Посещений:
МикроРНК-142



Регулятор органогенеза, гомеостаза и болезней

MicroRNA-142 is a multifaceted regulator in organogenesis, homeostasis, and disease
Amit Shrestha, Regina T. Mukhametshina, Sara Taghizadeh, et al.
Developmental Dynamics 246:285–290, 2017.

Over the past decade, microRNA-142 (miR-142) is emerging as a major regulator of cell fate decision in the hematopoietic system. However, miR-142 is expressed in many other tissues, and recent evidence suggests that it may play a more pleiotropic role during embryonic development. In addition, miR-142 has been shown to play important functions in disease. miR-142 displays a functional role in cancer, virus infection, inflammation, and immune tolerance. Both a guide strand (miR-142-3p) and passenger strand (miR-142-5p) are generated from the miR-142 hairpin. miR-142-3p and -5p display overlapping but also independent target genes. Loss of function mouse models (genetrap, global knock out [KO], and conditional KO) have been reported and support the important role of miR-142 in different biological processes. This review will summarize the abundant literature already available for miR-142 and will lay the foundation for future works on this important microRNA


Рисунки к статье

МикроРНК (miRs) это длиной в 22- 25 нуклеотида однонитчатая РНК, возникающая из транскрипта в виде шпильки. Созревание шпилечного транскрипта дает 3p ведущую нить и 5p сестринскую пассажирскую нить, обе они делают возможным замалчивание специфических наборов генов путем спаривания оснований с минимальной распознающей последовательностью (Ambros and Lee, 2004). miRs генерируются из более длинных транскриптов РНК путем нескольких ступеней преобразований после транскрипции, чтобы давать короткую двуниьтчатую miRs (Obernosterer et al., 2006). Одиночная miR теоретически может воздействовать на многие сотни генов. В свою очередь одиночный транскрипт мРНК может подвергаться действию множественных miRs. Считается, что более 60% белок-кодирующих генов человека может находиться под контролем miRs (Friedman et al., 2009).
Две важных работы описали существование miRs у Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, и у человека (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001). С этих miRs первоначально идентифицированных у позвоночных, было описано более 2000 miRs, и была установлена их важность для болезней человека. Как следствие, исследования стали концентрироваться на важных для диагностики и терапии miRs.
Вплоть до недавнего времени выяснялась роль miRs в органах взрослых, а также в специфических клеточных компартментах у мышиных моделей. Поэтому сравнительно мало данных о роли miRs во время эмбрионального развития. Однако, считается, что время этих самых ранних ст. развития принимается значительное количество решений , таких как клеточное обновление, временная амплификация, дифференцировка, жизнеспособность и миграция. Аномальное развитие, обусловленное нарушениями экспрессии miRs м. приводить к длительным последствиям во взрослой жизни.
miR-142 обнаружена в качестве критического регулятора многих биологических процессов и ассоциирована с сигнальными путями во время эмбрионального развития, гомеостазом и болезнями. Шпилька miR-142 дает "ведущую нить" miR-142-3p и сестринскую "пассажирскуюr" нить miR-142-5p (see Fig. 1). Figure 1. miR-142 stem loop gives rise to both miR-142-5p and miR-142-3p.

Описаны разные функции для miR-142. На рис. 2 показаны некоторые пути, потенциально затрагиваемые miR-142-3p и miR-142-5p. Эти пути были идентифицированы путем использования Diana-MicroT и TargetScan, двух наиболее популярных и широко распространенных инструментов in-silico. Нельзя исключить существование дополнительных мишеней, не выявленных с помощью этих инструментов.

Figure 2. Pathway intersection between miR-142-3p and -5p. The predicted targets for miR-142-3pand -5p, characterized using Diana-MicroT and Targetscan, are used as a base to propose the potential pathways and processes controlled by miR-142. Among the processes and pathways potentially affected, we identified endocytosis, regulation of actin cytoskeleton, pathways in cancer, TGFβ signaling, and WNT signaling (adapted from Shrestha et al., 2015).

