Посещений:
Роль миРНК



Развитие и спецификация нейронов

The role of microRNAs in human neural stem cells, neuronal differentiation and subtype specification
• Laura Stappert, • Beate Roese-Koerner, • Oliver Brustle
Cell and Tissue Research January 2015, Volume 359, Issue 1, pp 47–64

The impressive neuronal diversity found within the nervous system emerges from a limited pool of neural progenitor cells that proceed through different gene expression programs to acquire distinct cell fates. Here, we review recent evidence indicating that microRNAs (miRNAs) are critically involved in conferring neural cell identities during neural induction, neuronal differentiation and subtype specification. Several studies have shown that miRNAs act in concert with other gene regulatory factors and genetic switches to regulate the spatial and temporal expression profiles of important cell fate determinants. So far, most studies addressing the role of miRNAs during neurogenesis were conducted using animal models. With the advent of human pluripotent stem cells and the possibility to differentiate these into neural stem cells, we now have the opportunity to study miRNAs in a human context. More insight into the impact of miRNA-based regulation during neural fate choice could in the end be exploited to develop new strategies for the generation of distinct human neuronal cell types.
Первоначально рассматриваемые как "ненужные РНК", не кодирующие РНК сегодня считаются критическими регуляторами клеточного гомеостаза (rev. Esteller 2011). В частности, микроРНК (miRNAs), которые составляют самостоятельный класс малых не кодирующих РНК, оказались важными регуляторами генов после транскрипции. Зрелые miRNAs возникают из первоначально крупных транскриптов, содержащих шпилечные структуры, которые в дальнейшем преобразуются за счет последовательного действия двух ribonuclease (III) энзимов: Drosha и Dicer. Зрелые miRNAs затем включаются в RNA-induced silencing complex (RISC) и служат в качестве проводников к мРНК мишеням для подавления их трансляции или деградации мРНК. Кстати, более 2500 miRNAs было описано в геноме человека (miRBase annotation v20; Kozomara and Griffiths-Jones 2011, 2013) и большая фракция известных miRNAs экспрессируется в головном мозге человека (Shao et al. 2010). Принимая во внимание, что каждая из этих miRNAs, как полагают, распознает несколько сотен мишеней, значительная пропорция транскриптома и, следовательно, многие клеточные процессы могут быть предметом регуляции с помощью miRNA (Lewis et al. 2005; rev. Esteller 2011). Они также участвуют в осуществлении выбора клеточных судеб, при этом miRNAs действуют совместно с др. регуляторами транскрипции (транскрипционные факторы и эпигенетические регуляторы) чтобы создавать сети регуляторных генов (Herranz and Cohen 2010; Pel?ez and Carthew 2012; Arora et al.2013). В этом контексте, miRNAs и транскрипционные факторы могут формировать обратные или прямые петли. Регуляция с помощью обратной связи может быть или негативной (напр., транскрипционный фактор ограничивает свою собственную экспрессию путем индукции экспрессии своего собственного негативного miRNA регулятора) или позитивной (напр., miRNA усиливает свою собственную экспрессию путем воздействия на свой собственный негативный транскрипционный фактор регулятор). Двойные негативные петли обратной связи, с помощью которых miRNA и транскрипционный фактор реципрокно репрессируют др. др., могут функционировать как бистабильные переключатели. Выбор нейрональных подтипов, в частности, часто зависит от пар перекрестно репрессирующих др. др. транскрипционных факторов, которые могут регулироваться с помощью miRNAs (e.g., Chen et al. 2011). Петли со сдвигом вперед более сложны и состоят из двух дорог регуляции напрямую и косвенно, которые могут или действовать в том же самом направлении (coherent) или в противоположном (incoherent). MicroRNAs могут быть также компонентами петель сдвинутых вперед (feed-forward), при этом возможны несколько разных комбинаций (Pel?ez and Carthew2012). С др. стороны, miRNAs могут помочь обеспечить гарантию устойчивости сети регуляторных генов, погашая смущения и снижая шумы. Напр., недавно было показано, что miR-9 снижает влияние геномных вариаций у Drosophila (Cassidy et al.2013). С др. стороны, miRNAs могут также функционировать как критические переключатели, чтобы канализировать экспрессию генов во время выбора клеточной судьбы. Это было прекрасно продемонстрировано с помощью роли miRNAs в становлении асимметрии хемосенсорных нейронов у C. elegans (rev. Alqadah et al. 2013).

MicroRNAs interact with gene regulatory motifs to regulate neural induction and neuronal differentiation


Многие из miRNAs экспрессируются в ЦНС, динамически регулируемые как во время физиологического развития головного мозга, так и во время in vitro дифференцировки стволовых клеток, указывая на существенный вклад в развитие и функционирование нервов (Krichevsky et al.2003, 2006; Sempere et al. 2004; Miska et al. 2004; Smith et al. 2010; Liu et al. 2012). В самом деле, возникает картина, что miRNAs играют критические роли в ходе всего развития нервной системы от нейральной индукции, до экспансии нейрональных предшественников, дифференцировки и спецификации нейрональных подтипов (rev. Sun et al. 2013; Bian et al. 2013). Более того, miRNAs участвуют также в регуляции миграции нейронов (e.g., Gaughwin et al. 2011; Rago et al. 2014)ста нейритов и синаптической пластичности (rev. Siegel et al. 2011; McNeill and Van Vactor 2012). В целом воздействие miRNAs как важных регуляторов дифференцировки и нейрального развития впервые было продемонстрировано с помощью экспериментов по потере функции посредством делеции ключевых компонентов аппарата преобразования miRNA, т.e., Dicer или Drosha ко-фактора DGCR8 (Kanellopoulou et al. 2005; Giraldez et al. 2005; Wang et al. 2007; Davis et al. 2008). Затем несколько лаб. использовали преимущества вновь разработанной техники по избирательной модуляции активности специфических miRNAs для выяснения их функций (rev. Akerblom et al. 2012). Тем не менее, принимая во внимание большие количества выдов miRNA, экспрессируемых в ЦНС, знание о базирующейся на miRNA регуляции во время нейрогенеза, всё ещё незначительны. Это особенно верно для нейрального развития человека, которое, влоть до недавнего времени, было невозможно стандартизировать при экспериментах in vitro. C увеличением доступности типов клеток нейронов человека, получаемых из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPS), теперь появилась возможность изучения miRNAs в связи с физиологией человека (rev. Benchoua and Peschanski 2013). Углубление информации о роли miRNAs во время детерминации судеб нейронов может в конечном итоге также к разработке точных протоколов по генерации специфических подтипов нейронов человека.

