Одним из наиболее фундаментальных аспектов регуляции зародышевой линии является мейоз, в ходе которого хроматин зародышевых клеток приобретает новую конфигурацию [1], происходит обмен генетического материала между гомологичными хромосомами и зародышевые клетки в конечном итоге уменьшают наполовину генетический материал по сравнению с родительской клеткой [2]. У мышей оогонии вступают в мейоз I на эмбриональный день 13.5 (E13.5), после того как продукция ретиноевой кислоты (RA) активирует ген Stimulated by Retinoic Acid 8 (Stra8) [3-6]. Ооциты проходят через стадию профазы I мейоза I, при этом возникают мейотические разрывы двойной нити в лептотене, происходит сборка синаптонемального комплекса в зиготене, завершается синапс в пахитене и, наконец, происходит арест в диплотене, после завершения мейотической рекомбинации [7,8]. Начало мейоза в ооцитах человека происходит в яичниках плода человека приблизительно на 11-12 неделе беременности, после чего арест диплотены начинается приблизительно на 16-20 неделе [8-10]. Удивительно, эти арестованные ооциты остаются в диплотене вплоть до первого мейотического деления непосредственно перед овуляцией [7], которая наступает несколько мес. позднее у мышей и десятки лет позднее у людей. У женщин эти ооциты могут не быть использованы для зачатия до 50 лет после их первоначального образования и ареста. Следовательно, эти ранние эмбриональные мейотические события д. происходить со чрезвычайной точностью, и должны гарантировать долговременную целостность генома, обеспечивающую соотв. оплодотворение и развитие.
Сложная регуляция экспрессии генов является критической для мейотической программы и последующей упаковки мейотически арестованных ооцитов в примордиальные фолликулы. Ряд транскрипционных факторов, как известно, играет роль в этих процессах, а также в в разрыве кисты зародышевой клетки, включая Factor in the Germline Alpha (FIGLα) [11,12] и Newborn Ovary Homeobox Gene (NOBOX) [13-15]. Др. многообещающим кандидатом, участвующим в мейозе и регуляции резерва яичников, является TAF4b, концентрирующаяся в гонадах субъединица комплекса TFIID, который является критическим для плодовитости самок мышей [16]. TFIID является комплексом мультибелковых общих транскрипционных факторов, состоящим из TATA-box binding protein (TBP) и 14 TBP-associated factors (TAFs). Taf4b-дефицитные самки мышей страдают от характерной primary ovarian insufficiency (POI), включая постоянный estrous, повышение сывороточного follicle stimulating hormone (FSH) [17] и ускоренное истощение примордиальных фолликулов [18]. Недавно мы показали, что TAF4b необходим для собственно разрыва кисты зародышевой клетки, сборки примордиального фолликула и выживания ооцита в промежуток времени хода мейоза в перинатальных яичниках мыши [19]. В конексте сохранения ооцита у человека сообщение Dutch premature ovarian failure (POF) Consortium о связи с вариациями single nucleotide polymorphism (SNP) в гене TAF4B человека с POI [20], в то же время сообщается, что экспрессия TAF4B возможно коррелирует с высокой качественностью ооцитов [21]. Также установлена критическая функция TAF4b в развитии мышиного овариального резерва, но точная функция TAF4b в ранних ооцитах и потенциальные механизмы ооцит-специфической регуляции генов остаются плохо изученными.
Чтобы достичь лучшего понимания потенциальных ролей TAF4B's в развитии ооцитов человека, мы использовали данные по профилированию глобальной экспрессии генов в яичниках плодов человека [22]. Согласно нашему анализу, мы установили, что экспрессия
TAF4B человека высоко скоррелирована с экспрессией критических регуляторов мейоза, включая SYCP3, Y Box Binding Protein 2 (YBX2, известен также как MSY2) и Deleted in Azoospermia-Like (DAZL). Более того, чтобы выяснить фундаментальные молекулярные механизмы, связанные с нормальным ходом мейоза и становление овариального резерва, мы анализировали события профазы I в контексте
Taf4b-дефицитных яичников на ст. E16.5. Важно, поскольку дефицитные по
Taf4b яичники обнаруживали ускоренную гибель зародышевых клеток непосредственно после рождения, они обладали нормальной плотностью зародышевых клеток во время позднего эмбриогенеза, что позволило сравнивать эти популяции клеток [19]. Настоящий анализ мейоза I в эмбриональных овариях, дефицитных
Taf4b, выявил измененный ход профазы I и изобилие asynapsis, а также изменения в аресте диплотены в
Taf4b-дефицитных ооцитах. Мы также наблюдали дефицит способности у Taf4b-дефицитных ооцитов осуществлять мейотическую гомологичную рекомбинацию. Наконец, метод chromatin immunoprecipitation (ChIP) продемонстрировал непосредственное расположение TAF4b на проксимальных промоторных регионах критических мейотических генов и регуляторов оогенеза, включая Stra8, Dazl, Figla и Nobox, что помещает TAF4b выше этих важных регуляторов оогенеза. Эти данные помогли объяснить критическую роль TAF4b в становлении пула постнатальных примордиальных фолликулов и выяснить новые функции TAF4b в контроле ранних мейотических событий.