Role of miR-142 in Stem Cells


Принятие решения о самообновлении или дифференцировке стволовыми клетками тонко регулируется. Доказательства показывают, что miRs играют ключевую роль в гомеостазе стволовых клеток. Сообщалось, что miR-142 по-разному экспрессируется в эмбриональных стволовых клетка мышей (mESCs). Авт. сообщили о генерации репортерной кассеты, сосоящей из двунаправленного промотора, управляющего экспрессией normalizer (H2B-mCherry) и детектором активности miR (H2B-Citrine), последний содержит последовательность мишень для miR-142 на своем 3'-не транслируемом регионе. Этот двунаправленный репортер производит расположение back-to-back CAG промоторов с 4 энхансерами cytomegalovirus, делающими возможной эффективную экспрессию в mESCs, подвергшимися дифференцировке и с наилучшим соотношением между сигналом и шумом при измерении активности miR в одиночных клетках.
Точные измерения H2B-Citrine по сравнению с H2B-mCherry флюоресценцией отражает активность miR-142. Используя эту репортерную кассету, авт. подтвердили, что miR-142-3p экспрессируется на высоком уровне в недифференцированных клетках и подавляется в дифференцированных клетках. Кроме того, они также продемонстрировали существование популяций с высоким miR-142 и с низким уровнем содержания miR-142 в недифференцированных ES клеточных органоидах. Делеция miR-142 в эмбриональных стволовых клетках приводит к дифференцировке этих клеток с выбором нейро-эктодермальной, мезодермальной и энтодермальной судьбы при полном отсутствии экспрессии Oct4, который маркером плюрипотентности.
Напротив избыточная экспрессия miR-142 предупреждает дифференцировку ES клеток и поддерживает экспрессию Oct4. Двойная негативная петля обратной связи между уровнями KRas/ERK и miR-142 считается механизмом действия (see Fig. 3A). Низкий уровень miR-142 индуцирует фосфорилирование KRas и Erk, инициируя тем самым дифференцировку и наоборот (Sladitschek and Neveu, 2015). Эта находка подтверждает новый механизм, с помощью которого miR-142 может играть важную роль в поддержании плюрипотентности стволовых клеток во время органогенеза.

Figure 3. A,B: Conserved mechanism of action of miR-142 in regulating the level of phosphorylation of ERK.



Role of miR-142 in Cardiomyocyte Hypertrophy


Постнатальная адаптивная гипертрофия кардиомиоцитов является нормальным механизмом, делающим возможным увеличение размера сердца без привлечения клеточной пролиферации. Однако, при болезни таких как гипертензия и стеноз аортальных клапанов происходит увеличение нагрузки на сердце, и неадекватная гипертрофия кардиомиоцитов. Продолжительная, неадекватная гипертрофия, скорее всего, приводит к сердечной недостаточности. Молекулярные механизмы, контролирующие адаптивный и неадекватный кардиальный рост, являются, скорее всего, критическими с терапевтической точки зрения. Интересно, что обратное взаимоотношение наблюдается между уровнями miR-142 и кардиальной гипертрофией. miR-142-5p и -3p обнаруживают снижение уровней во время кардиальной гипертрофии, с помощью механизмов, нуждающихся в транскрипционном факторе p300, участвующим в кардиальном росте и активности MAP киназы. p300 является непосредственной мишенью miR-142 (Sharma et al., 2012).
Интересно, что рецепторная tyrosine kinase/ERK стоят иерархически выше активации p300 и являются, следовательно, ингибирующими экспрессию miR-142 (see Fig. 3B). Уровни p300 резко увеличиваются во время гемодинамических стрессов, сердечной недостаточности и гипертрофии сердца. Однако, небольшое увеличение или уменьшение в уровне p300 может сильно повлиять на степень адаптивной гипертрофии сердца и сердечную недостаточность (Morimoto et al., 2008; Wei et al., 2008). Кроме того, miR-142 может подавлять цитокиновый сигнальный механизм путем целенаправленного воздействия на цитокиновый рецептор gp130, критический рецептор, необходимый для жизнеспособности кардиальных мышц. Подавление miR-142 у мышей приводит к увеличению p300 и gp130 , увеличивая в конечном итоге величину цитокинами обеспечиваемых сигналов, снижая апоптоз и сердечную недостаточность во время постнатального роста сердца, подтверждая, что miR-142 является важной для успешной адаптации и жизнеспособности сердца, обусловленными изменениями гемодинамических потребностей in vivo (Sharma et al., 2012).

