Посещений:
ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ



Базирующиеся на iPSC технологии

Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress
• Yanhong Shi, • Haruhisa Inoue, • Joseph C. Wu • & Shinya Yamanaka
Nature Reviews Drug Discovery 16, 115–130 (2017) doi:10.1038/nrd.2016.245

Since the advent of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology a decade ago, enormous progress has been made in stem cell biology and regenerative medicine. Human iPSCs have been widely used for disease modelling, drug discovery and cell therapy development. Novel pathological mechanisms have been elucidated, new drugs originating from iPSC screens are in the pipeline and the first clinical trial using human iPSC-derived products has been initiated. In particular, the combination of human iPSC technology with recent developments in gene editing and 3D organoids makes iPSC-based platforms even more powerful in each area of their application, including precision medicine. In this Review, we discuss the progress in applications of iPSC technology that are particularly relevant to drug discovery and regenerative medicine, and consider the remaining challenges and the emerging opportunities in the field.


Рисунки к статье

В 2006 вышло сообщение, что профиль генной экспрессии и онтогенетический потенциал, сходный с таковым эмбриональных стволовых клеток (ESCs) может быть получен в производных соматических клеток мыши (таких как фибробласты) , используя коктейль их4-х транскрипционных факторов1. Эти клетки были названы induced pluripotent stem cells (iPSCs), а 4 фактора - OCT4, SOX2, KLF4 и MYC - были названы "Yamanaka factors". Год спустя две группы исследователей независимо сообщили о генерации iPSCs из фибробластов человека2, 3.
Вскоре после разработки технологии получения iPSCs человека, она была применена к созданию человеческих модельных 'болезней в чашке' и использована для скрининга лекарств в отношении как эффективности, так и потенциальной токсичности. Показаны преимущества получения человеческих iPSCs для моделирования болезней по сравнению с традиционным клеточным скринингом. Эти преимущества включают их человеческое происхождение, легкую доступность, способность к их увеличению, способность давать почти все желаемые типы клеток, избегание этических проблем, связанных с ESCs человека и потенциал развития персонализованной медицины с использованием специфичных для пациента iPSCs. Более того, недавние успехи в редактировании генома - в особенности CRISPR-Cas9 технология - делает возможной быстрое создание генетически определенных базирующихся на iPSC моделей болезней. iPSCs являются также ключевым компонентом в генерации более физиологически представительных клеточных платформ, включающих 3D архитектуру и многие типы клеток.

Box 1: Evolution of human iPSC technology

Since its beginning in 2006, induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has evolved rapidly. Because iPSCs were initially generated by introducing reprogramming factors via integrating viral vectors, such as retroviral or lentiviral vectors, there was a concern about the clinical application of these iPSCs owing to the potential for insertional mutagenesis caused by the integration of transgenes into the genome of host cells204.
To make iPSCs more clinically applicable, various non-integrating methods have been developed to circumvent the risk of insertional mutagenesis and genetic alterations associated with retroviral and lentiviral transduction-mediated introduction of reprogramming factors205. These non-integrating methods include reprogramming using episomal DNAs206, 207, adenovirus208, Sendai virus209, PiggyBac transposons210, minicircles211, recombinant proteins212, synthetically modified mRNAs213, microRNAs214, 215 and small molecules216, although the small-molecule approach is not yet applicable to human iPSC derivation.
Among these approaches, episomal DNAs, synthetic mRNAs and Sendai virus are commonly applied to derive integration-free iPSCs owing to their relative simplicity and high efficiency185. The use of nonviral methods or non-integrating viruses could avoid genomic insertions, thus reducing associated risks when human iPSCs are used for clinical applications.


iPSC технологии привлекают также существенный интерес благодаря её потенциальным возможностям для регенеративной медицины. Первое клиническое исследование для оценки клеток человека, происходящих из iPSC, было инициировано в 2014. В исследовании были использованы происходящие из iPSC- клетки retinal pigment epithelial (RPE) человека, для лечения макулярной дегенерации4, и лечение улучшало зрение пациентов5. Хотя испытание впоследствии было приостановлено из-за идентификации двух генетических вариантов в iPSCs второго пациента, ожидается его возобновление6.
Безусловно технология с iPSC человека открывает большие возможности для моделирования болезней человека, открытия лекарств и терапии на базе стволовых клеток и их потенциал начинает реализовываться.

iPSC-based disease modelling


Идентификация патологических механизмов, лежащих в основе болезней человека играет ключевую роль в открытии новых терапевтических стратегий. Модели на животных болезней человека позволяют идентифицировать патологические механизмы на определенных ст. развития и в специфических типах клеток in vivo.
Однако, существенные межвидовые различия могут помешать воспроизведению полностью фенотипов человеческих болезней у животных. Напр., хотя многие трансгенные мышиные модели были созданы для болезни Алцгеймера, ни одна не воспроизводит весь спектр патологии болезни у человека, включая существенную потерю нейронов7, 8. Поэтому имеется насущная необходимость в платформах для моделирования болезней человека для завершения исследований на животных моделях.
Моделирование болезни с использованием клеток, происходящих от пациентов, полезно для изучения этиологии болезней человека и разработки терапевтических стратегий этих болезней. Однако, отсутствие умножающихся источников первичных клеток от пациентов, особенно для клеток трудно доступных, таких как клетки головного мозга , является критически ограничением. iPSCs человека поэтому выступают в качестве привлекательной альтернативы, особенно для болезней с известной генетической причиной, которые могут быть смоделированы с использованием iPSCs, которые происходят из легко доступных типов клеток, таких как кожные фибробласты и клетки крови, от разных пациентов. Благодаря из внутренне присущим свойствам к самообновлению и потенциалу дифференцировки в почти любой тип клеток тела, специфичные для пациента iPSCs могут предоставить большие количества связанных с болезнью клеток и разнообразие разных типов клеток, которые ранее были недоступны, такие как нейроны и кардиомиоциты. Более того, поскольку iPSCs могут быть получены от самих относящихся к делу пациентов, они могут персонализировать моделируемые болезни, что является основой прецизионной медицины.
ESCs и iPSCs человека были использованы для моделирования генетических болезней человека. Самые ранние модели были разработаны с использованием ESCs9, но с появлением технологии iPSC человека, последние стали предпочтительным выбором благодаря полезности и отсутствию потенциальных этических проблем. Человеческие iPSCs очень сходны с человеческими ESCs. Оба типа клеток экспрессируют факторы плюрипотентности человека и маркеры поверхности ESC и обладают онтогенетическим потенциалом дифференцировки в три зародышевых листка2, 3. Остаточная эпигенетическая память соматических клеток может проявляться в iPSCs10-12, это может влиять на потенциал дифференцировки этих клеток13. Хотя сохранение эпигенетической памяти родительских клеток описано для iPSCs10- 12, сходные фенотипы были описаны при моделировании болезней с использованием человеческих ESCs и iPSCs в большинстве случаев13, подтверждая эффективность моделирования болезни с использованием iPSCs, происходящих от пациентов.
Моделирование болезни с использованием iPSCs человека, начинается с процесса получения iPSCs, содержащих болезнь вызывающих мутаций (Fig. 1). Эти клетки затем дифференцируются в относящиеся к болезни типы клеток. Возникающие в результате клетки используются для выявления этиологии болезни и идентификации патологических механизмов. В ранних исследованиях моделируемых болезней, базирующихся на iPSC, в качестве контроля использовали iPSCs, происходящие от индивидов, не имеющих болезни. Однако, подобно др. клеткам iPSCs обнаруживают межлинейные вариации, которые осложняют интерпретацию.

