекуляции, анализ с помощью многоцветных клонов у рыб подтвердил, что структура взрослых желудочков определяется сильной структурно регулируемой экспансией определенным образом расположенных кардиальных клеток на клональном уровне (Gupta and Poss, 2012). Сходные исследования на мышах подтвердили эту концепцию и показали, что вентрикулярные трабекулы являются высоко клональными и часто отделены от соседней стенки желудочка (Chabab et al., 2016; Gupta and Poss, 2012). Понимание в деталях лежащих в основе механизмов морфогенеза желудочков может внести вклад в стратегии по генерации зрелых дифференцированных вентрикулярных кардиомиоцитов из PSCs.
Механистически, передача сигналов Notch выполняет выдающуюся роль во время трабекуляции путем координации взаимодействий между вентрикулярным эндокардом и миокардом (Grego-Bessa et al., 2007). Активная передача сигналов Notch1 обнаруживается по всему вентрикулярному эндокарду в течение 4-х ч после начала сокращений, и активация Notch1 индуцирует экспрессию своих нижестоящих эффекторов ephrin b2a (efnb2a) и neuregulin 1 (nrg1) в эндокарде (Samsa et al., 2015; Grego-Bessa et al., 2007). Мыши, лишенные ephrin-B2 обнаруживают дефекты сердца на ст. E10, в частности отсутствие удлинения миокардиальных трабекул (Wang, Chen, and Anderson, 1998). Nrg1 может осуществлять свой эффект посредством семейства ErbB тирозин киназных рецепторов (ErbB2, ErbB3 и ErbB4) (Yarden, 2001). Соответственно, мутации в Nrg1 вызывают сходные дефекты в сердце по сравнению с сердцем с потерей функции ephrin-B2 (Meyer and Birchmeier, 1995). Интересно, что экспрессия ephrin-B2 и ephirin-B4 в дифференцированном сердце обнаруживается на значительно более высоком уровне в предсердных, чем вентрикулярных эндокардиальных клетках выстилки трабекулярных разрастаний миокарда (Wang, Chen, and Anderson, 1998), подтверждая роль передачи сигналов ephrin, которая не ограничивается определенными камерами. Однако, ErbB2 и ErbB4 экспрессируются в вентрикулярных миоцитах, на нарушения ErbB2 или ErbB4 у мышей приводят к эмбриональной летальности на ст. E9-E10 из-за множественных дефектов, включая отсутствие трабекуляции желудочков (Gassmann et al., 1995; Lee et al., 1995). Напротив, ErbB3-нулевые мыши демонстрируют нормальную трабекуляцию, но обнаруживают дефекты в формировании эндокардиальных подушек, что также приводит к эмбриональной летальности на ст. E13.5 (Erickson et al., 1997). Некоторые исследования выявили роль ephrin или связанных с ephrin сигнальных механизмов во время дифференцировки PSC. Дифференцировка EGFR-дефицитных ESCs приводит к генерации кардиальных и скелетных мышц, как предпочтительных типов дифференцированных клеток in vitro, тогда как др. типы клеток не часты или отсутствуют, указывая тем самым, что активность EGFR не обязательна для формирования кардиальных и скелетных мышц или энтодермы (Wu and Adamson, 1996). Однако, было предположено, что NRG-1 способствует дифференцировке кардиомиоцитов из ESCs и что передача сигналов ErbB/PI3K/Akt указывает на лежащие в основе молекулярные механизмы (Wang et al., 2009). В соответствии с этим подавление ErbB рецептора в ESCs снижает частоту кардиомиоцитов и уровни транскриптов кардиальных генов (Nkx2.5, β-MHC, cTnI и MLC2a) (Kim et al., 2007).
