Посещений: 
ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
Получение
Making a Hematopoietic Stem Cell Michael G. Daniel, Carlos-Filipe Pereira,Ihor R. Lemischka, Kateri A. Moore
 Trends in Cell Biol. Volume 26, Issue 3, p202–214, March 2016
| |
|
Cell Stem Cell
In Vivo Tracking of Human Hematopoiesis Reveals Patterns of Clonal Dynamics during Early and Steady-State Reconstitution Phases
Luca Biasco, Danilo Pellin, Serena Scala, Francesca Dionisio, Luca Basso-Ricci, Lorena Leonardelli, Samantha Scaramuzza, Cristina Baricordi, Francesca Ferrua, Maria Pia Cicalese, Stefania Giannelli, Victor Neduva4, David J. Dow, Manfred Schmidt, Christof Von Kalle, Maria Grazia Roncarolo, Fabio Ciceri, Paola Vicard, Ernst Wit, Clelia Di Serio, Luigi Naldini, Alessandro Aiuti,
Show more
doi:10.1016/j.stem.2016.04.016
Natural killer clones have closer relationships to myeloid cells than to lymphoid cells
Hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) are capable of supporting the lifelong production of blood cells exerting a wide spectrum of functions. Lentiviral vector HSPC gene therapy generates a human hematopoietic system stably marked at the clonal level by vector integration sites (ISs). Using IS analysis, we longitudinally tracked >89,000 clones from 15 distinct bone marrow and peripheral blood lineages purified up to 4 years after transplant in four Wiskott-Aldrich syndrome patients treated with HSPC gene therapy. We measured at the clonal level repopulating waves, populations' sizes and dynamics, activity of distinct HSPC subtypes, contribution of various progenitor classes during the early and late post-transplant phases, and hierarchical relationships among lineages. We discovered that in-vitro-manipulated HSPCs retain the ability to return to latency after transplant and can be physiologically reactivated, sustaining a stable hematopoietic output. This study constitutes in vivo comprehensive tracking in humans of hematopoietic clonal dynamics during the early and late post-transplant phases.
 Figure 1
Patient-Specific Hematopoietic Stem and Progenitor Cell (HSPC) Derivation and Future Studies. This diagram demonstrates the general strategy of most patient-specific cell reprogramming processes and future directions. The ideal strategy is to obtain patient/donor somatic cells and reprogram to the cell type of choice, in this case hematopoietic stem cells (HSCs). These HSCs could then be used in a variety of different studies. These include but are not limited to, gene correcting the derived HSCs (or correcting the genetic defect in the obtained patient cells before reprogramming), transplantation, drug screens to identify novel therapeutics for a variety of diseases, generating patient-specific blood products and studying hematopoiesis in vitro.
 Figure 2
Various Strategies to Generate Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Several groups have attempted to derive HSCs in many different ways. The major differences among the strategies are the starting cells [embryonic stem cells (ESCs), induced pluripotent stem cells (iPSCs), fibroblasts, lineage committed blood progenitors, and endothelial cells], the media/culture system the cells are reprogrammed on, and the transcription factor (TF) cocktail that the cells are subjected to. Although all efforts are aimed at getting bona fide HSCs, most of the attempts thus far fall short. The boxes list TFs and they are color coded to the arrow denoting the associated outcome.
The Need for Patient-Specific HSPCs and Strategies to Obtain Them
Гематопоэз (see Glossary), процесс, с помощью которого гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) генерируют все клеточные элементы нашей крови. Он осуществляется иерархическим способом, связанным с самообновляющимися HSCs. Они дают предшественников с ограниченным потенцалом самообновления, которы дифференцируются в клетки определенных клонов, создавая иммуногематопоэтическую систему. Материал для гематопоэтических трансплантаций в большом спорсе, во всяком случае проделывается, по крайней мере, 20 000 аллогенных трансплантаций ежегодно [1]. Несмотря на успехи в использовании umbilical cord blood (UCB) и мобилиованных стволовых клеток, донорский материал остается ораниченным из-за ограничений стволовых клеток в UCB, плохой мобилизации и отсутствия этнического разнообразия для предоставления достаточного пригодного матриала [2]. Аллогенные трансплантации нуждаются в совпадении human leukocyte antigen (HLA) донора и хозяина и могут вызывать graft-versus-host disease (GvHD) и отторжение трансплантата [3].