Figure 1: A schematic for human iPSC-based disease modelling.

The creation and use of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models typically involves the following steps. First, iPSCs are derived from individual patients, and isogenic controls are created using gene editing technologies such as CRIPSR-Cas9. The iPSCs are then differentiated into specific cell types, such as neural cells, and the resultant cells are studied to identify disease-specific phenotypes. Investigation of these phenotypes at the molecular level can allow the identification of new pathological mechanisms, providing opportunities for drug discovery and personalized medicine.

Быстро развивающаяся технология редактирования генома теперь позволяет вносить генетические изменения в iPSCs сайт-специфическим образом, включая коррекцию мутаций болезнь вызывающих генов в полученных от пациентов iPSCs и внесение специфических мутаций в не затронутые болезнью дикого типа iPSCs. Эти подходы делают возможной генерацию генетически совпадающих, изогенных линий iPSC с внесенными мутациями, как единственной переменной, гарантирующей действительную идентификацию настоящей патологии, избегая неразберихи с какими-либо несоответствиями в генетическом фоне или в эпифеномене, возникающих из-за межлинейных вариаций. Контроль изогенных iPSC особенно важен, когда моделирование спорадично или для полигенных , при которых фенотипические отличия ожидаются небольшими14.
Разработка программируемых сайт-специфических нуклеаз, включая zinc-finger nucleases (ZFN)15, 16, transcription activator-like effector nucleases (TALENs)17-19 и CRISPR-Cas9 system20-23 (Table 1), существенно улучшило эффективность редактирования генов в человеческих ESCs и iPSCs путем индукции разрывов двойной нити ДНК в месте модификации гена. Технология CRISPR-Cas9 в особенности привлекательна в использовании редактирования генов в ESCs и iPSCs благодаря простоте получения и легкости использования. Эта технология позволяет вносить мутации болезнь вызывающих генов в дикого типа iPSCs и элиминировать такие мутации в iPSCs пациентов, чтобы создавать изогенный контроль для моделей болезни, базирующейся на iPSC (Fig. 1).

Table 1: Technology for gene editing human ESCs and iPSCs Б a href="http://www.nature.com/nrd/journal/v16/n2/fig_tab/nrd.2016.245_T1.html"> Full table