Discussion
Плодное развитие представляет собой временные рамки, когда зародышевые клетки самок увеличиваются за счет митотических делений и затем драматически уменьшаются, продуцируя в конечном итоге, по-видимому, ограниченный овариальный резерв. Такая динамика пролиферации сопровождается арестом митозов и значительным апоптозом зародышевых клеток перед сборкой примордиальных фолликулов, что совпадает с течение профазы I, указывая тем самым, что это может быть механизмом контроля качества, при котором только ооциты наивысшего качества отбираются для долговременного выживания [37]. Поэтому регуляция этого временного промежутка д. быть не только тонко настроенной, но и д. давать высоко стабильные ооциты, которые могут поддерживать целостность генома и экспрессию генов в ходе всего репродуктивного периода.
Непосредственно перед становлением этого ограниченного резерва, адекватное прохождение через профазу I мейоза гарантирует целостность генома за счет спаривания гомологичных хромосом, облегчающего мейотический кроссинговер и в конечном итоге приводящего к аресту ооцитов в высоко стабильной конформации хромовом, которая может персистировать вплоть до овуляции [4]. Нарушения этих ранних мейотических событий, а также изменения генной экспрессии, как известно, вызывают ускоренное истощение овариальных фолликулов, которое может приводить к преждевременному репродуктивному старению и связанным с ним бесплодием [38]. Мы продемонстрировали, что TAF4b необходим в яичниках, чтобы соотв. образом регулировать экспрессию существенных для мейоза и оогенеза генов, а также гарантировать качественное течение профазы I и рекомбинацию, которые собственно и приводят к становлению овариального резерва. Эти данные подтверждают новую роль TAF4b не только в способствовании своевременной инициации мейотической программы во время эмбрионального развития, но и также в оккупации промоторов и модулирующих экспрессию генов, как известно, важных регуляторов оогенеза.
Метод ChIP выявил роль TAF4b в непосредственной оккупации промоторов ряда генов, известных как "master regulators" оогенеза, включая транскрипционные факторы Figlα и Nobox. Удивительно, Figlα и Nobox мутантные яичники строго фенокопируют Taf4b-дефицитные яичники, при этом Figlα-дефицитные мыши обнаруживают гибель зародышевых клеток непосредственно после рождения [12], а Nobox-дефицитные мыши обнаруживают дефекты разрыва цист, а также потерю примордиальных фолликулов [13,15]. Наши исследования подтвердили роль TAF4bа регуляции собственно экспрессии этих генов посредством прямой активации транскрипции.
Наши исследования подтвердили, что мейотические ошибки могут лежать в основе быстрой перинатальной потери ооцитов, наблюдаемой у Taf4b-дефицитных мышей. Во-первых, мы выявили дифференциальную экспрессию мРНК и белка мейотических эффекторов, включая Sycp1, Sycp2 и MSY2 в Taf4b-дефицитных ооцитах. Поскольку эти эффекторы все играют важные мейотические роли [39-42], мы исследовали течение мейоза в Taf4b-дефицитных ооцитах и наблюдали lag-период во временной прогрессии между ступенями профазы I, а также неполные синапсы и персистенцию γH2AX в большинстве Taf4b-дефицитных ооцитов. Помимо этих поразительных ошибок мейоза, стадия диплотны достигается лишь небольшим количеством Taf4b-дефицитных ооцитов PND0, за день до того, как большинство их подвергнется избыточному изнашиванию.