Чтобы преодолеть упомянутые затруднения, некоторые исследования ищут увеличение числа HSPC in vitro посредством экспансии ex vivo HSPCs с помощью малых молекул. Описаны успехи по использованию SR1, UM171 и valproic кислоты [4-6]. Хотя алые молекулы демонстрируют свою пригодность в перепрограммировании соматических клеток, таких как фибробласты в холинергические нейроны и др., их использование с гематопоэтическими клетками всё ещё ограничено [7, 8]. Несмотря на экспериментальную легкость их оптимизации, описываются различные побочные эффекты при использовани малых молекул [9, 10] и остаются ограничения в отношении общей функции размноженных HSPCs и мишеней для их использования.
Сдвиг в биологии стволовых клеток - и начале регенеративной медицины - проихошел, когда Yamanaka and Takahashi репрограммировали соматические клетки в iPSCs, используя четыре транскрипционных фактора (TFs) [11, 12]. Дальнейшее понимание транскрипционного контроля в ряде разных типов клеток [13] расширило использование TFs, чтобы прямо изменять судьбы соматических клеток без проведения из через ст. плюрипотентности [14, 15]. В самом деле, был достигнут проресс в репрограммировани фибробластов в др. типы клеток, такие как моноцит-подобные клетки предшественники, макрофаги и ангиобласт-подобные клетки предшественники среди прочих [16-29], но было сделано мало попыток по репрограммированию соматических клеток в стволовые клетки со степенью мультипотентности, которой обладют HSC [30]. Такая возможноть позволяет получать de novo HSCs из пациент-специфических клеток: клетки пациента д. быть получены, генетически скорректированы, репрограммированы, размножены in vitro и использованы для аутологических трансплантаций HSC [31, 32]. Обладание такими клетками для исследований in vitro позволило бы также в открытии лекарств для ряда различных нарушений и предоставило бы информацию о транскрипционном контролегематопоэза (Figure 1).
После декады исследований, дифференцирующиеся PSCs в виде, пригодном для трансплантаций в виде мультиклональных HSCs в основном безуспешны [33]. Однако, успехи 'omics' технологии и прямого превращения соматических клеток в HSC состояние может вскоре сделать этот аспект регенеративной биологии стволовых клеток реализуемым решением.
Table 1 Strategies Attempting to Generate HSCs
Differentiating ESCs and iPSCs to Bona FideDefinitive HSCs
Первые усилия по генерации HSCs и др. клеток предшественников in vitro из PSC привели к гематопоэтической дифференцировке [34, 35]. Попытки использования PSCs, однако, не дали пригодных результатов из-за ограниченного мультиклонального долговременного потенциала приживания трансплантата [36, 37]. Считается, что происходящие из PSC гематопоэтические клетки не являются полностью зрелыми для взрослой стадии. Эти клетки не дают эффективно клетки всех клонов и неспособны продуцировать гемоглобин взрослых, и они не приживаются эффективно в костном мозге.