Однако, основной проблемой в использовании технологии CRISPR-Cas9 является возможность возникновения побочных эффектов. Несмотря на эти относительно высокие уровни модификаций генов вне мишени с помощью CRISPR-Cas9, описанные в линиях раковых клеток24, недавние сообщения из многих лаб., использующих whole genome sequencing (WGS), показали, что модификации генов вне мишени являются редкими в нормальных клетках человека, включая человеческие iPSCs и ESCs25-29. WGS, использующее геномную ДНК, выделенную из оригинальных iPSCs и с соотв. редактированными генами iPSCs, в купе со сложным биоинформационным анализом25-29, оказалось пригодным для детекции побочных эффектов, таких, как single-nucleotide variants (SNVs) и инсерции или делеции (indels), особенно в клетках, которые будут использованы для клинического применения. На сегодня, WGS является дорогостоящим, но одидается, что цена упадет по мере разработки технологии. Альтернативные подходы для детекции побочных эффектов включают секвенирование экзома30 и целенаправленное глубокое секвенирование29. Особенно эффективен Cas-OFFinder31, алгоритм для идентификации сайтов вне мишени, включая SNVs или indels вне мишеней.
Первоначальная CRISPR-Cas9 технология редактирования геномных локусов осуществлялась путем индукции разрывов двойной нити ДНК с использованием одиночного гида РНК, управляющего дикого типа Cas9 нуклеазой. Версия nickase Cas9 (D10A mutant) , управляемая спаренными гидом РНК и искусственно измененными Cas9 вариантами нуклеазы с повышенной специфичностью (eSpCas9) теперь всё больше используются для геномного редактирования32-34 поскольку демонстрируют существенное снижение эффектов вне мишени с сохранением неумолимого разрезания по мишени34, 35. Более того, каталитически dead Cas9 (dCas9), слитая с активатором или супрессором транскрипции может быть использована, чтобы модулировать транскрипцию эндогенных генов (т.наз. CRISPRi или CRISPRa) или делать видимыми геномные локусы при слиянии с флюоресцентным белком32-34, 36. Модификации системы CRISPR-Cas9 также позволяют точное внесение изменений в последовательности ДНК точным моноаллельным или биаллельным способом37. Недавно полученные преимущества от слияния CRISPR-Cas9 и энзима cytidine deaminase делают возможными прямые превращения cytidine в uridine без необходимости разрыва двойной нити ДНК38. Этот новый подход редактирования генов повышает эффективность и облегчает редактирование генов в ESCs и iPSCs человека.
Базирующееся на iPSC моделирование болезней широко используется для изучения нарушений, вызываемых мутациями одиночных генов (моногенные болезни) и имеющих ранее начало39, 40. Этот подход идеально подходит для таких нарушений, поскольку iPSCs могут быть легко получены от пациентов и дифференцированы в клетки, имеющие отношение к болезни, такие как нейроны. Более того, учитывая относительную незрелость клеток, дифференцирующихся из iPSCs41, имеется значительная уверенность, что фенотипы клеток, дифференцирующихся из iPSCs, представляют собой прекрасную модель болезней с ранним началом в противовес болезням с поздним началом, для которых клеточное старение может быть важным для патологии болезни41. Напр., нейроны, дифференцирующиеся из iPSCs от пациента, были использованы для моделирования spinal muscular atrophy (SMA), болезни с ранним началом, вызываемой мутациями в survival motor neuron 1 (SMN1)39. Мутации в SMN1 приводили к дегенерации двигательных нейронов и последующей мышечной атрофии. Пациенты с типа 1 SMA обычно обнаруживают симптомы спустя 6 мес. после рождения, при этом болезнь быстро прогрессирует, что является фатальным в возрасте 2 лет42. При первоначальном iPSC-базирующемся моделировании болезни39, iPSCs, полученные из фибробластов пациентов с type 1 SMA были дифференцированы в типы клеток, связанные с болезнью, двигательные нейроны. Такие двигательный нейроны, полученные из iPSCs от пациентов, обнаруживают пониженную жизнеспособность по сравнению с контрольными двигательными нейронами. Более того, лечение этими полученными от пациента iPSCs с valproic кислотой и tobramycin (двумя соединениями, как известно, индуцирующими экспрессию SMN1) приводит к повышению уровней белка SMN1 и SMN1 белок-содержащих 'gems' (Ref. 39). Это исследование подтвердило принцип, что полученные от пациентов iPSCs могут быть использованы для моделирования генетических болезней с ранним началом и служить в качестве потенциальных платформ для скрининга лекарств.
Моделирование болезней, которые имеют позднее начало более затруднительно, поскольку клетки, дифференцирующиеся из человеческих iPSCs в целом обладают свойствами, характерными для плодов41. Однако, вызываемое клеточное старение было использовано с целью успешного моделирования болезней с поздним началом43-46. Одним из способов индуцировать старение в клетках, дифференцированных из iPSCs человека, является обработка этих клеток клеточными stressors: напр., соединениями, такими как MG-132 и pyraclostrobin, которые воздействуют на функцию митохондрий или пути деградации белка43, 44, 46, 47. Др. способ индуцировать клеточное старение является эктопическая экспрессия продуктов генов, таких как progerin, которые индуцируют преждевременное старение45. Однако, действительно ли клеточные stressors или экспрессия progerin могут вызывать клеточное старение посредством механизма, сходного с нормальным процессом старения, предстоит определить41. Более того, недавнее исследование показало, что созревание клеток и старение могут быть самостоятельными событиями41, 48. Остается неясным, действительно ли индукторы клеточного старения могут способствовать клеточному созреванию и старению, в противоположность запуску клеточного старения в незрелых клетках48. Альтернативно, подход по прямому перепрограммированию, который использует прямую конверсию фибробластов человека в др. клон-специфичные клетки, такие как нейроны, не стирает маркеры клеточного старения49. В самом деле, нейроны, происходящие из старых фибробластов путем прямого перепрограммирования, сохраняют клеточный возраст50, следовательно, преподносится альтернативная клеточная модель для изучения связанных с возрастом болезней. Следует упомянуть, что достигнут также успех в обеспечении клеточного созревания, путем использования улучшенной редакции культуральной среды51 или использования системы одновременного культивирования нейронов и астроцитов52, 53.
iPSCs предлагают также новый способ изучения спорадических болезней (причины которых не идентифицированы в истории семьи пациента или в генетических мутациях), это важно, поскольку большинство пациентов со многими болезнями имеют спорадические формы болезни. Напр., при болезни Алцгеймера, 95% пациентов попадают в спорадичную категорию. Интересно, что анализ нервных клеток, происходящих из iPSC от пациентов со спорадической болезнью. Алцгеймера, идентифицировал несколько спорадических случаев, обладающих одним и тем же фенотипом, что и при семейной болезни Алцгеймера, вызываемой мутацией специфического гена54. Эта находка указывает на возможность повторной классификации спорадических заболеваний с использованием iPSCs. Однако, моделирование спорадических болезней, используя iPSCs в целом является более трудным, чем моделирование моногенных заболеваний, поскольку фенотипические изменения при таких болезнях часто заставляют думать о множественных вариантах генетического риска с малыми эффектами в комбинации с внешне-средовыми факторами. Хотя iPSCs, получаемые от пациентов со спорадическими болезнями, д. содержать имеющие отношение к болезни варианты риска, использование iPSCs для модулирования таких болезней осложняется межлинейными вариациями генетического и эпигенетического фона. Такие вариации являются более проблематичными для моделирования спорадических болезней, поскольку фенотипы происходящих из iPSCs клеток от пациентов со спорадическими болезнями, как ожидается, будут едва различимыми по сравнению с теми, которые происходят из iPSCs пациентов с моногенными болезнями.
Т.о., ключевой вопрос для моделирования на базе iPSC человека спорадических болезней является, как сгенерировать paired изогенные клеточные линии, которые отличаются только подходящими вариантами риска14. Способность генерировать генетически контролируемые изогенные iPSC линии, в которых специфические ассоциированные с болезнью варианты риска являются единственными переменными, при использовании технологии CRISPR-Cas9 могут создавать хорошо контролируемые системы. Недавно такой подход был использован для генерации изогенных iPSC линий, которые отличаются вариантами риска, ассоциированными с болезнью Паркинсона, который в комбинации с аллель специфичным методом (assay), делает возможным мощное препарирование вариантов генетического риска55. Такая экспериментальная стратегия может быть приложима для изучения вариантов генетического риска, ассоциированных и с др. болезнями.
До сих пор изучено множество болезней с использованием единственного имеющего отношение к болезни типа клеток, произошедших от iPSCs. Напр., происходящие из iPSC нейроны были использованы для моделирования болезни Алцгеймера54, 56-68 (Table 2) и болезни Паркинсона43-45, 55, 69-84 (Table 3). Однако, более одного типа клеток может быть необходимо для создания эффективной модели некоторых болезней. В самом деле, сравнимые попытки были проделаны, чтобы смоделировать шизофрению, используя нейроны, происходящие из iPSC пациентов85-87 и клетки предшественников нейронов88-92. Чтобы более точно воспроизвести фенотипические отклонения при болезни, необходимо совместное культивирование более чем одного типа клеток, необходимо также изучение взаимодействий разных типов клеток. Напр., совместное культивирование астроцитов и нейронов было использовано для моделирования патологии amyotrophic lateral sclerosis (ALS)93-96. Система совместного культивирования позволяет исследовать клеточно неавтономные аспекты патологии болезни, которые иначе невозможны на одиночном типе клеток, таком как нейроны. Более того, такие исследования облегчают идентификацию астроцитов как критического клеточного компонента, который вносит вклад в дегенерацию двигательных нейронов при ALS и позволяет проводить поиск лекарств для ALS, используя происходящие от пациента iPSC производные астроцитов93-96.