MicroRNAs regulating the transition of pluripotent stem cells to the neural lineage


Будучи вынуждены вступить на путь нервной дифференцировки, клетки hPS подвергаются специфическому переходу судеб, напоминающему нейральное развитие in vivo. Сюда входит переход hPS клеток в нейроэпителиальные клетки, их отделение в самостоятельные нейральные предшественники и терминальная дифференцировка в специфические типы нейронов и глии. Более того, hPS клетки реагируют на те же самые внеклеточные сигналы, регулирующие и развитие нейронов in vivo. Напр., во время развития нейральная индукция базируется на ингибировании Activin/TGFβ-обусловленного пути плюрипотентности и анти-нейральных эффектах BMP (rev. Stern 2005). Соотв., фармакологическая блокада передачи сигналов BMP/TGFβ может быть использована, чтобы более мощно способствовать превращению hPS клеток в направлении нейрального клона (e.g., Lee et al. 2007; Smith et al. 2008; Chambers et al. 2009). Этот подход был обозначен "dual SMAD inhibition", поскольку передача сигналов BMP и Activin/TGFβ съодятся на SMAD белках, как главных молекул сигнальной трансдукции (Chambers et al. 2009).
Идентифицировано несколько miRNAs, которые воздействуют на компоненты или модуляторы сигнального каскада BMP/TGFβ позитивно или негативно, влияя на переход hPS клеток в нейральный клон (rev. Benchoua and Peschanski 2013) (Fig. 1a, b). С др. стороны, нейральной индукции способствуют miR-125a/b и miR-135b, которые целенаправленно воздействуют на ключевые компоненты сигнального каскада BMP/TGFβ, включая разные рецепторы и SMAD сигнальные трансдукционные молекулы (Boissart et al. 2012; Bhinge et al. 2014). С др. стороны, miR-302/367 блокируют нейральную индукцию и вносят вклад в более высокий уровень базового состояния передачи сигналов BMP, воздействуя на некоторые эндогенные ингибиторы пути, такие как Lefty, DAZAP2, SLAIN1 и TOB2 (Rosa et al. 2009; Lipchina et al. 2011). Сходным образом, miR-371 может косвенно увеличивать активность BMP в клетках hPS, воздействуя целенаправлено на BMP репрессоры (Kim et al.2011). Фактически, определенные линии клеток hPS характеризуются повышенными уровнями miR-371, что сопровождается более высокой резистентностью к нейральной индукции (Kim et al. 2011). MiR-200 действует на тот же самый путь и репрессирует нейральную индукцию клеток hES путем воздействия на транскрипционный фактор ZEB - негативный регулятор передачи сигналов BMP/TGFβ (Du et al. 2013). В свою очередь, экспрессия семейства miR-200 подавляется с помощью ZEB транскрипционных факторов, образуя двойную негативную направленную обратно петлю (Burk et al. 2008). МикроРНК могут также непосредственно модулировать экспрессию транскрипционных факторов, важных для спецификации нейроэктодермы или плюрипотентности (Fig. 1c). Напр., miR-96 специфически подавляет нейральную индукцию клеток hES, воздействуя на транскрипционный фактор PAX6 (Du et al. 2013). PAX6, в свою очередь, активирует экспрессию др. транскрипционных факторов, связанных с предопределением нейральной судьбы, а также miR-135b, которая, как было установлено, вносит вклад в переход к нейральному клону (Bhinge et al. 2014). Др. примером является miR-302/367, которая помимо своей роли в дерепрессии пути BMP, репрессирует пронейральный транскрипционный фактор NR2F2 (Rosa and Brivanlou 2011). В этом контексте miR-302 может действовать как второй слой регуляции после OCT4, который индуцирует экспрессию miR-302 , но также непосредственно репрессирует транскрипцию NR2F2. В свою очередь, NR2F2 репрессирует транскрипцию OCT4 во время дифференцировки и тем самым усиливает свою собственную экспрессию. MiR-145, напротив, способствует дифференцировке hES клеток в мезодермальный и нейроэктодермальный клоны, как часть двойной негативной, направленной обратно, петли с OCT4 (Xu et al. 2009). В недифференцированных hES клетках экспрессия miR-145 репрессируется с помощью OCT4. После дифференцировки miR-145 усиливает свою активность, приводя к подавлению OCT4 и др. генов плюрипотентности путем непосредственного воздействия (Xu et al. 2009). Др. мощный ингибитор плюрипотентности и промотор нейрального клона это семейство let-7 miRNA (rev. Greve et al. 2013 and Rehfeld et al. in this Special Issue). В ES клетках возникают промежуточные образования после процессинга let-7 и тем самым экспрессия зрелых let-7 ставится под угрозу благодаря действию Lin28A и Lin28B (Rybak et al. 2008; Heo et al. 2009; Piskounova et al. 2011). В клетках нейральных предшественников экспрессия Lin28 подавляется, что позволяет накапливаться зрелым let-7, это усиливается с помощью воздействия на let-7 его собственного негативного регулятора Lin28 (Guo et al. 2006; Rybak et al. 2008). См. также обзор Rehfeld et al. in this Special Issue.

Fig. 1 Schematic representation of miRNA-target interactions regulating neural lineage entry of hPS cells. (a) Overview of the miRNAs contributing to neural induction by influencing the activity of anti-neural BMP/TGFβ signaling (b) or by directly regulating the expression of pluripotency- and neural fate-associated transcription factors (c; miRNAs labeled in red have an inhibitory and miRNAs in green a promoting effect on neural induction. (b) Both miR-302 and miR-371 potentiate BMP signaling via targeting BMP inhibitors, thus creating a barrier for neural induction. Likewise, miR-200 promotes BMP signaling as part of a double-negative feed-back loop with the BMP repressor ZEB. In contrast, miR-125b and miR-135b interfere with BMP/TGFβ signaling by targeting SMAD4 and other important components of the BMP/TGFβ signaling cascade leading to an enhanced neural lineage entry. (c) In addition to its impact on BMP signaling, miR-302 also acts in concert with OCT4 to ensure repression of pro-neural NR2F2. Reciprocally, NR2F2 represses OCT4 expression, forming a double-negative feed-back loop. OCT4 directly represses miR-145 expression and indirectly inhibits let-7 maturation via induction of Lin28 expression. In turn, both miR-145 and let-7 repress the expression of pluripotency factors and promote differentiation. In contrast, miR-96 interferes with neural induction by targeting the neural lineage determinant PAX6. PAX6, in turn, activates other neuronal transcription factors and miR-135

MicroRNAs regulating the balance between neural progenitor self-renewal and differentiation