Recapitulating Hematopoietic Development with PSCs
Потенциал HSCs был впервые обнаружен in vitro у полученных из эмбриоидных тел (EBs) путем дифференцировки ESC после добавления цитокина [37, 38]. LБолее поздние попытки были сконцентрированы на воспроизведении эмбрионального гематопоэтического развития путем дифференцировки PSCs. PSCs теперь могут быть дифференцированы в гемогенный эндотелий (HE), популяция клеточных предшественников, теоретически дающих HSCs в качестве части эмбрионального сайта гематопоэза, наз. aorta-gonad-mesonephros [39-42]. Недавние данные продемонстрировали, что разные популяции HE дают начало примитивной и дефинитивной гематопоэтическим программам в этих гематопоэтических сайтах [43]. Примитивный гематопоэз возникает первым во время развития, при этом клетки обладают преходящей природой и ограниченным потенциалом (эритроциты, макрофаги и мегакариоциты). Напротив, дефинитивная программа содержит HSCs, которые развиваются из HE посредством endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) [44]. Runx1, среди др. TFs, является критическим для этого раннего переходного процесса [45]. Эти две программы обычно изучаются с использованием T-лимфоидного потенциала в качестве read-out [46], но это оказалось затруднительным из-за иммунных клеток, которые появлялись прежде дефинитивного гематопоэза [47]. Более того, гемангиобласты (HBs) из мышиных PSCs формируют непосредственно предшественники HE, чтобы достичь примитивной программы, осложняя нашу способность обойтись без разных HE популяций, и тем самым осложняя нашу способность легко генерировать HSCs [48].
Недавно несколько групп использовали тератомы в качестве источника HSCs. тератомы содержат ткани всех трех зародышевых листков, предполагается, что они д. также содержать индуктивные сигналы из гематопоэтических ниш, чтобы индуцировать образование HSCs. Человеческие iPSCs, инъецированные иммунодефицитным (immunocompromised) мышам генерировали тератомы, которые содержали гематопоэтические клетки. HSPCs, изолированные из этих тератом, д. были серийно трансплантироваться и восстанавливать гематопоэтическую систему иммунодефицитных sitq [49]. iPSCs, происходящие из Lnk -/- мышей обладают высоким гематопоэтическим потенциалом. Этот адапторный белок обычно экспрессируется в гематопоэтических предшественниках и ингибирует c-Kit-обусловленную пролиферацию, регулируя экспансию и функцию гематопоэтических предшественников [50]. Следовательно, удаление Lnk д. увеличивать урожай гематопоэтических клеток в данной стратегии и также делать возможным дальнейшее исследование механизмов передачи сигналов Lnk в контроле экспанции гематопоэтических предшественников из HSCs. Lnk -/- iPSCs, преобразованные, чтобы экспрессировать общераспространенный гамма цепочный белок, были использованы для индукции тератом, из которых были выделены HSPCs, и использованы для коррекции X-SCID мышей, которые несут мутацию общей гамма цепи после трансплантации [51]. Эти подходы ограничены для их клинического использования из-за риска повторного возникновения тератом, но предоставляют воспроизводимую стратегию для изучения молекулярных механизмов различных сигнальных путей в биологии HSC .
Directed Differentiation of PSCs with TF Reprogramming
Дополнительные попытки с PSCs касались избыточной продукции критических гематопоэтических TFs. Гомеобоксный ген HoxB4 выполняет множественные роли в гематопоэзе и первым был избыточно экспрессирован [52]. Ранние попытки использовать ретровирусs, чтобы вводить эктопически HoxB4 в мышиные эмбриональные стволовые клетки (mESCs). После культивирования на OP9 строме эти клетки были использованы для восстановления летально облученных мышей, но в первую очередь были приспособлены к миелоидной судьбе [53]. Совместное культивирование индуцибельного HoxB4 и OP9 также приводит к генерации in vitro HSPCs из mESCs (Figure 2). Эти желточный мешок перед циркуляцией и происходящие из ESC предшественники обладают мультиклональным потенциалом приживления трансплантата у облученных взрослых первичных и вторичных мышей реципиентов. Долговреманная постоянная избыточная экспрессия HoxB4, однако, в конечном счете ингибирует дифференцировку [54]. Как результат геномная интеграция HoxB4, является маловероятной, так что эта техника может быть использована клинически; поэтому были сделаны попытки упаковки HoxB4 в аденовирус, чтобы избежать интеграции вируса. Временная избыточная экспрессия HoxB4 делает возможной генерацию HSPC из iPSCs мыши [55], но остается неясным, способны ли происходящие клетки к долговременному приживлению трансплантата. Индуцибельная избыточная экспрессия Cdx4 (TF, участвующий в эмбриональном гематопоэзе посредством активации задних Hox генов) вместе с HoxB4 улучшает гематопоэтическую спецификацию мезодермы, такж как и формирование гематопоэтических предшественников. Полученные HSPCs с помощью этой стратегии дифференцировки могут быть быть трансплантированы более эффективно, чем при стратегии использования только HoxB4 [56]. Эти находки демонстрируют, что путь Cdx4-HoxB4 активно участвует в гематопоэтической спецификации и образовании и манипуляции с ним могут в принципе позволить генерировать HSPC.