Role of miR-142 During Hematopoiesis


Гематопоэтические стволовые клетки образуются рано во время эмбрионального развития. Они дают мультипотентные стволовые клетки, которые могут затем дифференцироваться в лимфоидные и миелоидные предшественники. Лимфоидные предшественники дают T и B лимфоциты, а также клетки натуральных киллеров, тогда как миелоидные предшественники дифференцируются в эритроциты, тромбоциты, моноциты/макрофаги, эозинофилы и нейтрофилы. miR-142 была впервые идентифицирована в гематопоэтических стволовых клетках (Chen et al., 2004). miR-142 , в сомом деле, является критической для формирования и дифференцировки клонов гематопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников (Nishiyama et al., 2012; Lu et al., 2013).
Самым ранним известным регулятором гемато-эндотелиального клона, как было установлено, является miR-142-3p, который действует выше гематопоэтических транскрипционных факторов Fli, Gata2, Etvs и Scl. miR-142-3p, в свою очередь, является важным для спецификации гемангиобластных предшественников из клона гематопоэтических стволовых клеток, подтверждая, что miRs могут служить инструктивными детерминантами выбора клеточных судеб во время развития (Nimmo et al., 2013).
Используя в целом miR-142 KO мышей, Krammer с колл. продемонстрировали, что потеря miR-142 не только приводит к образованию аномальных гематопоэтических клонов, но и также к серьезному иммуннодефициту. miR-142 нулевые мыши обладают гипоглобулинемией и очень низким иммунным ответом в отношении растворимых антигенов и вирусов (Kramer et al., 2015). Более того, независимое исследование с использованием генных ловушек, базирующихся на miR-142 нулевых мышах, также показало нарушение созревания мегакариоцитов, коррелирующее с аномальным образованием тромбоцитов и тромбоцитопенией (Chapnik et al., 2014). Мы описали сходный тип аномалий на наших классических miR-142 KO мышах (Shrestha et al., 2015). Итак, эти находки подтверждают, что miR-142 является основным регулятором гематопоэза.

Role of miR-142 During Lung Development


Специфические miRs участвуют в развитии и болезнях легких (Nardiello and Morty, 2016). Наша группа установили, что miR-142-3p является одной из miRs, которая экспрессируется на высоким уровне, в мезенхиме легких во время развития. Нокдаун этой miR in vitro с использованием подхода, базирующегося на morpholino, привел к снижению пролиферации мезенхимных клеток и преждевременной дифференцировке клеток предшественников гладких мышц (Carraro et al., 2014). Механистически было показано, что miR-142-3p позитивно регулирует передачу сигналов WNT/CTNNB1 (β-catenin) путем целенаправленного воздействия на adenomatous polyposis coli (APC), негативный регулятор передачи сигналов WNT signalin (Carraro et al., 2014; Isobe et al., 2014). Потеря передачи сигналов WNTв эмбриональной мезенхиме легких в ответ на замалчивание miR142-3p может быть устранена посредством эктопической экспрессии стабильной формы CTNNB1 или делеции Apc в мезенхиме (Carraro et al., 2014).
Интересно, что двойная негативная петля обратной связи описывается между miR-142-5p и p300 в контексте сердечных болезней. При механических стрессах p300 накапливается в кардиомиоцитах, приводя к подавлению miR-142-5p, вызывая гипертрофию кардиомиоцитов (Sharma et al., 2012). p300 является позитивным регулятором передачи сигналов WNT/CTNNB1 (Sun et al., 2011). У miR-142 KO, и miR-142-3p, и miR-142-5p делетированы; мы установили, что APC и p300 усиливают свою активность. При делеции miR-142, мы ожидали, что баланс между APC и p300 будет приводить к отсутствию изменений или к повышению, или снижению передачи сигналов WNT. Однако, наше исследование показало, что на ст. E18.5 обнаруживается усиление передачи сигналов WNT (Shrestha et al., 2015). На рис. 4 представлена наша рабочая модель относительно роли двух miR-142 изоформ во время развития легких.

Figure 4. Regulation of WNT signaling by miR-142. miR-142-3p activates WNT signaling by targeting Apc, whereas miR-142-5p represses WNT signaling by means of targeting p300 (adapted from Shresta et al., 2015).



miR-142 as a Biomarker for the Diseased State


miRs появились в качестве биомаркеров различных болезней, таких как рак и сердечные аномалии. Кроме того, miRs могут представлять собой потенциальную специфическую терапевтическую мишень в моделях болезней (Schulte and Zeller, 2015). Циркулирующая в сыворотке или плазме miR-142-3p была обнаружена ассоциированной с высоким риском возвращения рака у пациентов с ранней стадией легочной аденокарциномы (Kaduthanam et al., 2013). Др. исследование показало, что miR-142-3p участвует в прогрессировании esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), и установлено, что эта miR является потенциальным прогностическим биомаркером для ESCC (Lin et al., 2012). Между тем, miR-142-5p вместе с miR-486-5p , как было установлено, являются потенциальными биомаркерами для ранней детекции хронического, обусловленного антителами отторжения почечного трансплантата (Iwasaki et al., 2016). Более того, уровни miR-142-3p и -5p достоверно снижаются при острой и хронической сердечной недостаточности, соотв., указывая что эти две miRs могут действовать как специфические биомаркеры сердечной недостаточности (Vegter et al., 2016).