Как только предопределяется нейральная судьба, высоко организованная сеть онтогенетических сигналов начинает регулировать пролиферацию и пространственное распределение нервных предшественников. Обилие этих игроков тонко контролируется с помощью определенного набора miRNAs, находящихся в головном мозге. Так, miR-124, miR-125b, miR-137, miR-9 и let-7, как было установлено, способствуют нейральной дифференцировке, др. miRNAs, такие как miR-134 и miR-184, участвуют в поддержании и пролиферации нейральных предшественников (rev. Bian et al. 2013). Более того, miRNAs могут регулировать сдвиг с нейрональной на глиальную судьбу и способствовать генерации астроцитов или олигодендроцитов (rev. He et al. 2012b; Zheng et al. 2012). Среди miRNAs, концентрирующихся в головном мозге, функции miR-124 и miR-9 в обеспечении нейрональной дифференцировки были тщательно исследованы (rev. Coolen et al. 2013; Akerblom and Jakobsson 2013; see also Abernathy and Yoo, this Special Issue). Обе miRNAs взаимодействуют с сетью регуляторных генов и вызывают переключение генов, чтобы запускать экспрессию программы нейрональной дифференцировки (Fig. 2). Избыточная экспрессия miR-124 в клетках Hela способна изменить профиль их экспрессии, так что они начинают напоминать нейрональные клетки (Lim et al. 2005). Далее было продемонстрировано, что возможно действительно трансдифференцировать фибробласты и др. соматические клетки в т. наз. индуцированные нейроны с избыточной экспрессией специфических нейрогенных транскрипционных факторов (Vierbuchen et al. 2010; Pang et al. 2011). Интересно, что это прямое превращение далее может быть поддержано с помощью miR-124 или даже индуцировано с помощью избыточной экспрессии только miR-124 и miR-9/9*, указывая, что эти miRNAs могут быть инструктивными для приобретения нейральной судьбы (Ambasudhan et al. 2011; Yoo et al. 2011). Функция miR-124 и miR-9/9* во время нейронального превращения может, по крайней мере, частично базироваться на их кооперативном влиянии на АТФ-зависимый комплекс ремоделирования хроматина BAF. Субъединичный состав этого комплекса отличается между нейральными предшественниками и пост-митотическими нейронами. Один из основных компонентов, заменяемый после нейрональной дифференцировки, это BAF53a, который замещается его гомологом BAF53b. Эктопическая экспрессия miR-9* и miR-124 вызывает подавление BAF53a, делая возможной включение BAF53b, это также важно для выроста дендритов (Yoo et al. 2009). Сходное с помощью miRNA-обеспечиваемое переключение было установлено для PTBP1, который экспрессируется в нейральных предшественниках, и является гомологом PTBP2, который экспрессируется в нейронах. Связывание РНК Polypyrimidine tract-binding proteins (PTBPs) влияет на транскрипцию, локализацию, стабильность и модификации мРНК. Они даже влияют на на активность миРНК, путем изменения вторичной структуры мРНК и конкурирует за связывание с сайтами мишенями для miRNA (Xue et al. 2013). PTBP1 взаимодействует с экспрессией PTBP2 на уровне сплайсинга мРНК PTBP2. MiR-124-индуцированная экспрессия PTBP1 вызывает этот ингибирующий эффект, делая возможной экспрессию PTBP2, который в свою очередь способствует переключению на специфичную для нейронов программу альтернативного сплайсинга (Visvanathan et al.2007). Исчерпание активности PTBP1 в не нейрональных клетках, как было установлено, достаточно, чтобы инициировать превращение в нейроны (Xue et al. 2013). Это может быть частично приписано тому факту, что PTBP1 блокирует miRNA-обеспечиваемую регуляцию др. репрессора нейрогенеза - комплекса repressor-element-1 silencing transcription factor (REST) (Xue et al. 2013). PTBP1 конкурирует с miR-124 и miR-96 за связывание мРНК REST ко-фактора SCP1 (Xue et al. 2013). Вызываемый условиями нокаут REST в фибробластах достаточен, чтобы индуцировать повышенную экспрессию нейральных генов, но не вызывает сдвиг в качественных особенностях клеток, т.к. специфичные для фибробластов гены продолжают экспрессироваться (Aoki et al. 2012). Во время нейрогенеза REST сам по себе подвергается пост-траскрипционной регуляции благодаря сайту функционального связывания для miR-9 в его 3'UTR (Packer et al. 2008). Кроме того, miR-9*-a функциональная miRNA, продуцируемая с того же самого шпилечного (hairpin) предшественника, что и miR-9, регулирует CoREST, ещё один важный REST ко-фактор. В свою очередь REST репрессирует избыточную экспрессию нейрональных генов и нейрональных miRNAs, включая miR-124 и miR-9/9* (Wu and Xie 2006; Conaco et al. 2006; Otto et al. 2007). Итак, miR-124 и miR-9/9* являются центром сложного регуляторного circuit, участвующего в мотивах переключения BAF53a/BAF53b и PTBP1/PTBP2, и в двойной негативной направленной назад петле с REST (Fig. 2).