Избыточная экспрессия HOXB4 также приводит к генерации гематопоэтических клеток из ESCs человека. Стабильная избыточная экспрессия HOXB4 позволяет поддерживать клетки в недифференцированном состоянии, а дифференцировка этих клеток без цитокинов демонстрирует улучшенное гематопоэтическое развитие. Добавление цитокинов [stem cell factor (SCF), Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), interleukin-3 (IL-3), IL-6 и granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)], которые, как было установлено, важны для гематопоэтической экспансии [57], однако, дальнейшее улучшение давало миелоидные и моноцитарные колонии [58]. Несмотря на это увеличение выхода, др. исследование установило, что HOXB4 не является существенным для гематопоэтического развития в клетках человека [59]. Экспрессия HOXB4 продуцирует разные эффекты в разных типах клеток и эти эффекты зависят от времени экспрессии, величины избыточной экспрессии и клеточного окружения. Кажущаяся изменчивость в функции HSPC посредством HOXB4 репрограммирования осложнаяет наше понимание роли HOXB4 в гематопоэзе человека и понимание того, как генерировать HSPCs, способные к мультиклональному приживлению трансплантата с помощью этого TF.
Из-за трудностей с HoxB4, лаб. сфокусировались на др. TFs , а также на др. гематопоэтических клетках, происходящих из iPSCs, включая стволовые клетки, дающие ограниченный набор клонов. Анализ профилей экспрессии генов выявил несколько слабо экспрессирующихся HSC-специфических TFs в CD34+CD45+ миелоидных предшественниках по сравнению с CD34+CD38- UCB HSCs. Скрининг этих факторов идентифицировал HOXA9, ERG и RORA в качестве генов, способных давать CD34+CD45+ миелоидных предшественников с потенциалом самообносления и дифференцировки, но без потенциала приживления трансплантата. Скрининг немногих клеток, которые приживаются, выявил SOX4 и MYB в качестве обязательных факторов, обеспечивающих способность приживления трансплантата (Figure 2). Эти клетки были использованы для кратковременных трансплантаций миелоидных и эритроидных клонов [60]. Идентификация этих факторов выявила возможную регуляторную сеть генов, важную для гематопоэтического программирования и приживления трансплантатов. Эритроидные клетки, генерируемые с помощью этой стратегии могут быть умножены экспоненциально и продуцировать гемоглобин взрослых. Этот подход, однако, страдает от неспособности получить клетки с долговременным потенциалом приживления трансплантата и чтобы генерировать лимфоидные клетки.
Чтобы более соответствовать ходу развития гематоптоэза, человеческие iPSCs были дифференцированы в HE с модифицированной избыточной экспрессией мРНК для отбора комбинаций TFs, которые обеспечивают разные клональные потенциалы. С ETV2 и GATA2, HE дают в последующей генерации myeloid-biased гематопоэтические клетки. Трансдукция с использованием GATA2 и TAL1 дает HE, который генерирует гематопоэтические клетки с потенциалом давать клон эритро-мегакариоцитов [61], демонстрируя важность HE для генерации гематопоэтических клеток. Неспособность использовать коктейль из TF, чтобы индуцировать клетки с мультиклональным миелоидным и лимфоидным потенциалом, остается и клетки не приживляются у иммунодецицитных мышей долгое время. Хотя эти клетки тесно следуют гематопоэзу в онтогенезе, проходыя стадию HE, неспособность продуцировать полностью функциональные зрелые HSCs остается.