Table 2: Patient-derived iPSC-based modelling of Alzheimer disease Full table

Table 3: Patient-derived iPSC-based modelling of Parkinson disease Full table

Взаимодействия между разными типами клеток могут быть лучше всего смоделированы с использованием 3D органоидов. Органоиды были созданы для многих органов, включая головной мозг, сетчатку, кишечник, почки, печень, легкие и желудок, используя как тканевые стволовые клетки, так и плюрипотентные стволовые клетки у мышей и людей97. Происходящие из iPSC человека органоиды были разработаны для разного использования, благодаря тому, что они напоминают организации из эндогенных клеток и органных структур и особенно пригодны для изучения межклеточных взаимодействий в клеточном контексте, которые воспроизводят физиологию и развитие человека. В самом деле, 3D органоиды были использованы для моделирования развития человеческих органов и болезней, чтобы тестировать терапевтические соединения и для клеточных трансплантаций98-114 (Table 4). Многие типы клеток, которые физиологически имеют отношение, могут быть сгенерированы в органоиды в соответствии с пространственно-временным порядком. Более того, клетки, генерируемые в органоидах, согласно протоколам, осуществляют взаимодействия клеток разных типов, таких как нейроны и астроциты, в 3D структуре. Следовательно, 3D органоиды облегчают выяснение болезненной патологии в онтогенетически подходящем пространственно-временном контексте и обладают потенциалом моделировать реакции на лекарства на уровне органа скорее, чем на уровне индивдуальных клеток.

Table 4: Human iPSC-derived organoids for modelling development and disease < a href="http://www.nature.com/nrd/journal/v16/n2/fig_tab/nrd.2016.245_T4.html">Full table
Хотя 3D органоиды представляют собой многообещающие инструменты для моделирования на базе iPSC болезней, технология органоидов имеет ограничения. Одной из проблем является создание платформ органоидов с повышенной эффективностью и воспроизводимостью по сравнению с традиционными 2D культурами115. Недавнее использование миниатюризированных вращающихся биореакторов с 3D организацией позволило создать органоиды переднего мозга с высокой воспроизводимостью110. Разработка более стандартизированных сред для культивирования органоидов вместе с более определенным внеклеточным матриксом , позволит в дальнейшем облегчить генерацию высоко воспроизводимых систем органоидов, которые будут более подходящими для аккуратного моделирования болезней, открытия лекарств и их разработки116. Др. препятствием является отсутствие васкуляризации современных систем органоидов97. Соотв., органоиды обладают ограниченным ростом и созреванием из-за отсутствия постоянной доставки питательных веществ. Вращающиеся биореакторы и качающиеся платформы для культивирования предоставляют лучшую доставку питательных веществ и улучшают рост органоидов110, 117. Кроме того, совместное культивирование с эндотелиальными клетками делает возможной образование сосудистой сети в органоидах99. Более того, трансплантации сгенерированных in vitro человеческих органоидов в соотв. части хозяев животных облегчает васкуляризацию и созревание органоидов. Такой подход с трансплантацией может быть приложим к органоидам с повышенным размером и улучшенным созреванием, если это необходимо для изучения.