По мере дифференцировки миокардиальных клонов у эмбрионов, постепенно теряется их пролиферативный потенциал. Понимание, какие механизмы поддерживают пролиферативный статус ранних кардиомиоцитов, очень важно для переноса на системы дифференцировки in vitro, т.к. это могло бы обеспечить умножение происходящих из PSC кардиомиоцитов перед их терминальной дифференцировкой. Bmp10, по-видимому, является критическим для поддержания пролиферативной активности эмбриональных кардиомиоцитов в развивающихся желудочках на ст. E8.75-E9.0 путем предупреждения преждевременной активации негативного регулятора клеточного цикла p57kip2 и путем поддержания необходимого уровня экспрессии Nkx2-5 и Mef2c (Chen et al., 2004). Более того, мутантные мыши, дефицитные по FK506 binding protein 12 (FKBP12), активируют экспрессию Bmp10 в трабекулярном миокарде, делая этих мышей нежизнеспособными из-за избыточной продукции вентрикулярных трабекул (Shou et al., 1998). Интересно, что RBPJk и Notch1 мутантные мыши обнаруживают снижение активности BMP10 в желудочках и клетки преждевременно выходят из клеточного цикла, демонстрируя, что Notch и Bmp10 взаимодействуют во время кардиогенеза (Grego-Bessa et al., 2007).
Помимо эндокарда, паракринная передача сигналов от эпикарда также необходима для морфогенеза сердца. В частности, мутации гена RXRα (RA рецептора) в разных кардиальных клеточных клонах, включая нервный гребень, эндотелий, вентрикулярные миоциты ил комбинацию нервного гребня и эндотелия, не вызывали середечно-сосудистых фенотипических отклонений (Chen, Kubalak, and Chien, 1998; Tran and Sucov, 1998; Merki et al., 2005). Напротив, мутации RXRα в эпикарде вызывали образование желудочков с тонкими стенками, указывая, что толщина миокарда предопределяется зависимыми от ретиноидов сигналами, исходящими от эпикарда (Stuckmann, Evans, and Lassar, 2003; Merki et al., 2005). Происходящие из эпикарда митогены, ответственные за влияние эпикарда на пролиферацию компактных мышц или компакцию, трудно идентифицировать. Среди предыдущих открытий, ингибирование передачи сигналов или RA или erythropoietin (epo) из эпикарда ингибировало пролиферацию и жизнеспособность кардиальных миоцитов (Stuckmann, Evans, and Lassar, 2003; Merki et al., 2005).
Итак, спецификация камер и созревание миокардиальных клонов было изучено на многочисленных модельных системах, что привело к более глубокому пониманию многих процессов in vivo. Затруднения в направлении дифференцировки PSC в направлении специфичных и функциональных типов клеток сегодня согласуется со становлением комплексных подходов к воспроизведению соотв. аспектов спецификации судеб кардиальных клеток и дифференцировки in vitro.

Conduction system


Проводящая система сердца (CCS) представлена несколькими самостоятельными типами клеток, включая сино-атриальные и атриовентрикулярные узлы (SAN/AVN), атриовентрикулярный пучок Гиса (His) его правую и левую веточки и сеть волокон Пуркинье в желудочках (Sedmera and Gourdie, 2014). Любой из этих типов клеток обладает огромным терапевтическим потенциалом, если генерируется in vitro. Это особенно верно для клеток SAN, которые облдают потенциалом служить в качестве биологических индукторов ритма. Напротив, очистка культур от активности водителя ритма д. генерировать желательные кардиальные транспланты без эктопической электрической активности (Chong et al., 2014).
Несколько сообщений использовали Hcn4, ограниченный специально клетками SAN после дифференцировки сердца, чтобы выделить и изучить узелок-подобные клетки в культуре. Hcn4+ клетки, выделенные на ст. E7.5-E8 у эмбрионов с отслеживаемым клоном Hcn4CreERT2 и культивированные ex vivo, генерировали до 8% узелок-подобных кардиомиоцитов и исключали гладкомышечные или эндотелиальные клетки (Spater et al., 2013). Одновременно в исследованиях in vitro было продемонстрировано обогащение узелок-подобными клетками линий с избыточной экспрессией Hcn4 в линиях mESC (Saito et al., 2015). Более того, HCN4+ клетки могут быть выделены из hESCs на ранних ст. дифференцировки с использованием антител против HCN4. Популяция HCN4+ характеризуется повышенной экспрессией TBX5 и NKX2-5 и дает кардиальные Troponin T+ клетки (Spater et al., 2013). Поскольку эти данные подтверждают ранее установленные принципы in vivo спецификации судеб клеток, то одним из затруднений перевода концепции из биологии развития в системы in vitro заключается в корреляции отличающихся по времени событий у эмбрионов с наблюдениями в культивируемых клетках. Напр., Hcn4 широко экспрессируется в первичной сердечной трубке и лишь позднее ограничивается предсердиями и специфически клетками SA узелка. Следовательно, Hcn4+ клетки, возникающие in vitro тщательно были изучены, прежде чем были отнесены к этой структуре.