Fig. 2 MiR-124 and miR-9/9* engage in complex regulatory circuits activating a neuronal gene expression program. Expression of miR-124 and miR-9/9* is controlled by the neurogenic repressor REST and its co-factors SCP1 and CoREST. In addition, miR-9/9* is repressed by TLX and the Notch effector HES1. During neuronal differentiation, miR-124 and miR-9/9* are up-regulated and reinforce their own expression by targeting their negative regulators. For instance, miR-9 forms auto-regulatory loops with HES1 and the let-7 target TLX. Both miR-124 and miR-9/9* repress the expression of additional components of the Notch pathway (PW). Furthermore, forced expression of miR-124 and miR-9/9* induces a switch of epigenetic regulators. MiR-124 and miR-9* favor the switch from BAF53a to BAF53b to be included in the BAF chromatin remodeling complex leading to the induction of dendritic outgrowth. In addition, miR-124 targets the mRNA splicing regulator PTBP1 allowing the expression of the neuron-enriched homolog PTBP2, which induces a neuron-specific pre-mRNA splicing pattern. Down-regulation of PTBP1 also leads to the abolishment of its inhibitory impact on the interaction of miR-124 with REST co-factor SCP1
Регуляция пролиферации нейральных предшественников с помощью miR-9 базируется на всей сети из др. партнеров по взаимодействию. Др. узел в этом комплексе взаимодействий - это петля обратной связи с орфановым ядерным рецептором TLX/NR2E1 (Fig. 2). Этот транскрипционный фактор регулирует поддержание и самообновление нейральных стволовых клеток взрослых посредством рекрутирования HDAC репрессоров, запускающих гены мишени, подобные p21 и Pten (Sun et al. 2007). TLX, как было установлено, репрессирует экспрессию miR-9, в то время как miR-9 снижает уровни белка TLX в нейральных стволовых клетках взрослых (Zhao et al. 2009). Однако, данные по нокауту miR-9_2/miR-9_3 у мышей указывают на то, что в зависимости от стадии развития, miR-9 может ассоциировать с РНК-связывающим белком Elavl1, чтобы усиливать трансляцию TLX (Shibata et al. 2011). Было установлено, что let-7b и let-7 служат мишенями TLX , а также то, что они могут быть способны запускать дифференцировку с помощью дерепрессии miR-9 (Zhao et al. 2010, 2013). Кроме того, при их ассоциации с Elavl1, miR-9 конкурирует с Elavl2 за связывание мРНК мишеней. Elavl2 соединяется с U-богатыми регионами мРНК FoxG1, тем самым ослабляется miR-9-обусловленная супрессия FoxG1 (Shibata et al. 2011).
Передача сигналов Notch является одним из ключевых путей, регулирующих нейрональное развитие и экспансию нейрональных предшественников. И miR-124 и miR-9, как было установлено, воздействуют на некоторые компоненты сигнального каскада Notch (Fig. 2). Вто время как miR-124 целенаправленно воздействует на Notch лиганд Jag1 (Liu et al. 2011) и стоящий ниже Notch эффектор Sox9 (Cheng et al.2009), miR-9 регулирует членов семейства генов Hes (Leucht et al. 2008; Bonev et al. 2011,2012; Coolen et al. 2012). В свою очередь, уровни miR-9, по-видимому, зависят от передачи сигналов Notch, выстраивая ещё одну петлю обратной связи (Coolen et al. 2012; Bonev et al. 2012). В нейральных предшественниках мыши эта обратная связь вызывает осцилляции, не совпадающие по фазе уровней pri-miR-9 и Hes1 (Bonev et al. 2012). Однако, зрелые miR-9 накапливаются со временем, ограничивая период осцилляций. Предположительно этот механизм участвует в контроле времени дифференцировки нейрональных предшественников, после этого нейрональная дифференцировка сопровождается высокими уровнями miR-9 и низкими уровнями Hes1 (Bonev et al. 2011, 2012). Взаимодействие miR-9 с путём передачи сигналов Notch было обнаружено также у Drosophila. Дрозофилийный гомолог miR-9a воздействует на Notch-обеспечиваемую латеральную ингибицию во время спецификации предшественников сенсорных органов путем воздействия на dLMO (Li et al. 2006; Biryukova et al. 2009) и senseless (Cassidy et al. 2013). Однако, эти данные следует интерпретировать с осторожностью, поскольку у Drosophila экспрессия miR-9 ограничивается эпителиальными клетками (Li et al. 2006) и, следовательно, не отражает профиля экспрессии, концентрирующейся в головном мозге позвоночных (Sempere et al.2004; Miska et al. 2004; Wienholds et al. 2005). Полученные данные иллюстрируют, что miR-124 и miR-9/9* добавляют дополнительный уровень сложности к высоко урегулированной сети, лежащей в основе нейрональной дифференцировки. Однако, число мишеней для miR-9 и miR-124 постоянно растет (rev. Coolen et al. 2013; Akerblom and Jakobsson 2013).

The role of microRNAs during neuronal subtype specification


Помимо своего общего воздействия на дифференцировку нейронов, miRNAs вносят вклад в разнообразие, выявляемое в ЦНС. Головной мозг позвоночных состоит из многих разнообразных подтипов с разными фенотипами нейротрансмиттеров, функциями и мишенями иннервации. Эти разные подтипы развиваются из первоначально довольного ограниченного числа мультипотентных клеток нейральных предшественников. Во время нейрального развития клетки нейральных предшественников адоптируются к разным пространственным особенностям вдоль передне-задней оси (AP) и дорсо-вентральной (DV) оси нервной трубки и впоследствии генерируют разные нейрональные и глиальные подтипы. В зависимости от их позиции в координатах AP и DV, нейральные стволовые клетки подвергаются воздействию специфических морфогенов, таких как SHH, FGFs, Wnts и BMPs, которые секретируются организационными центрами (rev.Le Drеau and Marti 2012). Базируясь на комбинации градиентов этих сигналов и внутренне присущих сигналов, нейральные стволовые клетки активируют специфические программы транскрипции, детерминирующие их компетентность, т.е. диапазон их предшественников нейральных подтипов (rev. Fishell and Heintz 2013; Kohwi and Doe 2013). Более того, нейральные предшественники могут приобретать самостоятельные временные характеристики и могут изменять компетентность времени их дифференцировки, как напр., во время развития сетчатки и коры головного мозга (rev. Kohwi and Doe 2013). Качественные особенности разных типов клеток нейронов предопределяются с помощью экспрессии комбинации транскрипционных факторов модулируются с помощью др. регуляторов генной экспрессии, включая miRNAs. Тем самым miRNAs могут контролировать генетические сдвиги и регулировать экспрессию важных детерминантов клеточных судеб пространственным и временным способом. Более того, miRNAs могут модулировать передачу сигналов количеств морфогенов путем воздействия на важные компоненты их соотв. сигнальных каскадов (rev. Inui et al. 2010, 2012). Вклад miRNAs в выбор нейрональных подтипов см. в Табл. 1.

Table 1

MicroRNA-target interactions involved in neuronal subtype specification in vivo 

         miRNA        Target        Function        Species        Reference
ASE chemo-sensory neurons        lys-6        COG-1        Induction of ASEL identity
C. elegans        Johnston and Hobert2003; Johnston et al. 2005

        miR-273        DIE-1        Induction of ASER identity
Mushroom body neurons        let-7, miR-125        chinmo, abrupt        Temporal
control of neuronal subtype specification
 Drosophila        Wu et al.2012; Kucherenko et al. 2012

Anterior-posterior axis        miR-9        Hes1 (homologs)        Promotion of cell cycle exit
and differentiation, specific impact on survival of forebrain but not hindbrain
 neuronal progenitors
        Xenopus; zebrafish; mouse        Bonev et al.2011, 2012; Coolen et al. 2012

Cortex        miR-9        FoxG1, several other targets     Important for the generation
 of Cajal Retzius cells and proper cortical layer formation
Mouse        Shibata et al. 2008,2011

        a    MiRNA activity is necessary for proper generation of cortical layers
         Mouse        Saurat et al.2013

Retina        miR-129, miR-155, miR-214, miR-222        Xotx2, Xvsx1
Developmental timing of subtype specification
Xenopus        Decembrini et al. 2009

        let-7, miR-125, miR-9        Ptrg, Lin28b        Acceleration of progenitor fate
        progression towards late-born neurons
        Mouse        La Torre et al. 2013

Olfactory bulb        miR-7a        Pax6        Restriction of DA neuron differentiation
Mouse        de Chevigny et al. 2012

Midbrain        miR-135a        Lmx1b        Delimiting the DV extent of the dopaminergic progenitor pool
Mouse        Anderegg et al. 2013

Midbrain-hindbrain boundary        miR-9      Fgfr1, Canopy, Fgf8, Her5, Her9
       Maintenance and correct positioning of the midbrain-hindbrain boundary
Zebrafish        Leucht et al. 2008