Более того, экспрессия мРНК Stra8 снижена почти в 4 раза на ст. E13.5 в Taf4b-дефицитных яичниках по сравнению с таковыми дикого типа, указывая, что TAF4b частично контролирует его экспрессию. Т.к. начало и ход мейоза очень чувствительны к дозе Stra8, то это уменьшение экспрессии Stra8 может лежать в основе снижения экспрессии нижестоящих генов, кодирующих белки синаптонемальных комплексов, а также дефицита мейоза и asynapsis. Интересно, что низкие уровни экспрессии Stra8 безусловно достаточны для некоторой степени вступления в мейоз. Пока мы неспособны различать между дефектами профазы I , наступающими в результате задержки начала мейоза в противовес др. механистическим ошибкам, а снижение экспрессии Stra8 подтверждает, что начало мейоза может быть затронуто в Taf4b-дефицитных ооцитах. Более того, поскольку мы не можем исключить отклонения в начале мейоза, но наши данные, демонстрирующие снижение рекомбинации в пахитене Taf4b-дефицитных ооцитов указывают на то, ооциты одинаковых стадий развития обнаруживают мейотические фенотипы, сравнимые с таковым в ооцитах дикого типа. Следовательно, мы можем предположить, что в дополнение к своей роли TAF4b участия в обеспечении прохождения профазы I, он также необходим для др. независимых и важных мейотических событий, включая гомологичную рекомбинацию
Интересно, что пониженная экспрессия РНК-связывающего белка DAZL может играть ключевую роль во многих фенотипических отклонениях яичников, обнаруживаемых у Taf4b-дефицитных мышей. Во-первых, DAZL, как было установлено, связывает 3' UTR транскриптов Sycp3, стабилизируя мРНК и делая возможной соотв. трансляцию и функцию [43]. Более того, Dazl-дефицитные мыши также фенокопируют Taf4b-дефицитных мышей с ускоренной потерей зародышевых клеток после рождения. Было также показано, что Dazl-дефицитные мыши неспособны соотв. образом экспрессировать Figlγ и Nobox [35], подтверждая, что помимо непосредственной оккупации промоторов Figlγ и Nobox, TAF4b может также способствовать их экспрессии и что Sycp3 осуществляет непосредственную регуляцию Dazl. Наконец, Dazl, как было установлено, участвует в регуляции Stra8 , а также его нижестоящих мишеней, приводя к соответствующей мейотической прогрессии [44]. Следовательно, TAF4b-зависимая регуляция Dazl может помочь увеличить специфичную для ооцитов регуляторную сеть генов, важных для соотв. событий мейоза I.
Наша работа в соответствии предыдущими исследованиями подтверждает, что точность воспроизведения мейоза важна для перинатальной жизнеспособности ооцитов. Напр., др. модели нарушений мейоза, включая Spo11-дефицитных мышей [45,46] и Msh4-дефицитных мышей [47], демонстрируют ускоренную позднюю эмбриональную или раннюю постнатальную потерю ооцитов. В самом деле, у Taf4b-дефицитных мышей мы также наблюдали быстрое уменьшение плотности ооцитов сразу после рождения.
Мы предложили модель (Fig 8) функции TAF4b, в которой TAF4b оккупирует проксимальные части промоторов в ряде важных для митоза и оогенеза регулирующих генов, включая Stra8, Figlγ, Nobox и Dazl, это выделяет TAF4b как новый вышестоящий "регулятор мейотических регуляторов". Собственно, экспрессия этих белков может затем приводить к настоящей активации нижестоящих генов мейоза и оогенеза, включая Sycp1/2/3, Msy2 и Figlγ и Nobox гены мишени. В конечном итоге мы полагаем, что TAF4b необходим для сети регуляторных генов, важных для успешного течения профазы I и для становления резерва из здоровых примордиальных фолликулов.
Fig 8. Model of TAF4b promoting a critical meiosis and oogenesis gene regulatory network: Data from chromatin immunoprecipitation experiments demonstrates that TAF4b occupies the proximal promoters of Dazl, Stra8, Figl?, and Nobox, ultimately resulting in their expression.
Proper expression of these essential regulators facilitates expression of downstream meiosis and oogenesis genes, finally leading to the development of a healthy primordial follicle pool. Red arrows represent direct transcriptional regulation, gray arrows represent post-transcriptional regulation, and dashed lines indicate putative mechanisms.
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pgen.1006128.g008
В подтверждение наших находок недавняя работа Cloutier et al 2015 продемонстрировала роль для собственно течения мейоза и synapsis в жизнеспособности перинатальных ооцитов, при этом asynapsis независимо от особенностей хромосом приводил к потере ооцитов в диплонеме [48], как это наблюдалось и в Taf4b-дефицитных ооцитах, при этом снижалась экспрессия важных для оогенеза генов, расположенных на хромосомах, не вступивших в синапсис, из-за персистенции γH2AX в пахитене, как это наблюдается в Taf4b-дефицитных ооцитах. Т.к. мы продемонстрировали роль TAF4b в соотв. экспрессии ряда мейотических регуляторов, включая гены синаптонемального комплекса, то наши данные подтверждают, что снижение экспрессии этих факторов приводит к неспособности соотв. синапса, γH2AX-зависимому мейотическому молчанию и потере ооцитов в диплотене. Эти данные подчеркивают тонкую настройку транскрипции, которая д. достигаться для нормального оогенеза и фолликулогенеза.
Мы полагаем, что TAF4b регулирует этот процесс с помощью двух независимых механизмов: во-первых, непосредственная оккупация и обеспечение транскрипции генов оогенеза и, во-вторых, выполнение роли в своевременном и здоровом течении профазы I. Удивительно, TAF4B человека может играть аналогичную роль, что и мышиный TAF4b в становлении овариального резерва у женщин, в то время, когда они всё ещё развиваются in utero. Поскольку мы продемонстрировали скоординированную регуляцию человеческого TAF4B и экспрессию человеческих SYCP3, YBX2, и DAZL (вместе с др. многими генами мейоза, большинство из которых иные мейотические гены), TAF4B может обладать консервативной функцией в регуляции течения мейоза у мышей и женщин.