Исследования на мышах идентифицировали podoplanin в качестве маркера MLC-2a+NKX2.5- области миокарда sinus venosus, происходящей из заднего поля сердца (Gittenberger-de Groot et al., 2007). После тщательного исследования в Mummery лаб, podoplanin был описан как экспрессирущийся на высоком уровне в кардиальное мезодерме и был использован в комбинации с отсутствием экспрессии NKX2-5, чтобы выделить проспективные миоциты водителя ритма. NKX2-5-Podoplaninhigh предшественники обладают более высокой экспрессией TBX3, SHOX2, TBX18 и HCN4, чем NKX2-5+Podoplaninlow предшественники, также как и соотв. электрофизиолргическими и контрактильными характеристиками. Однако, является ли эта популяция полностью функциональным ритмоводителем предстоит ещё исследовать (Birket et al., 2015). Более того, пока специфические сигнальные пути, участвующие в развитии клеток SAN, остаются неизвестными.
Во время развития сердца клетки Пуркинье, клетки проводящей системы желудочков, рекрутируются из сокращающихся кардиальных предшественников присутствующих в трубчатом сердце (Gourdie et al., 1995). Во время образования периферийной сети волокон Пуркинье, такое специализированное рекрутирование происходит в тесной корреляции со вхождением клеток, происходящих из эпикарда, включая предшественники ткани коронарных артерий (Gittenberger-de Groot et al., 1998; Gourdie et al., 1995). Экспрессия Connexin 40 (Cx40) и contactin ранее были использованы для идентификации клеток Пуркинье в сердце (Pallante et al., 2010). Используя двойную CCS:lacZ и Contactin2:egfp репортерную линию клеток, были изолированы Пуркинье-подобные клетки из культур дифференцировки mESC (Maass et al., 2015). В продолжении этой работы было установлено, что sodium nitroprusside способствует генерации клеток Пуркинье из кардиальных предшественников, первоначально экспрессирующих тяжелую цепь кардиального миозина, путем активации передачи сигналов цАМФ (Tsai et al., 2015). Эти исследования проиллюстрировали ещё один пример верного воспроизведения онтогенетической концепции in vitro и привели к открытию новых механизмов кардиального развития. Механистически, стало ещё более известно, что передача сигналов NRG-1/ErbB является критической для развития проводящей системы сердца (Rentschler et al., 2002), а активация передачи сигналов Notch может перепрограммировать кардиомиоциты в проводящие фенотипы (Rentschler et al., 2012).

Epicardium


Эпикард, состоящий из слоя клеток, окружающего все сердце, долгое время был известен своим влиянием на развитии и созревание миокарда и своим вкладом в гладкие мышцы и клетки фибробластов сердца посредством эпителиально-мезенхимного перехода (Nakajima and Imanaka-Yoshida, 2013). Этот процесс регулируется с помощью передачи сигналов PDGF (Smith et al., 2011), TGFβ (Bax et al., 2011) и RA (von Gise et al., 2011). Недавние данные подтвердили, что эпикард может также играть важную роль в регенерации после повреждения (van Wijk et al., 2012). Недавняя работа показала, что секретируемый эпикардом фактор follistatin-like 1 (Fstl1) является регенеративным фактором, который обычно присутствует в здоровом эпикарде, но теряется после инфаркта миокарда. Его восстановление в эпикарде улучшает функцию сердца путем стимуляции вхождения в клеточный цикл и деления предсуществующих кардиомиоцитов (Wei et al., 2015). Не удивительно, что эпикард привлекает большой интрес в отношении регенеративных подходов.
Онтогенетически эпикард происходит из PEO на ст. E9.5, который образуется из Nkx2-5 и Isl1 экспрессирующих предшественников латеральной пластинки и спланхнической мезодермы (Zhou et al., 2008a). PEO содержит самостоятельную субпопуляцию и многие исследования по отслеживанию клонов подтвердили, что клетки PEO способны давать сосудистые гладкие мышцы, миокард, фибробласты и эндокард (Katz et al., 2012; Cai et al., 2008; Zhou et al., 2008b). Несколько сигнальных путей, включая Fgf8/Snai1 (Schlueter and Brand, 2009), FGF (Torlopp, Schlueter, and Brand, 2010; Kruithof et al., 2006) и BMP (Kruithof et al., 2006; Schlueter, Manner, and Brand, 2006), участвуют в регуляции образования эпикарда у эмбрионов кур. Однако, эти пути остаются менее изученными во время развития эпикарда у млекопитающих (Rudat et al., 2013; Nakajima and Imanaka-Yoshida, 2013).