Несколько недавних исследований выявили, что Sox17 является критическим для развития HE и дефинитивного гематопоэза путем позитивной регуляции NOTCH1 как для приобретения артериальной судьбы, так и спецификации HE, который может подвергаться EHT посредством пути Notch [62, 63, 64]. Происходящий из PSC человека HE с избыточной экспрессией SOX17 формирует полуслипшиеся агрегаты клеток, но дает мало гематопоэтических предшественников, несмотря на активацию неокторых регуляторных генов, важных для гематопоэза. После освобождения от избыточной экспрессии SOX17, однако, эти клетки сохраняют свой гемогенный потенциал и дают множество гематопоэтических предшественников [65]. Остается неясным, действительно ли эти клетки способны к многоклональному долговременному приживлению трансплантата. Др. известные TFs, как было установлено, способствуют гематопоэтической спецификации в PSCs. Избыточная экспрессия RUNX1a в EBs способствует гематопоэтической детерминации и дефинитивному гематопоэзу, делая возможной генерацию клеток предшественникjd. После избыточной экспрессии RUNX1 многие мезодермальные и гематопоэтические гены активируются, такие как Brachyury и GATA2 [66]. SCL, критический TF для спецификации крови и эндотелия из мезодермы во время эмбрионального гематопоэза, обнаруживает паттерн экспрессии, который соответствует гематопоэтической спецификации в ESCs, культивируемых с гематопоэтическими цитокинами [57], а его избыточная экспрессия усиливает гематопоэтическую спецификацию ещё сильнее. напротив, замалчивание SCL существенно снижает выход гематопоэтических предшественников [67].
Все эти исследования TF в PSCs, хотя и оказались неспособны генерировать HSPCs полностью способные к мультиклональному приживлению, но они продемонстрировали важность некоторых генов для гематопоэза и показали, насколько их эффекты при избыточнаой экспрессии являются критическими для становления гематопоэтической программы. Каждое исследование генерировало гематопоэтические клетки, способные к функционированию на разных уровнях, демонстрируя , что комбинация некоторых подходов и TFs может улучшить функцию продуцируемых клеток. Figure 2 описывает ключевое исследование с мышиными и человеческими PSCs, а Table 1 представляет резюме разных стартовых популяций, факторов, культуральных условий, исходов и используемых технологий.
Reprogramming Somatic Cells to HSPCs
Недавние усилия в попытке пизменить судьбы соматических клетокe без прохождения стадии плюрипотентности [14], включали исследования по превращению соматических клеток в высоко мультипотентные HSC. (Table 1, Figure 2).
Inducing a State of Plasticity
Ведутся споры, позволяет ли внесение факторов плюрипотентности индуцировать состояние пластичности, таких, которые в отдельности или в комбинации с др. гематопоэтическими TFs и культуральными условиями могут быть генерированы HSPCs. Недавно было установлено, что когда факторы плюрипотентности вносятся в котейль для репрограммирования, то продуцируются временные плюрипотентные промежуточные состояния [68, 69]. Во всяком случае предпринимаются попытки избежать этой стадии, в разных исследованиях используются факторы плюрипотентности, чтобы обеспечить изменения клеточных судеб выполнимыми с некоторым успехом.
Эктопическая избыточная экспрессия OCT4 и воздействие цитокинов генерируют CD45+ клетки из фибробластов кожи человека (HDFs). Эти клетки дают разные гематопоэтические колонии (gгранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов) [70]. Этот метод, однако, генерирует клетки с ограниченным потенциалом самообновления, которые не могут давать лимфоидные клетки. Более того, приживление ограничено местом инъекции репрограммированных клеток, делая маловероятной полную гематопоэтическую реконструкцию. Кратковременное воздействие избыточной экспрессии OCT4 на взрослые HDFs, чтобы репрограммировать окружение (RM) вызывает состояние пластичности, это указывает на важность взаимоотношений между фактором избыточной экспрессии и внеклеточным окружением, которое влияет на транскриптом фибробластов [71]. Имеются изъяны в этой методологии, т.к. внесение OCT4 д. генерировать пластические промежуточные клетки, которые могут загрязнять популяции HSPC частично плюрипотентными клетками, которые потенциально являются туморогенными.