iPSC-based drug discovery


Screening for efficacy


Поиск многих лекарств базируется на мишенях, которые рассматриваются как важные для механизма болезни. Однако, низкая эффективность этого подхода привела к смене интереса к фенотипическому скринингу118. Это возвращение к фенотипическому скринингу было обусловлено открытием iPSCs по многим причинам, включая масштабируемость продукции iPSC, что облегчает разработку метода. Более того, плюрипотентность iPSCs означает, что эти клетки могут быть дифференцированы во многие типы клеток, имеющих отношение к болезни, особенно те, к которым затруднен доступ, таким как нейроны119. Происходящие от пациентов iPSC модели делают возможным воспроизведение фенотипических отклонений болезни патологических состояний в культуральных чашках. Клетки, дифференцированные из iPSCs, происходящих от пациентов, д. обладать молекулярными и клеточными фенотипами. Действительно ли фенотипы, которые отбираются в качестве показателя для скрининга лекарств к болезни, могут быть подтверждены с помощью подхода редактирования генов, если ген, отвечающий за болезнь, известен и может быть в дальнейшем оценен в выборках от пациента и/или у модельных животных120. В дополнение к фенотипическому скринингу, iPSCs могут быть использованы для базирующегося на мишенях скрининга. Используя человеческие iPSC модели, был осуществлен поиск многих лекарств и потенциальные кандидаты были идентифицированы с использованием или фенотипического или базирующегося на мишенях скрининга.
Чтобы получать клетки мишени с высокой чистотой и в больших количествах, используются технологии очистки и обогащения с использованием специфических маркеров клеточной поверхности121, 122, клеточно-специфических промоторов123 и microRNAs124. В первом сообщении о крупномасштабном поиске лекарств с использованием базирующихся на iPSC моделей болезней, отсортировывали предшественники нервного гребня для аутономных нейронов и очищали от iPSCs, происходящих от пациентов при семейной dysautonomia, моногенной болезни с ранним началом, которая характеризуется дегенерацией нейронов в сенсорной и автономной нервной системе121. Эта болезнь вызывается мутациями в с IκB киназным комплексом-ассоциированном белке (IKBKAP), которые приводит к дефектам сплайсинга и к продукции нефункционального укороченного белка. Поиск лекарств проводился с использованием 6912 соединений и соединение, известное как SKF-86466 улучшало специфичный для болезни аберрантный сплайсинг. Интересно, что SKF-86466 не был эффективен в клетках не мишенях, включая iPSCs, фибробласты и лимфоциты. Эти результаты иллюстрируют преимущества скрининга лекарств на базе iPSC, чтобы воздействовать на специфичный для типа клеток патогенез.
Burkhardt et al.125 осуществляли моделирование болезни и поиск лекарства с использованием iPSCs, происходящих от пациентов со спорадическим ALS. Авт. идентифицировали de novo агрегацию TAR DNA-binding protein 43 (TDP43) в двигательных нейронах этих пациентов и затем использовали агрегацию TDP43 в качестве показателя при высокопроизводительном скрининге лекарства, чтобы идентифицировать соединения, снижающие агрегацию TDP43125. Те же самые исследователи сделали эффективным использование iPSC от пациентов для моделирования болезни Алцгеймера126. Авт. идентифицировали связанный с болезнью белок, extracellular tau (eTau), в кондиционной среде от кортикальных нейронов, происходящих из iPSCs от пациентов с болезнью Алцгеймера и затем создали терапевтические антитела против eTau126. Этот имеющий отношение к болезни белок не был бы обнаружен без использования человеческой iPSC модели. eTau вызывает гиперактивность нейронов и повышение продукции amyloid-β. Использование человеческих iPSC моделей в качестве инструмента для идентификации связанных с болезнью мишеней может быть важным компонентом для будущего поиска лекарств. Naryshkin et al.127 установили, что происходящие от пациентов iPSC, моделирующие SMA могут быть использованы для оценки специфичных для человека и болезни чувствительности к лекарствам после инициального скрининга с использованием HEK293 линии клеток127. Эти соединения затем оцениваются на специфичных для пациентов фибробластах и дифференцированных двигательных нейронах из iPSCs, происходящих от пациентов127. Наконец, удачное соединение оценивается на мышиных моделях в отношении активности in vivo 127. Такой подход к открытию лекарства включает модели, происходящие из iPSC пациента, как одну из ступеней оценки пригодности лекарства для данного пациента и болезни.
В целом, базирующийся на iPSC скрининг лекарств был использован для оценки более 1000 соединений для разных болезней121, 125, 128, 129 (Table 5), и было идентифицировано несколько клинических кандидатов126,127, 130 (Table 6). Однако, эти исследования нуждаются в значительном количестве времени (несколько недель или более), чтобы дифференцировать iPSCs в типы клеток, относящиеся к болезни. Хотя такая продолжительность, по-видимому, не столь длинна для фенотипического скрининга, предпочтителен более короткий период дифференцировки, чтобы избежать вариации в качествах клеток. Поэтому разыскиваются более быстрые и более стабильные методы дифференцировки, обеспечивающие более высокую созреваемость и чистоту. Альтернативный подход к осуществлению скрининга лекарств использует клетки, происходящие в результате прямой конверсии131, 132. Прямая конверсия заставляет соматические клетки мишени (напр., фибробласты) экспрессировать клеточно-специфичные транскрипционные факторы и перепрограммировать одно состояние соматических клеток в др. состояние соматических клеток без прохождения через состояние iPSC49, 132. Прямая конверсия была использована для перепрогаммирования в миокардиальные клетки, клетки печени, нервные клетки и др. типы соматических клеток из разных типов соматических клеток, таких как фибробласты. Преимущества прямого превращения заключаются в том, что могут быть получены аутентичные нейроны человека, обладающие важными аспектами клеточного старения50. Однако, не возобновляемый источник клеток, получаемый в результате этого подхода может быть непригоден для высокопроизводительного скрининга лекарств. Принудительная экспрессия транскрипционных факторов также предлагает потенциал для более быстрой дифференцировки iPSCs от пациентов. В недавнем исследовании принудительная экспрессия myogenic differentiation 1 (MYOD1), главного регулятора дифференцировки скелетных мышц, была использована для продукции новых клеточных моделей для неподдающихся патологий мышечных болезней, таких как Miyoshi myopathy133 и Duchenne-типа мышечной дистрофии134.

Table 5: Large-scale drug screening using human iPSCs Full table

Table 6: Drug candidates derived from iPSC research currently in clinical trials Full table

Для генетических нарушений контрольная группа может быть создана путем осуществления коррекции мутантного аллеля гена в полученных от пациентов iPSCs. Сравнения между разными группами iPSCs (здоровые, от пациентов и iPSCs от пациентов с корректированным геном) может позволить оценит результаты скрининга генов119. iPSCs являются также бесценными моделями в случае спорадических болезней. В этих случаях, поскольку неизвестна причинная мутация, природу контрольной группы трудно установить; однако, связанные с болезнью single-nucleotide polymorphisms (SNPs) могут быть рассмотрены вместо этого65. iPSCs от спорадических болезней д. облегчать исследования, вызывается ли болезнь генетическими факторами, такими как SNPs, соматические мутациями, мозаицизмом или эпигенетическими факторами. 135.
Др. применением специфичных для болезни iPSCs участие в повторном позиционировании лекарства, при котором уже существующие лекарства, разрешенные для специфических болезней, тестируются, чтобы найти новое применение при др. болезнях. Напр., модельные iPSC человека, полученные от пациентов с achondroplasia из-за мутаций в fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3), обнаружили, что происходящие от пациентов iPSCs плохо дифференцируются в хрящевую ткань136. Используя эту модель для скрининга молекул, которые бы восстанавливали дифференцировку iPSCs в хондроциты из дефектного хрящевого фенотипа, были выявлены несколько статинов, которые являются разрешенными лекарствами при сердечно-сосудистых заболеваниях. В том же исследовании было установлено, что статины могут способствовать росту укороченных конечностей в мышиной модели FGFR3-сцепленной болезни. Эти результаты показали, что статины могут быть лекарствами кандидатами для achondroplasia136. В качестве др. примера дополнительного использования лекарства, является противоэпилептическое лекарство ezogabine продемонстрировавшее эффективность на iPSC модели болезни двигательных нейронов ALS и теперь находящегося на клинических испытаниях137. Авт. продемонстрировали эффект ezogabine на iPSC модели, полученных как от пациентов с ALS, обладающих мутациями в гене superoxide dismutase 1 (SOD1), так и от пациентов ALS, обладающих мутациями в др. генах, сцепленных с ALS, таких как C9ORF72 и FUS. Было также продемонстрировано, что iPSC моторные нейроны, полученные от пациентов с ALS первоначально обнаруживают состояние гипер-возбудимости с последующим снижением возбуждения138. Эта находка подтверждает, что раннее вмешательство с помощью ezogabine может быть необходимо для лечения ALS.