Важно отметить, что клетки эпикарда могут быть сгенерированы из PSCs человека с помощью стадио-специфичной активации путей передачи сигналов BMP и WNT с очень высокой эффективностью и высокой чистоты (Witty et al., 2014). Хотя передача сигналов BMP необходима для спецификации как кардиомиоцитов, так и эпикардиальных клонов, развитии эпикардиальных клонов зависит от передачи сигналов WNT, тогда как становление клона кардиомиоцитов требует эффективного подавления этого пути (Witty et al., 2014). Помимо BMP и WNT, передача сигналов RA является критической для индукции эпикардиального клона из PSCs (Iyer et al., 2015). Оба протокола эффективно генерируют клетки, экспрессирующие маркеры эпикардиального клона, которые обладают способностью подвергаться EMT в направлении клеток, похожих гладкомышечные и фибробластные в ответ на TGFβ, как онип это делают in vivo (Iyer et al., 2015; Witty et al., 2014).

Endothelial, endocardial, and smooth muscle cells


Помимо кардиомиоцитов сердце содержит многочисленные поддерживающие типы клеток, которые вносят существенный вклад в функционирование органа и часто затрагиваются при болезнях сердца.
Эндокардиальные предшественники впервые обнаруживаются на стадии сердечной трубки (Brutsaert et al., 1996); , однако, мало известно о развитии и эмбриональном происхождении клеток предшественников. дающих эндокард. Имеют ли эндокард и миокард общего предшественника в кардиальной мезодерме in vivo является спорным вопросом. Доказательства экспериментов in vitro подтверждают, что эндокард и миокард происходят из общего мультипотентного мезодермального предшественника, экспрессирующего Flk1 (Moretti et al., 2006; Misfeldt et al., 2009; Motoike et al., 2003; Yang et al., 2008; Kattman, Huber, and Keller, 2006), а доказательства in vivo, такие как общий предшественник только начинают появляться (Lescroart et al., 2014). Точное время механизмов спецификации этих презумптивных предшественников известно плохо и отсутствуют протоколы эффективной генерации функционального эпикарда из PSCs.
Напротив, существует множество протоколов по генерации эндотелиальных клеток из мышиных и человеческих PSCs (Nourse et al., 2010; Choi et al., 2009; Li et al., 2007; Orlova et al., 2014; Kane et al., 2010; White et al., 2013), которые сильно напоминаю эндокардиальные клетки по функции и фенотипу. Основной подход к генерации эндотелиальных клеток базируется на индукции мезодермы посредством передачи сигналов BMP, что сопровождается спецификацией эндотелиальных клонов за счет высокого уровня VEGF. Такие подходы приводят к эффективной генерации CD31- и VE-cadherin-позитивных популяций с функциональными свойствами, характерными для эндотелиальных клеток.
Хотя гладкомышечные клетки обнаруживают большое сходство с кардиальной мышцей, но неожиданно мало исследований посвящено их генерации из PSCs. Современные протоколы состоят из модификаций специфичных для сердца протоколов с добавлением PDGF-BB или VEGF и bFGF на ст. мезодермы, чтобы улучшить дифференцировку гладкомышечных клеток. Гладкомышечные клетки, сформированные таким способом по функции неотличимы от первичных гладкомышечных клеток коронарных сосудов человека (Cheung et al., 2012; Steinbach and Husain, 2016; El-Mounayri et al., 2013; Paige et al., 2010). На мышах было установлено, что передача сигналов Notch является критической для дифференцировки предшественников сосудистых гладких мышц, хотя это не было подтверждено данными in vitro (Doi et al., 2006; High et al., 2008).