miR-142 and Immune Tolerance


Аутоиммунные заболевания иммунной системы, когда собственная иммунная реакция тела целенаправленно воздействует на здоровые клетки, вызывая их деструкцию из-за снижения иммунологической толерантности к ауто-реактивных иммунным клеткам. Недавнее исследование показало, что аберрантная экспрессия miR часто коррелирует с началом и прогнозом аутоиммунных заболеваний. Это наблюдение указывает на то, что нарушение регуляции экспрессии miR оказывать серьезный эффект на иммунный ответ и иммунную толерантность (Chen et al., 2013).
Разработка безлекарственной терапии иммунной толерантности или успешное использование очень низких количеств иммуно-супрессивных лекарств может оказать существенное влияние на область трансплантации органов у людей. Высокий уровень miR-142-3p наблюдался в одноядерных клетках периферической крови иммунно-толерантных пациентов, которые подверглись трансплантации почки. Дальнейшие исследования подтвердили, что негативная петля обратной связи с участием TGFβ1 и miR-142-3p в одноядерных клетках периферической крови может быть ответственна за вклад в иммунную толерантность (Danger et al., 2012).
Кроме того, мыши, леченые miR-142-регулируемым лентивирусным вектором, кодирующим green fluorescent protein (GFP) и затем вакцинированные с помощью GFP являются толерантными к развитию антител против GFP и обнаруживают повышенные количества GFP-специфичных регуляторных T клеток. У контрольных животных с неродственной miR-122a, обнаруживают мощную иммунную реакцию на GFP после вакцинации. Поэтому было предположено, что miR-142 может быть использована для индукции иммунологичной толерантности к кодируемым геном антигену и может быть использована в качестве инструмента для генотерапии у пациентов с аутоиммунными нарушениями и у пациентов, нуждающихся в трансплантации органов (Annoni et al., 2009).

miR-142 in Cancer


Исследования раковых опухолей подтвердили, что miRs являются подходящими биомаркерами развития рака и опухолевых стадий. Недавние доказательства показали, что мутации или эктопическая экспрессия miR коррелируют с различными раками у человека, указывая, что miRs могут функционировать в качестве опухолевых супрессоров и/или онкогенов, в зависимости от клеточной функции их мишеней (Calin and Croce, 2006). Уровень экспрессии miR-142-3p в эпителиальных клетках рака шейки матки достоверно ниже, чем в здоровых эпителиальных клетках шейки матки указывая на регуляторное влияние miR-142-3p в раке шейки матки. miR-142-3p подавляет пролиферацию и инвазию клеток посредством целенаправленного воздействия Frizzled 7 (Fzd7) рецептора в Hela и SiHa клетках. Избыточная экспрессия Fzd7 способна устранить эффект, вызываемый miR-142-3p. miR-142-3p является поэтому потенциальной терапевтической мишенью при раке шейки матки (Deng et al., 2015). Сходным образом, miR-142-3p участвует в ингибировании прогрессирования опухоли и инвазии в клетках гепатоклеточной карциномы (Wu et al., 2011; Tsang et al., 2015). Более того, при acute myeloid leukemia (AML) miR-142-3p, как было установлено, подавляется. Усиление экспрессии miR-142-3p путем обеспечения миелоидной дифференцировки может поэтому служить потенциальной стратегией лечения AML (Wang et al., 2012).
Парадоксально, но высокие уровни экспрессии miR-142-5p коррелируют с прогрессированием рака путем регуляции передачи сигналов TGFβ. В частности, miR-142-5p целенаправлено воздействует на Smad3, супрессируя тем самым индуцированное TGFβ подавление роста в раковых клетках. Избыточная экспрессия miR-142-5p приводит к усилению пролиферации опухолевых клеток и снижению апоптоза, тогда как замалчивание miR-142-5p приводит к противоположным эффектам (Ma et al., 2016). Сходным образом, miR-142-3p может репрессировать TGFβ-индуцированное подавление роста путем целенаправленного воздействия на Tgfβr1 рецептор в линии клеток ек мелкоклеточной карциномы легких (Lei et al., 2014).
Исследование Isobe and colleagues продемонстрировало, что miR-142-3p хапускает прогрессирование опухолей в стволовых клетках груди человека путем целенаправленного воздействия APC. Потеря экспрессии APC активирует канонический путь передачи сигналов WNT/CTNNB1, приводя к избыточному клеточному росту в ткани груди (Isobe et al., 2014). Дальнейшие исследования туморогенеза глиобластом показали, что interleukin-6 ингибирует экспрессию miR-142-3 посредством повышения метилирования промотора miR-142-3p. Кроме того, High mobility group AT-hook2 (HMGA2), мишень для miR-142-3p, усиливает свою активность, приводя к увеличению экспрессии SOX2, транскрипционного фактора, необходимого для поддержания признаков, характерных для стволовых клеток, в клетках глиобластомы и ассоциирует со злокачественностью глиобластомы (Chiou et al., 2013).