Screening for toxicity


Разработка новых лекарств чрезвычайно дорогая. Высокая цена в основном из-за отказа, особенно от тех, что на поздней стадии, клинических испытаний, что, в свою очередь, частично обусловлено непредвиденными побочными эффектами139, 140. Многие непредвиденные побочные эффекты от новых кандидатов лекарств могут возникнуть из-за токсичности для сердца или печени. Поэтому имеется огромный интерес к разработке походов, которые могли бы эффективно предсказывать склонность лекарств кандидатов вызывать серьезные побочные эффекты, помогая тем самым с выбором кандидатов, которые не приведут к отказу от продолжения испытаний в поздней фазе.
Летальные аритмии с удлинением QT интервала объясняют 21% от всей кардиальной токсичности141. Удлинение QT является побочным эффектом, связанным с человеческим ether-a-go-go-related gene (hERG; известен также как KCNH2) каналов. Тестирование кардиальной надежности прежде всего зависит от hERG assay, поскольку блокирование hERG тока рассматривается как связанное со смертельной вентрикулярной аритмией, наз. torsades de pointes. Однако, было установлено, что 40-60% лекарств, которые подавляют токи через канал hERG, не вызывают удлинение QT142, 143. Эти ложно положительные результаты с hERG assay могут препятствовать разработке необходимых лекарств. Различные пре-клинические стратегии были предложены, чтобы определять вызываемую лекарствами электрофизиологическую кардио-токсичность, включая использование in vitro методов ионных каналов человека, human-based in silico реконструкции и происходящие из стволовых клеток человека кардиомиоциты144. Недавние попытки показали, что подходы со множественными электродами, использующие кардиомиоциты, происходящие из iPSC человека, могут представить реальные, рентабельные суррогаты для пре-клинического in vitro тестирования145 , которые могут быть использованы для оценки рисков аритмии146.
Для определения гепатотоксичности используется линия клеток гепатоцитов или первичные гепатоциты человека. Однако, эти модели также имеют ограничения, включая клеточные ресурсы, потерю функции в результате замораживания-размораживания и lot-to-lot вариацию. Недавно человеческие происходящие из ESC и iPSC печеночные клетки были получены, которые экспрессируют функциональные молекулы, такие как цитохром P450 3A4 (CYP3A4), могут воспринимать indocyanine green147 и отвечать на известные гепатотоксические лекарства148. Функциональные 3D печеночные зачатки органов были описаны, которые могут лучше обеспечивать скрининг лекарств99.
Наконец, в отношении нервной системы, платформа, которая оценивает побочные эффекты лекарств, использует плюрипотентные стволовые клетки, находится в разработке. Чтобы провести такую оценку, предлагается анализ альтераций генной экспрессии клеток нервной системы, таких как нейроны, мезенхимные стволовые клетки и сосудистые эндотелиальные клетки, происходящие из человеческих ESCs в культуральных чашках149.

Clinical applications using human iPSC products


Потенциал регенеративной медицины базируется на использовании стволовых клеток, чтобы способствовать эндогенным регенеративным процессам или замещению поврежденных тканей после трансплантаций клеток, представляет огромный интерес. С момента открытия человеческих ESCs в 1998 (Ref. 150) и человеческих iPSCs в 2007 (Refs 2,3), продолжается идентификация всё более подходящих источников для клеточной терапии и эндогенной репарации у людей. Генеральный подход к разработке базирующейся на iPSC клеточной терапии суммирован на Рис. 2. Из 13 в настоящее время проводимых клинических испытаний по оценке продуктов для терапии стволовыми клетками, 8 связаны с ESC- и 1 с iPSC-происходящими клетками RPE для лечения макулярной дегенерации, которая вызывает прогрессирующее изнашивание свет-воспринимающих фоторецепторов глаз (see ClinicalTrials.gov)151. В 2014, первое клиническое испытание с использованием продуктов iPSC человека было инициировано путем трансплантации RPE листка, происходящего из собственных iPSCs пациента. Терапия приводила к положительным результатам, останавливала макулярную дегенерацию и улучшала зрение пациентов. Хотя испытание было приостановлено из-за мутаций, обнаруженных в iPSCs4 второго пациента, ожидается их возобновление6. Кроме того, недавнее исследование продемонстрировало легкость трансплантаций, происходящих из ESC клеток кардиальных предшественников, внедренных в фибриновый каркас пациентам с тяжелой сердечной недостаточностью152.



Figure 2: A schematic for human iPSC-based cell therapy.

The development of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-based cell therapies can be broken down into six steps. First, somatic cells are collected from affected patients and cultured. Second, the patient somatic cells are reprogrammed into iPSCs. Third, genome editing technology or a viral transduction method is used to genetically correct the patient-derived iPSCs. Fourth, the corrected iPSCs are differentiated into desired cell types to serve as genetically matched healthy donor cells. Fifth, quality control tests for cell identity, purity, activity and safety are performed. Finally, the genetically matched healthy cells are transplanted into patients for cell therapy.

