Использовали транскриптомику одиночных клеток, чтобы исследовать диверсификацию мезодермального клона в направлении гематопоэтической системы на 1205 клетках от ст. ранней гаструляции Е6.5 до генерации примитивных эритроцитов Е7.75. Данные были высокого качества. Транскриптомы 500 одиночных клеток были получены из дистальных половин эмбрионов Е6.5, которые содержали все клетки эпибласта, включая дающие первичную полоску, ограниченное количество висцеральной энтодермы и внеэмбриональных эктодермальных клеток. Со ст. 7.0 у эмбрионов определяли стадию по анатомическим признакам, таким как первичная бороздка. нервная пластинка и головная складка. VEGF рецептор Flk1 (Kdr) был использован для отлавливания клеток, т.к. это метка большей части развивающейся мезодермы. Во время последующего развития крови Flk1 подавлялся, а CD1 (Itga2b) активировался. Нам удалось также выделить клетки, экспрессирующие оба маркера и только CD41 на ст. нервной пластинки и головной складки, получено всего 138 клеток на ст. Е7.0 (примитивная полоска, 259 на ст. Е7.5 (нервная пластинка) и 307 клеток на ст. Е7.75 (головная складка).

После тщательного качественного контроля было идентифицировано 2085 генов с гетерогенной экспрессией среди 10205 клеток. Не подчиняемое контролю иерархическое образование кластеров в связи с динамикой разрезов давало 10 мощных кластеров с разными вкладами на разных ст. эмбриогенеза. Используя подход t-SNE наблюдали только три главные группы: одна представляла почти все Е6.5 клетки, другая в основном состояла из клеток ранней первичной полоски и клеток стдаии нервной пластинки и треться преимущественно содержала клетки более поздней ст. головной складки. Кластеры были находились в сцеплении при t-SNE визуализации за исключением небольшого кластера 5.

Экспрессия ключевых маркерных генов позволила нам оценить качественные особенности каждого кластера: висцеральной энтодермы, внеэмбриональной эктодермы, эпибласта, ранних мезодермальных предшественников, задней мезодермы, эндотелия, предшественнриков крови, примитивных эритроцитов, аллантоисной мезодермы и фарингеальной мезодермы. Из-за ограниченного количества клеток и отсутствия маркеров для их проспективной изоляции, обычный анализ транскрипции этих ключевых популяций прежде никогда не применялся.

Поскольку Т-бокс транскрипционный фактор brachyury - кодируемый Т геном - метит возникающую первичную полоску, мы исследовали программы экспрессии генов, ассоцированные с Т индукцией в Е6.5 клетках (*кластер 3). Экспрессия Т ограничена определенным субнабором клеток эпибласта, обнаруживаемых вблизи кластера 4, при этом обнаруж иваются редкие изолированные клетки в массе популяции эпибласта, также экспрессирующиющие умеренные уровни, это согласуется с начальными событиями для одиночных генов, ассоциированных с гаструляцией. Экспрессия Т коррелирует с др. генами, ассоциироваными с гаструляцией, включая Mixl1 и Mesp1? при этом Mesp1 экспрессируюется на высоком уровне только в небольшом кластере клеток, расположенных на полюсе Е6.5 кластера эпибласта. Мы также наблюдали субнабор клеток, отличающихся от T+/Mesp1+ популяции, который экспрессировал Foxa2, предположительно детерминация энтодермы.

Мы затем идентифицировали гены, обнаруживающие скоррелированную экспрессию с Т, которые выявляют известные маркеры и регуляторы, такие как Mixl1 и гены, ранее не обнаруживаемые при гаструляции млекопитающих, такие как Slc35d3, орфановый член семейства транспортеров нуклеотидов сахаров и ретротранспозон, происходящий из транскрипта Cxx1c⁹. Гены, негативно скоррелировнные с Т, постоянно экспрессируются в большинстве клеток эпибласта, указывая, что клетки вне первичной полоски еще не детерминированы к определенным судьбам, что согласуется с с известной пластичностью клеток эпибласта в экспериментах по трансплантации. Проникающие клетки эпибласта подвергаются ЕМТ, переходя от псевдо-стратифицированных эпителиальных клеток в индивидуальные подвижные клетки, конформационные изменения связаны с альтерациями в размере и форме клеток. Нашти Е6.5 клетки эпибласта были изолированы с использованием индекса сортировки, предоставляя разбросанные значения для каждой клетки. Как показано на Рис. 2с, Т⁺ Mesp1⁺ клетки обнаруживают существенное снижение значения разброса для каждой из клеток по сравнению с Т⁺ Mesp1^- и Т ^- клетками/ Поскольку разброс коррелиру4ет позитивно с размером клеток, то это наблюдение указывает на прямую связь между специфическим программами транскрипциии характерными физическими изменениями, ассоциированными с гаструляцией. Поскольку клетки Т⁺ Mesp1⁺ экспрессируют также Mesp2, то это наблюдение согласуется с известным дефектом ЕМТ у дважы нокаутных Mesp1/Mesp2 эмбрионов. Показатеь сортинга, следовательно, связываетизменения экспрессии с динамическими физическими изменениями, подобными тем, что распознаются при гаструляции у эмбрионов кур.