Spinal cord        miR-17-3p        Olig2        Specification of the p2-pMN progenitor
 boundary
Mouse        Chen et al.2011

        miR-196        Hoxb8        Spatial restriction of lumbar motor neuron identity
        Chicken        Asli and Kessel 2010

        miR-9        FoxP1        Specification of spatial MN identity (LMC and MMC column)
        Chicken        Otaegi et al.2011; Otaegi et al.2012

                OC1        Specification of temporal MN identity (switch from early- LMCm to late-born LMCI)
Chicken        Luxenhofer et al. 2014

DA dopaminergic, DV dorso-ventral, LMC lateral motor neuron column, LMCl lateral LMC subcolumn, LMCm medial LMC subcolumn, MMC medial motor neuron column,MN motor neuron

a - Inferred from Dicer knock-out experiments, no specific miRNA identified so far

Первые доказательства, подчеркивающие модулярную роль miRNAs в программировании нейрональных характеристик получены при исследовании C. elegans (Johnston and Hobert 2003; Johnston et al.2005). Имеются два класса C. elegans ASE хемосенсорных нейронов, которые расположены на правой (ASER) или левой (ASEL) стороне головы червя. Хотя эти нейроны обладают многими общими характеристиками в отношении их проекции и профиле генной экспрессии, они функционально отличны и реагируют на разные внешнесредовые сигналы. Их лево-правосторонняя асимметрия устанавливается с помощью пары miRNAs (lys-6, miR-273) иих транскрипционных факторов мишеней (DIE-1, COG-1), которые вместе формируют перекрестно репрессивную петлю. ASEL нейроны обнаруживают высокие уровни экспрессии lys-6, который непосредственно репрессирует транскрипционный фактор, способствующий ASER, фактор COG-1. Низкие уровни экспрессии COG-1 делают возможной экспрессию транскрипционного фактора DIE-1, который индуцирует экспрессию ASEL генов, включая и lys-6, в то же время репрессирует ASER-ассоциированные гены. В свою очередь, ASER нейроны не экспрессируют lys-6, а высокие уровни COG-1, которые индуцируют экспрессию miR-273. Эта miRNA воздействует на DIE-1, приводя тем самым к дерепрессии ASER генов (Hobert 2004; rev. Alqadah et al. 2013).
В ЦНС позвоночных некоторые miRNAs обнаруживают регион-специфические паттерны экспрессии, указывающие, что разные подтипы нейронов, располагающиеся в этих регионах, могут экспрессировать разные профили miRNA (Kapsimali et al. 2007; Landgraf et al. 2007; Kim et al. 2007). Недавно He et al. (2012a) проанализировали репертуар активных miRNA в специфических подтипах головного мозга взрослых мышей. Для этой цели они использовали miRNA-tagging and affinity-purification (miRAP), которая базируется на Cre-индуцированном клеточно-специфическом мечении (tagging) Argonaute 2 (AGO2) и последующей совместной иммуно-очистке меченного-AGO2 и ассоциированных с ним miRNAs (He et al. 2012a). Используя этот подход, они смогли продемонстрировать, существенные различия между экспрессируемым репретуаром miRNA глютаматергическими нейронами и GABAergic промежуточными нейронами совместно экспрессирующими или parvalbumin (PV) или somatostatin (SST). Напр., miR-133b и miR-187 обнаруживали более высокие уровни экспрессии в GABAergic нейронах, чем в глютаматергических нейронах, при этом miR-133b была обогащена в PV-экспрессирующих, а miR-187 в SST-экспрессирующих GABAergic нейронах.
Несколько исследований были посвящены влиянию глобально потери miRNA на развитие специфических регионов головного мозга с помощью нокаута Dicer, ключевого энзима биогенеза miRNA. Используя систему Cre/loxP рекомбинации, были разработаны разные модели мышей для регион-специфической и специфической для типа клеток деплеции Dicer, напр., для сетчатки (Georgi and Reh 2010; for an overview, see Cremisi 2013), коры головного мозга (De Pietri et al. 2008; Saurat et al.2013; Cremisi 2013), гиппокампа (Li et al. 2011a), среднего мозга (Kim et al. 2007; Huang et al. 2010; Pang et al. 2014) и спинного мозга (Zheng et al. 2010; Chen and Wichterle 2012). Интересно, что влияние нокаута Dicer оказалось вариабельным в отношении разных регионов головного мозга и затрагиваемых подтипов нейронов. Напр., вызванный условиями нокаут Dicer во время поздней стадии dopaminergic дифференцировки мышиных ES клеток приводило к полной потере dopaminergic нейронов, тогда как количество GABAergic нейронов уменьшалось только на 50 % (Kim et al. 2007). То же самое исследование далее продемонстрировало, что истощение Dicer в мышиных постмитотических dopaminergic нейронах среднего мозга с использованием DAT-Cre линии, вызывало прогрессивную потерю этих клеток, причем это сопровождалось появлением симптомов, сходных с таковыми при болезни Паркинсона (Kim et al. 2007). Сходная потеря dopaminergic нейронов, обусловленная повышенным апоптозом, также наблюдалась после специфической делеции Dicer в среднем мозге постнатальных мышей при использовании adenovirus/AAV2-обусловленно доставки Cre (Pang et al. 2014).
Поскольку исследования по устранению Dicer выявили общую важность miRNAs для развития и поддержания разных клеточных типов нейронов, то дальнейшие исследования привели к идентификации специфических miRNAs, участвующих в спецификации нейрональных подтипов (Table 1).