Однако, имеется несколько препятствий, связанных с базирующейся на iPSC терапией, которые необходимо устранить прежде рутинного клинического использования153. Одним из затруднений является риск возникновения опухолей из ESCs и iPSCs154. Поскольку плюрипотентные клетки сохраняются в культуре продолжительные периоды времени, они могут накапливать кариотипические аномалии и копировать ряд вариантов и терять гетерозиготность155. Поэтому перед клиническим использованием, iPSC-произошедшие продукты д. быть тщательно отобраны в отношении отсутствия потенциально рискованных генетических альтераций155 и строго протестированы, чтобы гарантировать их чистоту, качество и стерильность.
Хотя дифференцированные продукты из iPSCs, как было установлено, не генерируют тератом, важно гарантировать, что финальный продукт не содержит недифференцированных клеток, которые могли бы генерировать тератомы. Соответственно необходимы улучшенные протоколы дифференцировки человеческих iPSCs в определенные типы клеток с точными качественными характеристиками и клеточными функциями. С этой целью низкомолекулярные ингибиторы, которые, как было установлено, индуцируют избирательную и полную клеточную гибель недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, не нарушая их дифференцированных производных, были идентифицированы156, 157. Лечение происходящих из iPSC клеточных продуктов с помощью этих ингибиторов может снизить потенциал туморогенности. Др. потенциальным решением является сортировка клеток, происходящих из iPSC, перед трансплантацией путем позитивной селекции желательных- типов клеток и негативной селекции против человеческих ESC маркеров, используя флюоресценцией активированную сортировку клеток. Наконец, риск туморогенности может быть протестирован на модельных животных перед трансплантацией. Этот подход может быть неприменим для пациентов с быстро прогрессирующей болезнью.
Как только клетки надежно доставляются, пациенты д. быть идеально отслеживаемы в отношении развития потенциальных опухолей и активации иммунной системы158. Один подход для мониторинга опухолей может оценивать усиление ангиогенеза, которое часто сопровождает образование тератом, которое может быть обнаружено, используя 64Cu-меченный циклический arginine-glycine-aspartic acid тетрамер (64Cu-DOTA-RGD4), отслеживая радиационый след с помощью positron-emission tomography imaging159. Др. подход может быть использован в комбинации с биомаркерами сыворотки (напр., carcinoembryonic антиген, α-fetoprotein или человеческий хориональный гонадотропин) и magnetic resonance imaging скрининг160. Однако, следует отметить, что эти подходы будут в основном пригодны на пре-клинической стадии, особенно, если они уже являются частью процедуры получения изображений, необходимых для оценки конечного результата. Их осуществимость и необходимость для будущих испытаний на человеке предстоит определить.
Отсутствие эффективного метода индукции иммунной толерантности является крупным препятствием для терапии, базирующейся на ESC человека. ESCs с определенных пор рассматриваются как иммуно-привилегированными благодаря низкому уровню экспрессии major histocompatibility complex (MHC) класса I, MHC класса II и одновременно стимулирующих молекул161. Хотя недифференцированные ESCs могут быть иммуно-привилегированными, их дифференцированные производные могут запускать клеточные и гуморальные иммунные реакции162. Напротив, аутологические iPSCs могут избегать высокой цены и серьезных побочных эффектов, ассоциированных в течение всей жизни с иммуносупрессией, необходимой для трансплантации аллогенных клеток163. Несмотря на некоторые противоречия относительно иммуногенности недифференцированных iPSCs164, недавние исследования продемонстрировали, что дифференцировка iPSCs д. приводить к потере иммуногенности165-167.
Использование клеток, происходящих от индивидуальных пациентов, т.е. своих собственных iPSCs, или iPSCs от совместимых доноров может стать краеугольным камнем для прецизионной медицины и имеет важные преимущества, которые необходимы для долговременной иммуно супрессии, чтобы сохранять трансплантированные клетки. В самом деле, первые клинические испытания с iPSC использовали RPEs из аутологичных iPSCs, получаемых от пациента. Использование аутологичных iPSC производных для персонализованной медицины, по-видимому, может быть идеальным для редких (orphan) болезней, поскольку не нужны массивные вложения клеток. Однако, для более распространенных болезней, особенно остро протекающих болезней, таких как инсульт или инфаркт миокарда, терапия аутологичными iPSC может быть не практичной из-за большого количества пациентов, высокой цены и длительного периода времени, необходимого для тщательной оценки каждой клеточной линии. Поэтому вторая фаза испытаний iPSC RPE в Японии базировалась на использовании аллогенных продуктов168.
Подход с аллогенными iPSC д. также привести к снижению цены базирующейся на iPSC клеточной терапии. За исключением высокой стартовой цены, продукция каждой линии iPSC стоит ~US$ 10000-20000169. Сталкиваясь с сегодняшними потребностями для хорошей производственной практики, цена будет существенно выше170. Затраты приблизительно в $800000 (Ref. 169), чтобы создать производный iPSC тканевой продукт, подходящий для клинического использования (напр., дифференцировка iPSC нервных клеток для инсультов, iPSC кардиомиоцитов для инфаркта миокарда или iPSC RPE клетки для макулярной дегенерации). Использование iPSCs для аллогенных трансплантатов д. существенно снизить цену, т.к. одно производно может быть использовано для многих пациентов. Чтобы облегчить аллогенные трансплантации необходимо улучшить эффективность традиционных протоколов иммуносупрессии и обновить режимы co-stimulatory блокаторов для индукции устойчивости к иммунной системе в пред-клинических и клинических испытаниях171, 172. Более того, понимание, как плюрипотентные стволовые клетки взаимодействуют с иммунной системой и почему они могут быть более толерантными, чем др. трансплантированные клетки, может привести к идентификации новых иммуносупрессивных механизмов и стратегий163. Более того, трансплантации в иммунно-привилегированные места могут служить возможной стратегией для преодоления иммунного отторжения. Стратегии геномного редактирования могут создать универсальные принимаемые донорские клетки173.
Комбинация платформы человеческих iPSC с недавно разработанным генным редактированием и технологией 3D органоидов может сделать человеческие iPSCs даже более мощным рессурсом клеток для разработки клеточной терапии, базирующейся на стволовых клетках. В качестве проверки принципа мышиные iPSCs корректировали с помощью генного редактирования, чтобы создать гематопоэтические предшественники для успешного лечения серповидно-клеточной анемии у мышиных моделей174. Более того, интеграция генетически скорректированных человеческих iPSCs с 3D органоидами может сделать возможной генерацию ткани, в качестве источника для орган замещающей терапии97. В самом деле, из человеческих iPSC-происходящие печеночные органоиды, как было установлено, успешно генерируют функциональную подобную печени ткань человека у мышей после трансплантации99. Однако, всё ещё имеются проблемы преодоления для таких подходов применительно к терапии человеческими клетками. Напр., потенциал эффектов вне мишени, ассоциируемый с редактированием генов, д. быть изменен, как это сделано с ограничениями органоидов, описанных в разделе "iPSC-based disease modelling".