Затем внимание было уделено клональной дивергенции непосредственно после гаструляции. Мы использовали карты диффузии, особенно технику понижения размерности (dimensionality reduction), подходящую для реконструирования онтогенетических траекторий. Мы идентифицировали направления диффузии в пространстве, которые, скорее всего, отражают настоящие биологические эффекты, которые мы интерпретировали как координаты псевдо-пространства. Образования иерархических клестеров выявило три группы генов, обнаруживающих градиент экспрессиивдоль осей псевдо-пространства. Они были обозначены как передние (334) и задние (87) гены, благодаря концентрации генов с известной дифференциальной экспрессией вдоль передне-задней оси первичной полоски. Третий кластер экспрессировался на высоком уровне или на конце оси псевдо-пространства (41 ген). Интересно, что более задние Flk+ мезодермальные клетки были ассоциированы с аллантоисом, кровяным и эндотелиальным кластерами, которые, как известно, возникают из задней части первичной полоски. Анализ онтологии генов показал, что предполагаемые передние гены были ассоциированы со сроками, связанными с развитием сомитов, развитием энтодермы и передачей сигналов Notch, что согласуется с с более передними качественными характеристиками мезодермы. Напротив, предполагаемый задний мезодермальный кластер был ассоциирован с передачей сигналов DVH? развитием задних конечностей и дифференцировкой эндотелиальных клеток, что соответствует задней порции первичной полоски.

Хотя происходят из одной и той же эмбриональной стадии мезодермальные клетки предшественники, но кластер 7 лишен экспрессии генов, таких как Mesp1, но экспрессирует Tal1, Sox7, Tek( Tie2) и Flt1, которые жизненно необходимы для образования внеэмбриональной мезодермы. Экспрессия Kdr и Itga2b еще больше подчеркивает кластеры 7 и 8 соответствуют онтогенетическому переходу в направлении крови, при этом переход происходит в основном на ст. головной складки в кластере 8 и увеличивается экспрессия эмбрионального гемоглобина Hbb-bh1. Принимая во внимание очевидную траекторию развития крови из кластеров 7 и 8, мы использовали аналогичный подход, описанный выше, для определения псевдо-временного упорядочивания клеток. *03 генаподавлялись, включая гемато-сосудистый транскрипционный фактор Sox7, который, как известно, подавляется во времядетерминации крови. 67 генов активировалис, включая специфичные для эритроцитов транскрипционные факторы Gata1 и Nfe2 и эмбриональный глобин Hbb-bh1. 27 генов временно экспрессируются, включая известный эритроидный регулятор Gfi1b . Достоверныые GO термины, ассоциированные с активацией генов, были показательными для эритроидного развития, тогда как подавляемые геныоказались ассоциированы с др. мезодермальными процессами, включая васкулогенез и дифференцировку остеобластов.

Gata1-нулевые эмбрионы погибают приблизительно на ст. Е10.5 из-за арестаэритропоэза в желточном мешке. Мы осуществили геномное ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation followed by sequencing) плучение данных для Gata1 в гематопоэтических клетках, происходящих спустя 5 дней дифференцировки эмбриональных стволовых клеток in vitro . Группа активируемых генов в результате псевдо-временного анализа обнаружила выраженное перекрывание с Gata1 мишенями, включая известные мишени, такие как Nfe2 и Zfpm1. Интеграция данных транскриптомов одиночных клеток с комплементарным транскрипционным фактором связывания, скорее всего, предсказывает in vivo мишени онтогенетических регуляторов, таких как Gata1.