MicroRNAs regulating the spatial identity of neural progenitors


Подразделение ЦНС на основные подразделения вдоль AP оси (передний, средний, задний мозг и спинной мозг) регулируется с помощью локальных организационный центров (Lumsden and Krumlauf 1996; Kiecker and Lumsden 2012). Один из них, midbrain-hindbrain boundary (MHB), также наз. перешеком, регулирует формирование паттерна среднего и передней части заднего мозга посредством передачи сигналов Wnt и FGF (Wurst and Bally-Cuif 2001). У рыбок данио уровни MHB эффекторов, таких как fgfr1, fgf8 и canopy, а также генов, предупреждающих нейрогенез MHB , т.e., her5 и her9, регулируются с помощью miR-9 (Leucht et al. 2008). Интересно, что MHB является единственной частью нервной трубки у рыбок данио, где miR-9 не может быть обнаружена (Leucht et al. 2008). Исследования избыточности или потери функции подчеркнули важность активности miR-9 для поддержания и корректного позиционирования этого организующего центра. В то время как эктопическая экспрессия miR-9 определяет границы пространственного распространения MHB, подавление miR-9 вызывает его экспансию вдоль AP оси (Leucht et al. 2008). Защита fgfr1 от воздействия miR-9 достаточна, чтобы частично восстановить формирование MHB, это подчеркивает важность передачи сигналов FGF во время этого процесса. Однако, эффект избыточной экспрессии miR-9 на экспрессию маркеров MHB появляется раньше и оказывается даже более выраженным, чем изменения наблюдаемые у fgf8-мутантных рыбок данио ace, указывая тем самым, что задействовано в игре гораздо больше мишеней (Leucht et al. 2008). Соотв., защита только мишени Hes гомолога Her5 в присутствии miR-9 оказывалось способным восстанавливать экспрессию MHB маркеров (Leucht et al. 2008).
Функциональные целенаправленные воздействия на Hes гены miR-9, как было установлено, законсервированы у Xenopus и мышей (Bonev et al. 2011, 2012; Coolen et al. 2012). У обоих организмов miR-9 действует как тонкий настройщик нейрогенеза, как часть негативной петли обратной связи с Hes генами (Coolen et al. 2012; Bonev et al. 2012). У Xenopus, потеря miR-9 вызывает неспособность к нейрогенезу вдоль AP оси за счет дерепрессии Hes1 гомолога hairy1 (Bonev et al. 2011, 2012). Возникающие в результате повышенные уровни hairy1, как было установлено, способствуют пролиферации посредством Fgf8, Zic1 и CyclinD1 (Bonev et al. 2011). Однако, помимо своей генеральной роли в выходе из клеточного цикла, воздействие miR-9 на нейрональные предшественники Xenopus отличаются в зависимости от анализируемого региона (Bonev et al. 2011, 2012). В заднем мозге Xenopus экспрессия miR-9 ограничена нейральными предшественниками, которые увеличивают свой регион после её потери. В переднем мозге miR-9 экспрессируется в предшественниках, а также в развивающихся нейронах. При этом потеря miR-9 вызывает p53-обусловленный апоптоз, который противодействует увеличению пролиферации, приводя к неожиданному уменьшению общего количества нейральных предшественников (Bonev et al. 2011, 2012). Эта региональная специфичность может объяснить и разноречивые данные, связанные с функцией miR-9 в отношении экспансии нейральных предшественников (Zhao et al. 2009; Delaloy et al. 2010; Shibata et al. 2011).
Пространственные особенности нейральных предшественников вдоль DV оси также испытывают влияние со стороны miRNAs. MiR-7a регулирует нейрогенез у взрослых в обонятельной луковице и экспрессируется в виде дорсо-вентрального градиента в стенках желудочков (de Chevigny et al. 2012). Базируясь на сегментации боковых стенок желудочков, генерируются определенные типы нейронов обонятельных луковиц. Dopaminergic нейроны преимущественно генерируются из предшественников, расположенных дорсальной части перивентрикулярной зоны - региона, обладающего относительно низкой экспрессией miR-7a (de Chevigny et al. 2012). Dopaminergic спецификация зависит от транскрипционного фактора Pax6, чей 3'UTR несет сайт функционального связывания для miR-7a. Подавление miR-7a приводит к усилению вентральной экспрессии Pax6 и к более высокой скорости дифференцировки допаминергических нейронов в обонятельных луковиц (de Chevigny et al. 2012).
Недавно было показано, что miR-135a определяет границы дорсо-вентрального распространения допаминергических предшественников путем целенаправленного воздействия на Lmx1b во время развития среднего мозга мыши (Anderegg et al.2013). Домен экспрессии FoxA2/Lmx1a/b оказывался заметно редуцирован после эктопической экспрессии miR-135a - одновременно с нарушением генерации TH-позитивных допаминергических нейронов. Более того, величина домена экспрессии Wnt1и активность Wnt в целом в развивающемся среднем мозге были уменьшены. Избыточная экспрессия Lmx1b вызывает противоположные эффекты, так, домен допаминергических нейронов в среднем мозге был расширен, а активность Wnt повышена. Интересно, что эктопическая экспрессия Lmx1b увеличивает miR-135a, тогда как истощение Lmx1b снижает экспрессию этой miRNA. Т.о., miR-135a и Lmx1b могут быть задействованы в негативной петле обратной связи для тонкой настройки активности Wnt, распределения предшественников среднего мозга и размера среднего мозга. Воздействие miR-135a на передачу сигналов Wnt может быть частично обусловлено индуцированным подавлением Lmx1b. Однако, miR-135a может также взаимодействовать непосредственно с передачей сигналов Wnt, поскольку некоторое количество молекул Wnt было идентифицировано как потенциальные мишени для miR-135a (Anderegg et al. 2013).
Итак, эти данные иллюстрируют как закладываемые качественные особенности нейронов вдоль пространственных координат нервной системе модулируются с помощью miRNAs, тонко настраивающих экспрессию важных детерминант судьбы м модуляции передачи сигналов морфогенов.