Perspectives


Открытие iPSCs создало революционную новую исследовательскую платформу для изучения болезней. Достигнут существенный прогресс, однако, некоторые важные вопросы остаются.
iPSC клоны обнаруживают вариации в эффективности дифференцировки, включая клоны, получаемые от одной и той же личности119. Эти вариации являются важными для выбора контрольных групп при моделировании болезней. Применение технологии CRISPR-Cas9 может помочь решить этот вопрос. Показано, что коррекция генов с мутациями в iPSC улучшает болезненный фенотип дифференцированных клеток175-178. Кроме того, чтобы скорректировать генные мутации в болезненных iPSCs, исследователи успешно вносят генные мутации в здоровые iPSCs87, 88. Однако, остаются некоторые проблемы по комбинированию технологии CRISPR-Cas9 с технологией iPSC, включая эффекты вне мишени при CRISPR-Cas9 редактировании, и высокую цену осуществления и ограниченные возможности генного редактирования генетических болезней с неизвестными болезнь вызывающими мутациями или вариантами риска14. Тем не менее потенциал такой комбинации для выявления механизмов болезни и создания новых клеточных терапий высок. Более того, CRISPR-Cas9 или CRISPRi-based геномный скрининг генов179, 180 в человеческих iPSCs сможет открыть новые пути для понимания основных биологических механизмов, лежащих в основе плюрипотентности, поддержания и дифференцировки iPSC человека.
В противоположность мышиным ESCs и iPSCs, которые представляют собой 'naive' состояние и являются гомогенными, человеческие ESCs и iPSCs представляют собой 'primed' состояние и гетерогенны как в отношении клеточной популяции, так и потенциала дифференцировки181, 182. Более того, процесс репрограммирования может приводить к полностью перепрограммированным iPSCs и к частично перепрограммированным клеткам, которые могут обладать разными потенциалами дифференцировки183, 184. Следовательно, человеческие iPSCs нуждаются в более тщательном отборе и полной характеристике их плюрипотентности перед клиническим применением185. Дальнейшие базовые исследования по механизмам репрограммирования смогут помочь исследователям по разработке методов, которые облегчат генерацию стандартизованного состояния iPSC человека, это д. привести к снижению технической вариабельности и сделать возможной идентификацию настоящих биологических фенотипов. Помимо клональной вариации в отношении эффективности дифференцировки iPSC, др. препятствием на пути моделирования болезней являются межлинейные вариации в созревании дифференцированных клеток. Становление зрелых клеток требует улучшения культуральных условий и использование превращения судьбы с помощью регуляции генов119. Недавние технологии, переключение microRNA124, как полагают, повысят качество созревания клеток. дифференцированных из iPSC и снизят клональную вариабельность.
Описано использование специфичных для болезни iPSCs, технологий для индукции дифференцировки некоторых 3D структур, включая те, что сходны с корой, глазным бокалом, карманом Ратке, мозжечком и гиппокампом186-191. Используя преимущества формирования динамичного паттерна и самообразования структур зачатков сложных органов, конструкция 3D структур и их соотв. сетей становится реальностью. Такие стратегии уже используются при моделировании болезней и аномалий головного мозга117 и умственной отсталости108. Подобно самоорганизации эктодермальных тканевых структур, формирование энтодермальной ткани в 3D культурах стволовых клеток99 разработано и испробовано для моделирования болезней ЖКТ192. Физиологические взаимодействия среди сложных тканей из разных клонов, но с одним и тем же генетическим фоном, таких как гематоэнцефалический барьер193 или иммунная система194, 195 в органоидах, д. предоставить новую информацию о нормальной физиологии и болезнях196, 197.
Хотя существуют некоторые ограничения для современных 3D технологий198, 199, комбинирование специфичных для болезни iPSCs с 3D технологиями делает возможным проверку пространственно-временных взаимодействий клеток, которые могут выявить физиологический статус болезни, предоставляя тем самым беспрецедентную платформу для скрининга лекарств и открытия новых возможностей заместительной тканевой терапии. Однако, трансплантации органоидов человека, происходящих из стволовых клеток, животным, чтобы генерировать ткани человека или органы может вызвать новые вопросы биомедицинской этики200, из-за потенциала трансплантируемых стволовых клеток человека в смеси с клетками хозяина и развития в нервной системе и зародышевых линиях животных хозяев.
iPSCs предоставляют также новый путь для изучения спорадических болезней. Ранее было невозможно анализировать спорадические болезни на клеточных моделях, но теперь некоторые исследования осуществили успешное моделирование спорадических нейрологических заболеваний54, 57, 65, 73, 85, 108, 125, 135, 201,202. Было предположено, что патологические механизмы спорадических болезней те же самые. что и семейных болезней. Однако, между ними имеются заметные отличия, такие как возраст начала и тяжесть, а ткже патология.
iPSC модели подтверждают, что даже если эффект от каждого индивидуального генетического риска мал, комбинированный эффект может инициировать и ускорить развитие патологии при спорадических болезнях. Кроме того, даже если только генотипирование SNP указывает на малый фактор риска, это может быть важным, а моделирование патологического фенотипа с помощью iPSC технологии может привести к повторной классификации спорадических болезней. Это важно для разработки лекарств. iPSC моделирование обладает потенциалом идентифицировать подгруппы пациентов, чувствительных к лекарствам, включая пациентов со спорадическими болезнями, это д. улучшить качество клинических испытаний119. Происходящие из iPSC клетки могут обеспечить более точный анализ индивидуальных генов и белков, участвующих в болезни.
Если анализ клеточных фенотипов in vitro iPSC моделей клинически отличающихся болезней показывает, что фенотипы идентичны или сходны, то лечение, эффективное для одной болезни, может быть эффективным и для др. Напр., когда iPSC модель биполярных расстройств идентифицирует гипервозбудимые клетки нейронов201. Сходная гипервозбудимость двигательных нейронов, происходящих из iPSC, от пациентов с ALS203. Следовательно, один и тот же терапевтический агент может быть эффективен для этих клинически различающихся, но клеточно сходных болезней. Накапливаются данные о клеточных фенотипах iPSC моделей с частичной перекрываемостью (cross-sectional) вариабельности болезней, это может вносит вклад в новую стратификацию и понимание разных болезней, что д. приводить также к новым cross-sectional терапевтическим подходам.
Разработка iPSC технологии создает новый путь определения и лечения болезней. iPSCs представляют пример сдвига, поскольку они делают возможным прямое наблюдение и лечение имеющих отношение клеток пациента. В частности, они делают возможным выявление новых взаимоотношений между болезненными фенотипами и профилями генной экспрессии, это расширяет и углубляет наше понимание развития болезни у пациента, особенно спорадических болезней.