Conclusion


miR-142 is emerging as one of the most critical miRs during development, homeostasis, and disease (see Table 1). The strong phenotype exhibited upon loss of function approaches is very robust and apparently not redundant with other miRs, a quite surprising observation given the fact that a single miR can target many genes (sometimes few hundred transcriptional targets) and that a given gene can be targeted by multiple miRs. What is also emerging is that each isoform (miR-142-3p vs. -5p) can have overlapping as well as specific transcriptional targets, and in some cases can have opposite effects on specific pathways. For example, miR-142-3p activates WNT signaling by targeting Apc, whereas miR-142-5p represses WNT signaling by means of targeting p300. The combined inactivation of the two isoforms (such as in the classical KO) does not lead to a neutral effect on WNT signaling but rather to increased WNT signaling (Shrestha et al., 2015). What is controlling the expression of each isoform is still unknown. It will be important to further investigate the activity of the two isoforms, for example using a dual fluorochrome reporter cassette (Sladitschek and Neveu, 2015).

Table 1. Summary of the Involvement of miR142-3p and/or 5p in Development and Disease 
                                            miR-142                             Reference
Development
Hematopoiesis        miR-142-3p/5p        Chen et al., 2004

Megakaryopoiesis        miR-142-3p/5p        Chapniket al., 2014

Embryonic lung mesenchyme        miR-142-3p        Carraro et al., 2014

Disease
Glioblastoma        miR-142-3p (down)        Chiouetal., 2013

Lung adenocarcinoma        miR-142-3p (up)        Kaduthanam et al., 2013

Cardiovascular disease        miR-142-3p/5p (down)        Sharma et al., 2012

Hepatocellular carcinoma        miR-142-3p/5p (down)        Tsang et al., 2015

Breast cancer        miR-142-3p/5p (up)        Isobe et al., 2014


Monitoring miR-142 activity, especially in stem cell compartments in different organs may be very informative about the differentiation capabilities of these cells. A decreased level of miR-142 leads to increased ERK phosphorylation, which is causative for the differentiation of mESCs. Therefore, reduced levels of miR-142 could correlate with enhanced differentiation and the associated depletion of the stem cell pool.
Supporting this possibility, in the satellite cells, the stem cells of the muscles, activation of fibroblast growth factor (FGF) signaling, a well-known upstream activator of ERK phosphorylation, leads to the loss of quiescence of the satellite cells, and to their depletion associated with diminished regenerative capacities. Blocking FGF receptor 1 signaling or overexpression of Sprouty1 (a negative regulator of FGF signaling) prevents the depletion of the satellite cells (Chakkalakal et al., 2012). Additionally, recombinant FGF10 has also been reported to reduce the expression of stemness genes such as Oct3/4, Sox2, and compromise the self-renewal capacity of lung cancer stem cells, rendering them more sensitive to chemotherapy (Kanehira et al., 2014). Exploring the relationship between FGFs and miR-142 will allow a better understanding on how the cells respond to differentiation and proliferation signals.
Another important aspect linked to the miR field is the use of conditional KO instead of the classical KO, especially when the classical KO already exhibits a strong phenotype such as in the miR-142 KO. It will be challenging with the existing technology to tease apart the role of each isoform (3p vs. 5p) individually in specific cell types. The potential therapeutic applications linked to miR-142 are numerous, from prevention of organ rejection by modulating immune tolerance, to cancer therapy, and regeneration by modulating the stem cell pool. Developing animal models to manipulate positively or negatively miR-142 expression in vivo will, therefore, be crucial to establish the safety of these approaches before the start of clinical trials in humans.