MicroRNAs regulating temporal fate specification of neural progenitors


Во время развития сетчатки и коры головного мозга клетки нейральных предшественников (ретинальные предшественники и клетки радиальной глии, соотв.) проходят через разные состояния компетентности. Это приводит к последовательному появлению разных типов нервных клеток, которые организуются в слоистые образования в соответствии с последовательностью их появления (corticogenesis: rev. Greig et al. 2013; retinogenesis: rev. Centanin and Wittbrodt 2013). Этот сдвиг в компетентности предшественников в соответствии со временем контролируется несколькими транскрипционными факторами и имеются доказательства, что miRNAs также и здесь играют регуляторную роль (rev. Cremisi 2013). Обусловленная делеция Dicer во время раннего развития сетчатки мышей приводит к увеличенной и продолжительной продукции рано зарождающихся клеток ганглиев, тогда как продукция поздно возникающих типов клеток нарушена (Georgi and Reh 2010). Сходным образом, только кортикальные стволовые клетки Dicer-нулевых мышей были способны продуцировать рано зарождающийся глубокий слой проэцирующихся нейронов и были неспособны генерировать поздно возникающий слой нейронов (Saurat et al. 2013). Было предположено, что продукция поздно зарождающихся нейронов может критически зависеть от активности системы miRNA. Следует упомянуть в этой связи, что продукция клеток Cajal Retzius, которые испускают инструктивные сигналы собственно для кортикального развития, нарушена у мышей с двойным нокаутом miR-9_2/9_3 (Shibata et al. 2011). Соотв., ингибирование miR-9 с помощью анти-смысловых олигонуклеотидов приводит к аномальному развитию кортикальных слоёв (Shibata et al. 2008, 2011). См. также обзор Abernathy and Yoo in this Special Issue.
Во время развития сетчатки специфический субнабор miRNAs, как было установлено, модулирует судьбы нейральных предшественников, обеспечивая корректную экспрессию во времени ключевых транскрипционных факторов (reviewed by Cremisi 2013). У Xenopus, гомеобоксные гены Xotx2 и Xvsx1 необходимы для генерации биполярных нейронов, последнего типа продуцируемых биполярных нейронов. Хотя соотв. транскрипты уже присутствуют среди ранних ретинальных предшественников, белки Xotx2 и Xvsx1 обнаруживаются только на поздних стадиях благодаря действию 4-х miRNAs. Эти miRNAs, т.e., miR-129, miR-155, miR-214 и miR-222, подавляются во время развития сетчатки, это делает возможной трансляцию Xotx2 и Xvsx1 (Decembrini et al. 2009). Ингибирование этих miRNAs с помощью трансфекции соотв. анти-смысловых нуклеотидов в зрительном пузырьке приводит к эктопической генерации биполярных нейронов. Интересно, что уровень их экспрессии связан с длиной цикла клеток предшественников, которая увеличивается во время развития сетчатки и может служить как внутренне присущий таймер возраста нейральных предшественников (Ohnuma et al.2002; Decembrini et al. 2009; Pitto and Cremisi 2010). Удлинение цикла этих клеток за счет подавления передачи сигналов SHH приводит к снижению экспрессии miR-129, miR-155, miR-214 и miR-222, тогда как ускорение клеточного цикла оказывает противоположный эффект (Decembrini et al. 2009). Др. группа miRNAs, т.e., let-7, miR-125 и miR-9, как было установлено, способствует прогрессии ретинальных предшественников у мышей от ранних к поздним судьбам путем целенаправленного воздействия на Protogenin (Ptrg) и Lin28b, двух факторов, участвующих в приобретении компетентности ранними ретинальными предшественниками (La Torre et al. 2013). Избыточная экспрессия let-7, miR-125 и miR-9 ускоряет прогрессию по выбору предшественниками судеб и развитие поздно-зарождающихся нейронов. Напротив, избыточная экспрессия их генов мишеней - Ptrg и Lin28b - сохраняет клетки предшественники в состоянии ранней компетентности. Сходным образом, их функция служит индикатором развития сетчатки, недавние находки подтвердили роль let-7 aи miR-125 во время спецификации судеб во времени в нейронах Drosophila mushroom body (MB) (Wu et al. 2012; Kucherenko et al. 2012). Здесь let-7 и miR-125 вносят вклад в прогрессивное подавление chinmo, который контролирует спецификацию подтипов MB зависимым от концентрации способом (Wu et al. 2012). Помимо chinmo, let-7 и miR-125 также неожиданно воздействуют на др. временной регулятор спецификации подтипов MB (Kucherenko et al. 2012). Недавно было показано, что промежуточные нейроны обонятельных луковиц (OB), генерируемые во время эмбриогенеза, не обнаруживают экспрессии miR-125b, тогда как промежуточные нейроны OB, генерируемые во время нейрогенеза у взрослых, обнаруживают экспрессию miR-125b (Akerblom et al. 2014). Следовательно, отсутствие экспрессии miR-125b возникает, чтобы делать разными субпопуляции промежуточных нейронов OB, генерируеые в разные периоды времени, подтверждая, что miR-125b может участвовать в регуляции появления во времени разных подтипов нейронов. Интересно, что и let-7 и miR-125b регулируют прогрессию выбора судеб в зависимости от времени в разных клонах во время развития C. elegans (Olsen and Ambros 1999; Ambros et al. 2003; Ambros 2011). Итак, хотя клеточный контекст отличен, но сходные факторы, такие как let-7 и miR-125b, участвуют в контроле переходов в выборе судеб во время развития.