Maturation of PSC-derived Cells


Одним из основных препятствий в определении потенциала дифференцировки и клонального вклада популяций разных предшественников из PSC является широко распространенное мнение, что происходящие из PSC клетки являются незрелыми и не соответствуют клеткам из полностью дифференцированного сердца. В частности. кардиомиоциты, происходящие из PSCs имеют разные размеры, морфологию, молекулярный состав, реакцию на кальций и метаболизм по сравнению с поздними плодными или взрослыми кардиомиоцитами. Это представляет проблему для многочисленных аспектов биологии и использования PSC для изучения кардиальных подтипов, становления моделей сердечных болезней и для тестирования лекарств и открытия новых стратегий для сердца взрослых.
Одним из наиболее значительных изменений, которые происходят во время кардиального развития и созревания, является переход от анаэробного к оксидативному метаболизму (Sartiani et al., 2007; Kolwicz, Purohit, and Tian, 2013). Сердце плода адаптировано к низкому окружению кислородом, тогда как уровни циркулирующих жирных кислот низкие и плодные кардиомиоциты сильно зависят от гликолиза, продуцирующего АТФ. Однако, жирные кислоты являются преимущественным субстратом, используемым взрослым миокардом (Lopaschuk and Jaswal, 2010; Alaynick et al., 2007). Несколько исследований подтвердили концепцию гибкости кардиального метаболизма, это обеспечивает преимущества адекватной доставки АТФ для непрерывных кардиальных сокращений с использованием разных субстратов, когда они становятся доступными в изобилии при различных физиологических условиях (Wentz et al., 2010; Goodwin and Taegtmeyer, 2000; Kaijser and Berglund, 1992; Stanley et al., 2003; Schonekess, 1997).
Эффективный митохондриальный оксидативный метаболизм делает безопасной кардиальную спецификацию и место осуществления возбуждения сокращения (excitation-contraction coupling). В подтверждение этому манипуляции с генами, регулирующими слияние митохондрий при созревании митохондрий, поскольку нарушение функции респираторной цепи предупреждало организации митохондрий и вызывало дефицит в организации саркомер и нарушало контрактильную функцию (Chung et al., 2007). Как только кардиомиоциты созревают, количество митохондрий в каждой клетке увеличивается и митохондрии становятся более униформными и имеют более плотно упакованные гребешки (cristae) (Legato, 1979; Artman, Graham, and Boucek, 1985). Тщательный анализ экспрессии генов в выборках взрослого и плодного сердца человека, а также в 2-дневных и годовалых кардиомиоцитах, полученных из hESCs, показал, что максимум генов, дифференциально экспрессирующихся в сердце плода или взрослых включает многие метаболические гены из метаболизма липидов и жирных кислот т оксидативного фосфорилирования (Ellen Kreipke et al., 2016). Современный протокол дифференцировки из PSC целиком базируется на среде, богатой глюкозой, лишенной жирных кислот. Принимая во внимание большое значение метаболического переключения во время развития сердца, были сделаны попытки дальнейшей дифференцировки и получения зрелых кардиальных клеток из PSCs путем наладки подходящих метаболических субстратов, более аккуратно отражающих онтогенетический статус in vivo.
Исследования с целью выяснения молекулярных механизмов созревания сердца выявили, что зрелые кардиомиоциты усиливают активность let-7 семейств а микроРНК. Это семейство целенаправленно воздействует на гены, участвующие в пути PI3/AKT/insulin, а их подавление приводит к снижению экспрессии маркеров созревания, а также к снижению респираторной способности и к использованию palmitate в качестве источника энергии (Kuppusamy et al., 2015). Более того, активация передачи сигналов integrin и focal adhesion kinase было описано как важное для созревания кардиального монослоя. происходящего из PSC человека in vitro. Такое созревание кардиомиоцитов достигается в течение 1-й недели и клетки приобретают более высокую скорость распространения импульсов, более зрелый профиль потенциала действия и более высокий уровень экспрессии ключевых зрелых sarcolemmal (SCN5A, Kir2.1 и connexin43) и миофиламентных (cardiac troponin I) маркеров (Herron et al., 2016).
Др. многообещающими подходами изучения созревания клеток, происходящих из PSC, в действительности являются биоинженерные подходы. Общей целью этих исследований является предоставление клеткам физиологических условий в отношении внеклеточного матрикса (ECM), направленных сокращений и определенного клеточного состава ткани. Эти критерии являются стержнем детальных исследований развивающегося сердца.