Два контрастных механизма обычно привлекают, чтобы объясни, как драйвервы детерминации клеточных судеб регулируют диверсификацию типов клеток. Первый использует ограничение судеб посрендством ступенчатооразной последовательности бинарного выбора судеб и это подтверждается механистическими исследованиями с использованием ESC дифференцировки.Альтернативный механизм использует приобретение разных судеб из независимых клеток предшественников и обычно подтверждается клеточными трансплантациями и анализом отслеживаемых клонов. В противоположность ретроспективной природе трансплантаций и экспериментам по отслеживанию клонов, где измерения обычно производятся спустя день или более после выбора клеточной судьбы, транскриптомика одиночных клетое позволяет определять клеточные состояния в момент, когда ожидается выбор судьбы, поскольку низкие количества клеток не являются ограничивающим фактором.

иРДР транскрипционный фактор Tal1 (также известен как Scl)df;ty для развития всез клеток крови, при этом наблюдается строгая экспрессияв производных заждней мезодермы. Tal-/- бипотентные предшественники кровь/эндотелий не могут прогрессировать в гемогенное эндотелиальное состояние. Избыточная экспрессия Tal1 вызывает трансдифференцировку фибробластов в предшественники крови, а Tal-/- мезодермальные предшественники из желточного мешка дают аберрантные предшественники кардиомиоцитов при культивировании in vitro . Однако, точная природа молекулярного дефекта в мезодермальных предшественниках Tal-/- у эмбрионов остается неизвестной, поскольку количество клеток слишком мало для обычного анализа.

Мы получали профили Адл1+ клеток от 4-х клеток дикого типа и 4-х Tal-/- эмбрионов, полученных на ст. от Е7.5 (нервная пластинка) до ст. Е8.25 (ст. 4-х сомитов) (256 клеток дикого типа и 121 клетка Tal-/- и с помощью компьютера относили клетки к ранее определенным 10 клоастерам.Клети оти эмбрионов дикого типа вносили вклад во все кластеры, тогда как 'b,hbjys Tal-/- не содержали каких-либо клеток, соответствующих предшественникам крови и примитивным эритроидным кластерам, что согласуется с известной неспособностью к примитивному эритропоэзу у эмбрионов Tal-/- и отсутствию у них экспрессии CD41.

45 Tal-/- клеток были тщательно картированы в эндотелиальном кластере, это позволило нам исследовать ранние последствия делеции Tal в этой ключевой популяции для дефинитивного гематопоэтического развития. 50 генов было подавлено ы Tal-/- эндотелиальных клетках. Сюда входили известнве регуляторы раннего развития крови (Itga2b, Lyl1, Cbfa2t3,Hhex, Fli1, Dgdl7, Sox7, Hoxb5), необходимые вместе с Tal для спецификации гематопоэтической судьбыв эмбриональных эндотелиальных клетках предшественниках и в особенности Hoxb5, который недавно возник как мощный маркер для дефинитивных кровяных стволовых клеток. Профилирование одиночных клеток также выявло гены с измененным распределением экспрессии. Напр.,Sox7 изменяется в основном с одномодального паттерна в клетках дикого типа на бимодальный вкл/выкл праттерн в Tal-/- эндотелиальных клетках, тогда как Cbfa2t3 обнаруживает противопложный паттерн.

Однако, мы не наблюдали активации кардиальных маркеров в Tal-/- эндотелиальных клетках. Ранее активация наблюдалась в эндотелиальных клетках желточного мешка, полученных 1-1,5 дня позднее по сравнению с нашими данными и послужила доказательством, что Tal1 действуцет как привратник, контролирующийбаланс между кардиально и кровь/эндотелий судьбами в одиночных мультипотентнрых мезодермальных предшественниках.Наши результаты, однако, указывают на то, что первичная роль Tal1 заключается в индукции кровянной программы, а последующая эктопическая экспрессия кардиальных генов может быть результатом втор ичной индукции событий, действующих на всё ещё относительнро пластичные мезодермальные клетки, блокированные к выполнению обычной пррограммы развития.

Здесь мы использовали транскриптомику одиночных клеток, чтобы получитьпредставление о программах транскрипции, ассоциированных с гаструляцией у млекопитающих и девесификацией ранних мезодермальнрых клонов.Дальнейшие технологические успехи разрешат эпигенетические процессы в одиночных клетках и позволят сравнить профили экспрессии одиночных клеток с пространственным расположением.Наш анализ Tal-/- эмбрионов иллюстрирует, как фенотипы ключевых регуляторов могут быть переоценены при разрешении в одиночную клетку.