Помимо внеклеточного окружения избыточная экспрессия определенных миРНК может способствовать репрограммированию HSPCs. В самом деле, избыточная экспрессия SOX2 в фибробластах человека помогает быстро формировать CD34 + клетки, тогда как экспрессия miR-125b усиливает потенциал приживления трансплантата. Эта стратегия используется для in situ развития их частично репрограммированных клеток с учетом гематопоэтических ниш мышей для завершения репрограммирования [16]. Использование фактора плюрипотентности SOX2, однако, ставит те же самые потенциальные вопросы, что и OCT4 [70, 71]. Оба гена могут вызывать продукцию частично плюрипотентных промежуточных клеток во время этого косвенного процесса конверсии. Более того, клетки, генерируемые с помощью избыточной экспрессии SOX2 и miR-125b в присутствии мышиных гематопоэтических ниш, приводят только к приживлению клеток, которые дают предшественников макрофагов и моноцит-подобных предшественников .
Inducing a Developmental Program In Vitro
Использование мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) от двойных трансгенных мышей, с меченными CD34+ клетками с помощью H2BGFP [72] , чтобы отобрать соотв. TFs выявило, чтоизбыточная экспрессия Gata2, Gfi1b, cFos и Etv6 может индуцировать гемогенную программу, почти в точности воспроизводящую гематопоэтическое развитие во время эмбриогенеза. Тщательная проверка гематопоэтического процесса репрограммирования идентифицировала предполагаемые предшественники для HE, которые обладают Prominin1+Sca1+CD34+CD45- фенотипом клеточной поверхности и глобальной эндотелиальной программой транскрипции. Дальнейшее культивирование приводило к появлению клеток, подобных гематопоэтическим, возможно за счет отпочкования от развивающихся HE клеток. Такие подобные гематопоэтическим клетки обладают HSC программой транскрипции и профилем клеточной поверхности. После плацентной реагрегации в культуре они приобретают колонии формирующий потенциал in vitro [30]. Эта работа выявила платформу для изучения развития гематопоэза in vitro. Открытие промежуточных клеток со специфическим фенотипом клеточной поверхности подталкивает к исследованию, существуют ли они в эмбриональных сайтах, обнаруживающих дефинитивный гематопоэз и если да, то будучи изолированными, они могут созревать в способные к новому заселению HSCs [73]. Работа продолжается в направлении генерации клеток, которые обладают мультипотентным потенциалом приживления трансплантата у мыши и человека. Было бы интересно, определить, может ли тот же самый коктейль из TF индуцировать гемогенную программу в фибробластах человека и/или необходимы дополнительные сигналы или факторы для развития HSCs с многоклональным долговременным потенциалом приживления трансплантата.
При дальнейшей демонстрации становления промежуточных клеток HE во время репрограммирования, избыточная экспрессия Erg, Gata2, Lmo2, Runx1c и Scl приводила к быстрому появлению клеток гематопоэтических предшественников в течение 8 дней в эмбриональных и взрослых фибробластах мыши. Возникающие клетки проходят через HE промежуточные состояния, обладая как эндотелиальным, так и гемопоэтическим профилем экспрессии генов. Эти гематопоэтические предшественники обладают мультиклональным потенциалом (эритроидным, мегакариоцитарным и миелоидным), а совместное культивирование на OP9 и OP9-DL1 строме делает возможной генерацию лимфоидных B и T клеток, соотв., приводя к кратковременному мультиклональному приживлению. Репрограммирование p53-/- фибробластов повышало эффективность и быстроту (5 дней по сравнению с 8 днями) возникновения [74]. Этот подход отражает стратегию использования Gata2 и фибробластов для репрограммирования в HSPCs через гемогенные промежуточные клетки [30]. Хотя это сообщение демонстрирут быстрое возникновение предшественников для гематопоэтических клеток, потеря p53 может приводить к неблагоприятным эффектам. Более того, даже после потери p53, эти клетки сохраняют только потенциал кратковременного приживления.