Контактное наведение посредством межклеточных взаимодействий или взаимодействий между клетками и ECM может играть важную роль во время созревания кардиомиоцитов, а физическое взаимодействие кардиальных клеток с внеклеточным матриксом является важным регулятором организации миофибрилл (Bray, Sheehy, and Parker, 2008; Huang and Ingber, 1999; Parker et al., 2008). В попытке перенести эту информацию на клетки, произошедшие из PSC, искусственно создавали расположение кардиомиоцитов в biomimetic бороздках, чтобы выявить продольно действующие и поперечно скорости проведения сигналов, напоминающее нативное анизотропное соотношение человека и тогда общий показатель спонтанных и индуцированных аритмий достоверно снижался в расположенных рядами препаратах, но не изотропном контроле (Wang et al., 2013). Более того, некоторые исследования разработали системы электрической стимуляции для воссоздания естественного окружения для кардиомиоцитов (You et al., 2011; Dvir et al., 2011; Nunes et al., 2013).
Разнообразные биоматериалы и синтетические полимеры помогают кардиомиоцитам организовываться в функционирующую ткань, но низкая проводимость этих материалов ограничивает участки от сокращения как единиц. Произошедшие из PSC кардиомиоциты сокращаются наиболее надежно на субстратах, ригидность которых соответсвует ригидности эмбриональной ткани (~ 10 kPa), это не является неожиданным, принимая во внимание незрелость стадии этих клеток (Jacot et al., 2010; Ribeiro et al., 2015; Heras-Bautista et al., 2014). Основные усилия в области биоинжениринга были осуществлены в области серии тканевых искусственно созданных модельных систем, на разных внеклеточных матриксах, характеризующихся разной scalability, функциональными индикаторами и составом ткани. Поле ткани, искусственно созданное для происходящих из PSC кардиомиоцитов, чрезвычайно расширилось в последнее время (Eschenhagen et al., 1997; Zimmermann et al., 2002; Hansen et al., 2010; Wang et al., 2013; Thavandiran et al., 2013; Hirt et al., 2014).
Созревание происходящих из PSC типов клеток, особенно клеток сердца, остается проблемой в этой области и нуждается в усилении потенциала PSC модельной системы для моделирования болезней, открытия и тестирования лекарств и исследований развития человека in vitro. Подходы для преодоления этих узких мест, скорее всего, заключаются в комбинации стратегий, включая биоинженеринг, метаболизм, межклеточные взаимодействия и параметры передачи сигналов, чтобы создавать физиологичес5ки более подходящие и зрелые кардиальные клетки и ткани, происходящие из PSC (Fig. 1B).

Perspectives and Future Directions


Knowledge of developmental processes has proven to be a reliable and effective instructor for in vitro differentiation systems, direct reprogramming approaches, and adult regeneration strategies in the heart. This has led to a broad spectrum of discoveries using mouse and human PSCs, including the efficient production of cardiovascular populations and differentiated cell types, the uncovering of molecular mechanisms of heart development, and the description of novel tools for in vitro tissue generation (Fig. 1b). The field has moved quickly toward therapies, and the first successful injections of PSC-derived cell products have been reported recently (Chong et al., 2014), with many more on the way. While these studies consist of impressive milestone achievements, they simultaneously illustrate the need for further improvement of the in vitro cell-production strategies.
One promising avenue has long been thought to be the definition and isolation of cardiovascular progenitor populations with defined differentiation potential. Several different novel progenitor populations have recently been generated from human PSCs, and how their derivatives perform in in vivo models will be of the utmost interest. In order for these cells to convey therapeutic benefit, they will have to be generated in large quantities and at high purities. Thus, strategies supporting the expansion of progenitor populations without compromising their differentiation potential will be critical to develop. This has been done successfully for endoderm and neuronal lineages in the past (Cheng et al., 2012; Schwartz et al., 2008). With respect to disease modeling and the study of differentiated cardiovascular cells, a major drawback of the current protocols is the consistently fetal phenotype of PSC-derived cells. This renders investigations of non-congenital, degenerative, or late-onset disorders challenging to study, and the need for more mature cardiomyocytes has populated the field with intriguing new studies, which we hope will provide new solutions to this important problem in the coming years.
Moving forward, we propose that answers to many of the outstanding questions can be found by investigating the respective processes during normal heart development and maturation. The promise of such discoveries is the establishment of efficient, reliable, and highly defined in vitro systems that will support the therapeutic approaches from regenerative biology to in-depth disease investigation.