Коктейль из TF Gata2, Lmo2, Mycn, Pitx2, Sox17 и Tal1 заключает мышиные клетки (ESCs, клетки печени плода и фибробласты) в пролиферативное, самообновляющееся состяние HB, наз. expandable HBs (eHBs). Продолжительная экспрессия TFs удерживает клетки в пролиферативном состоянии, но как только эктопические факторы замалчиваются, то эти eHBs дают функциональные гладкие мышцы, эндотелиальные и мультиклональные гематопоэтические клетки. Присутствие fibroblast growth factor (FGF) в культуре способствует экспансии этих клеток и также поддерживает способность eHBs генерировать эндотелиальные клетки и лейкоциты, но не эритроциты [75]. Хотя и обнадеживает, что экспансивные клети, в данном случае eHBs, могут генерироваться, они не приобретают потенциала мультиклонального приживления. Кроме того, этот процесс дает плохие ркзультаты с фибробластами, затрудняя работу со специфичным для пациентов контекстом.
Direct Reprogramming together with Signals from the Microenvironment
Очень многообещающая стратегия возникла, когда стало возможным прямое с помощью TF репрограммирование вместе с индуктивными сигналами от in vivo ниш, привела к генерации bona fide мышиных HSCs. Детерминированные гематопоэтические клетки предшественники и эффекторы с эктопической Hlf, Runx1t1, Pbx1, Lmo2, Zfp37 и Prdm5 были немедленно трансплантированы мышам с непрерывной экспрессией трансгенов в течение 2-х недель, это позволяло in vivo нишам осуществлять перепрограммирование. Два дополнительных фактора, Meis1 и Mycn, вместе с полицистронными вирусами, увеличивали эффективность репрограммирования [76]. Клетки предшественники и дифференцированные клетки от трансплантированных мышей могут быть перепрограммированы in vivo с помощью включения TFs после последующей трансплантации. Многообещающий этот метод не без изъяна. Использование in vivo ниш мешает способности изучать специфические сигналы, необходимые для поддержания перепрограммирования HSC. Кроме того, некоторые TFs в коктейле для репрограммирования являются прото-онкогенами, что увеличивает риск онкогенеза. Более того, кровяные клетки от пациентов, страдающих гематопоэтическими нарушениями, вызываемыми или благоприобретенными или врожденными мутациями в пуле HSPC, сохраняют эти мутаии и после репрограммирования, что делает трансплантации этих типов клеток пациентам неосуществимыми. Тем не менее, было бы интересно посмотреть, работает ли эта стратегия на клетках человека.
Др. исследование показало, репрограммирование человеческой пупочной вены и эндотелиальных клеток микрососудов кожи человека во мультипотентные предшественники (MPPs) с помощью TFs FOSB, GFI1, RUNX1 и SPI1 (PU.1) нуждается в поддержке в in vivo сосудистых нишах. Репрограммированные MPPs приживленные первичным или вторичным иммунодефицитным мышам, генерируют все клетки гематопоэтических клонов за исключением Т клеток [77]. Слой сосудистых ниш из E4ECs (endothelial cells transduced with E4ORF1), как ранее было установлено, способен к расширенной репопуляции HSCs [78]. Эта линия клеток, как полагают, способствует путям выживания без нарушения путей пролиферации или трансформации, делая возможным отсутствие сыворотки. Клетки др. эндотелиальной ниши, которые избыточно экспрессируют NOTCH лиганды JAG1 и DLL4, индуцируют происходящие из PSC клетки MPPs, чтобы генерировать существенно больше гематопоэтических предшественников, чем при культивировании этих клеток в отсутствие слоя ниш. Эти NOTCH лиганды индуцируют экспрессию NOTCH мишеней RUNX1 и GATA2, оба являются критическими для дефинитивного гематопоэза [79]. Эти находки демонстрируют, что активация NOTCH пути во время дифференцировки PSCs необходима для возникновения HSC, и вместе с нишами играет большую роль в гематопоэзе во время развития. Способность к долговременному приживлению репрограммированных эндотелиальных клеток у иммунодефицитных мышей, составляет ступень в правильном направлении, но неспособоность таких клеток генерировать Т клетки in vivo демонстрирует, чтополная мультиклоналная гематопоэтическая программа не была достигнута, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить индуктивные сигналы вместе с слоем E4EC, которые смогли бы обеспечить эту способность. Более того, использование эндотелиальных клеток может осложнить клиническое применение этого исследования из-за трудностей получения достаточных количеств эндотелиальных клеток пациента для репрограммирования.
Concluding Remarks
The ultimate goal of these studies is to generate expandable HSCs or progenitor populations that can be expanded in vitro for multiple uses. A few of these are as follows: (i) study hematopoiesis more fully in vitro; (ii) have appropriate disease modeling and drug testing systems for existing hematopoietic disorders; (iii) genetically correct and expand patient-specific HSCs with the intent of stem cell transplantation; and (iv) generate patient-specific blood products [80, 81]. Although progress has been made, years of efforts have attempted in vitro/ex vivo expansion or the de novo generation of HSCs from PSCs, leaving much more work to be undertaken (see Outstanding Questions). Cell fate conversion of somatic cells to HSCs, although in its infancy, is an attractive alternative. It appears that somatic cell-derived HSPCs generated with the appropriate microenvironmental conditions functionally engraft more successfully than PSC-derived cells. Overall, we still need to determine ways to expand induced HSCs or precursor cells. The problems may lie in our lack of knowledge as to what inductive signals and microenvironmental cues are necessary to promote HSC expansion and maintain function.
A variety of different TF combinations have been used in these studies, all with varying levels of success. The primary difference among the groups is the starting cell population (Table 1, Figure 2). Disparity between different TF cocktails could be attributable to a balance between instigating a hematopoietic program and repressing the cell identity of the starting population. Consistency among certain TFs such as GATA2 may identify the crucial need of this factor to induce a developmental program (either HE or HB) for various cell types such as fibroblasts or PSCs [30, 61, 74, 75]. It is likely that key hematopoietic TFs such as RUNX1 will function in cells poised to generate HSPCs (such as HE cells) but will need to be turned on in other cell types as has been shown in fibroblasts going through the reprogramming process [30].
The methods by which TFs are introduced also add concern. Constitutive or conditional lentiviral expression remains the most common tool. Introduction of foreign DNA by this tool results in random genomic integration and may cause insertional mutagenesis and oncogenesis [82]. This concern is somewhat tempered by several successful gene therapy trials ongoing that use this technology [83]. This issue may be avoided by the use of modified mRNA or self-replicating mRNA technologies that have been previously shown to efficiently reprogram fibroblasts to iPSCs [84, 85, 86].
To date, the two most successful studies use starting cells (blood progenitors and endothelial cells) that are more epigenetically related to HSPCs than any other strategy [76, 77], suggesting that the role of epigenetic closeness of the starting cell population or epigenetic memory of the reprogrammed cells must be considered. Low passage iPSCs retain DNA methylation signatures of their precursor cell type that can restrict differentiation, but can be reset upon further passaging [87, 88]. This cell memory may thus inhibit function of the induced HSCs. Direct manipulation while reprogramming cells will be required to alter cell identity and overcome epigenetic memory [89]. These include the inductive signals of the microenvironment, as well as introduction of various agents such as small molecules to assist epigenetic reprogramming. Given what has been learned in recent years about the inductive signals of the niche as well as the impact of small molecules on HSPC expansion, the protocol that follows developmental hematopoiesis in vitro and incorporates these approaches will likely find the most success
|