MicroRNAs regulating neuronal subspecification in the spinal cord


Дополнительные доказательства важности miRNAs как пространственных, так и временных регуляторов получены согласно данным по развитию спинного мозга. Спинной мозг, который подразделен на (11) самостоятельных доменов нейральных предшественников вдоль дорсо-вентральной оси, является хорошо охарактеризованным примером формирования пространственного паттерна нейронов. В зависимости от комбинаторного кода транскрипционных факторов, экспрессируемого предшественниками, каждый домен дает отличающийся набор нейрональных подтипов, т.е. несколько классов промежуточных нейронов или моторных нейронов (MN) (rev., Jessell 2000; Dessaud et al. 2008). Показано, что три miRNAs (miR-17-3p, miR-196 и miR-9) участвуют в спецификации подтипов нейронов спинного мозга.
Первым примером является miR-17-3p, которая участвует в формировании DV паттерна в спинном мозге мыше и влияет на генерацию двигательных нейронов (Chen et al. 2011). Формирование паттерна развивающегося спинного мозга вдоль DV оси обеспечивается комбинаторным действием передачи сигналов SHH, ретиноевой кислоты (RA), BMP и Wnt (rev., Dessaud et al. 2008; Le Dr?au and Mart? 2012). Эти сигналы приводят к последовательной индукции детерминантов ключевых транскрипционных факторов, включая пары ко-регуляторов транскрипции. Эти пары взаимно репрессивных транскрипционных факторов действуют как генетические переключатели, чтобы обеспечить однозначные качественные особенности клеток предшественников (Briscoe et al. 2000; Dessaud et al. 2010). Граница между доменами двигательных нейронов (pMN) и промежуточных нейронов V2 (p2) специфицируется с помощью взаимно репрессирующих петель между Olig2 и Irx3, баланс которых регулируется с помощью miR-17-3p. Olig2 временно экспрессируется в раннем p2 домене и постепенно подавляется, чтобы сделать возможной экспрессию Irx3 и закрепить качественные характеристики p2 (Dessaud et al. 2010; Chen et al. 2011). MiR-17-3p экспрессируется в домене p2 и репрессирует Olig2 благодаря непосредственному взаимодействию с его 3'UTR. Потеря этой miRNA приводит к аномальной продукции промежуточных нейронов V2 и к экспансии домена pMN благодаря персистенции экспрессии Olig2 в p2 предшественниках.
Постмитотические двигательные нейроны из общего Olig2-позитивного домена pMN далее подразделяются на два разных подтипа двигательных нейронов, которые располагаются в виде продольно ориентированных столбов, т.e., на median (M), hypaxial (H), preganglionic (P) и lateral (L) моторные столбы. Столбы двигательных нейронов характеризуются своими уникальными паттернами проекций аксонов в мускулатуру. Напр., lateral motor column (LMC) иннервирует мышцы конечности, тогда как median motor column (MMC) проецируется в аксиальные мышцы (Jessell 2000; Dasen and Jessell 2009; Philippidou and Dasen2013). Латеральный моторный столб (LMC) далее расщепляется на две колонки: латеральную LMCl и медиальную LMCm колонки. Предопределение качественных характеристик разных двигательных нейронов обеспечивается с помощью Hox генов и дополнительных транскрипционных факторов, которые сами могут быть предметом регуляции с помощью miRNA, напр., с помощью miR-196 и miR-9 (Yekta et al. 2008; Asli and Kessel 2010; Otaegi et al. 2011). Во время развития спинного мозга miR-196 и Hoxb8 обнаруживают взаимно исключающую экспрессию вдоль AP оси. MiR-196, как полагают, действует как пост-транскрипционный регулятор Hoxb8 обеспечивая отсутствие экспрессии Hoxb8 в поясничном отделе двигательных нейронов (Asli and Kessel 2010). Эктопическая экспрессия Hoxb8в поясничной области приводит к аномальной генерации двигательных нейронов. Хотя ингибирование miR-196 в поясничном столбе двигательных нейронов воспроизводит эффект избыточной экспрессии Hoxb8 , это не приводит к усилению активности белка Hoxb8. Предполагается, что miR-196 может действовать в основном как самоотключающийся механизм, чтобы предупредить неподходящую экспрессию Hoxb8 вторично, управляя регуляцией транскрипции локуса Hoxb8 . Критическим ко-фактором Hox-зависимой пространственно регуляции качественных особенностей двигательных нейронов является FoxP1. Его экспрессия ограничена латеральными (LMC) и преганглиолярными (PGC) двигательными нейронами, которые являются - в противовес гипоаксиальным (HMC) и медиальным (MMC) двигательным нейронам - чувствительными к Hox (Dasen and Jessell 2009). Аномальная экспрессия или истощение FoxP1 строго влияет на диверсификацию двигательных нейронов и изорганизацию в столбы (Dasen et al. 2008; Rousso et al. 2008). В LMC, в двигательных нейронах спинного мозга кур уровни FoxP1 тонко регулируются с помощью перекрывающейся экспрессии miR-9 (Otaegi et al. 2011). Эктопическая экспрессия miR-9 даже переключает LMC в MMC, изменяя тем самым мишени их проекций аксонов (Otaegi et al. 2011). Этому эффекту противодействует эктопическая экспрессия FoxP1, подчеркивая, что FoxP1 является важной мишенью для miR-9 при субспецификации MN (Otaegi et al. 2012). В то же время электропортация, конкурирующих FoxP1 3'UTR индуцированных повышенных FoxP1 и редуцированных HB9 уровней, не влияет на экспрессию специфичного для MMC Lhx3 (Otaegi et al. 2011). Однако, специфическое воздействие miR-9 вызывает легкую редукцию в Lhx3-позитивных нейронах (Otaegi et al. 2012).
Помимо пространственной регуляции, генерация разных типов двигательных нейронов из их общего пула MN предшественников также зависит от временных качественных характеристик предшественников. Ранние предшественники дают MMC и рано зарождающиеся медиальные LMCm двигательные нейроны, что сопровождается продукцией поздно зарождающихся латеральных LMCl двигательных нейронов (Jessell 2000). Двигательные нейроны, возникающие из уникального пула предшественников, которые диверсифицируются с помощью транскрипционных факторов (Isl1, Lhx genes, OC1/Onecut1) , также как и секретируемых молекул, подобных ретиноевой кислоте (RA). RA секретируется рано зарождающимися двигательными нейронами и, как было установлено, индуцируют экспрессию специфических miRNAs, включая miR-9 (Kutty et al. 2010; Laneve et al. 2010). Как недавно было установлено miR-9 может участвовать в регуляции перехода компетентности предшественников от рано зарождающихся к поздно зарождающимся двигательным нейронам с помощью целенаправленного воздействия OC1 (Luxenhofer et al. 2014). Ингибирование miR-9 приводит к увеличению OC1-позитивной рано зародившейся популяции LMCm, напоминая паттерн взаимно исключающей экспрессии OC1 и miR-9 в спинном мозге кур (Luxenhofer et al. 2014). OC1 сохраняет экспрессию Isl1, способствуя генерации рано зарождающихся Isl1/FoxP1 дважды позитивных двигательных нейронов (Roy et al. 2012). MiR-9-обусловленная супрессия OC1 делает возможной индукцию судеб поздно зарождающихся двигательных нейронов путем освобождения от Isl1-обусловленной репрессии Lhx1. Следовательно, рано зарождающиеся двигательные нейроны оказывались редуцированными после эктопической экспрессии miR-9, тогда как доля поздно зарождающихся двигательных нейронов, позитивных по Lhx1 и Hb9 увеличивалась (Luxenhofer et al. 2014). Соответственно более высокая доля рано зарождающихся нейронов продуцируется после sponge-обусловленного подавления miR-9 (Luxenhofer et al.2014). Эти находки подчеркивают, что развитие разных субпопуляций нейронов в спинном мозге зависит от действия miRNA как в пространственном, так и временном измерении.

MicroRNAs as tools to modulate cell fate and neuronal subtype decisions in vitro


Прогресс в исследованиях стволовых клеток открыл новые пути для генерации типов нервных клеток человека (rev., e.g., Koch et al. 2009a). Разработано несколько протоколов для управления непосредственной дифференцировкой плюрипотентных стволовых клеток в определенные классы нервных клеток.Эти подходы часто базируются на использовании онтогенетических сигналов, которые, как известно, обеспечивают определенные качественные особенности нейронов в развивающейся ЦНС ( rev., e.g., Gaspard and Vanderhaeghen 2010; Petros et al. 2011; Peljto and Wichterle 2011; Tabar and Studer2014). Принимая во внимание, что miRNAs оказываются важными игроками во время спецификации подтипов нейронов in vivo , они могут быть использованы как дополнительные инструменты, чтобы модулировать выбор судеб нервных клеток in vitro (see Table 2). Это впервые было продемонстрировано Kim et al. (2007), которые сообщили о негативном влиянии miR-133b на генерацию допаминергических нейронов из S клеток мышей. Субнабор допаминергических нейронов среднего мозга дегенерирует при болезни Паркинсона и поэтому вызывает особый интерес к исследованиям нейро-регенеративных стволовых клеток (rev., e.g., Lindvall 2013; Arenas2014). MiR-133b, как было установлено, концентрируется в среднем мозга человека и истощена в выборках головного мозга у пациентов с болезнью Паркинсона (Kim et al. 2007). Более того, экспрессия miR-133b, как оказалось, индуцируется с помощью дапаминергического транскрипционного фактора Pitx3. Однако, избыточная экспрессия miR-133b во время дифференцировки ES клеток или в первичных культурах среднего мозга неожиданно нарушала генерацию Tyrosine Hydroxylase (TH)-позитивных допаминергических нейронов. В соотв. с этим, подавление miR-133b приводило к усилению допаминергической дифференцировки мышиных ES клеток. Kim et al. (2007) далее показали, что miR-133b репрессирует экспрессию Pitx3 путем прямого воздействия и поэтому было предположено, что miR-133b может регулировать созревание допаминергических нейронов в качестве части негативной обратно направленной петли вместе с Pitx3. Однако, позднее было показано, чтонокаутные miR-133b мыши обнаруживают нормальное развитие допаминергических нейронов (Heyer et al. 2012). Сходное негативное влияние на дифференцировку допаминергических нейронов из ES клеток мышей было описано для miR-132 (Yang et al. 2012). Ингибирование этой miRNA способствует дифференцировке TH-позитивных нейронов, тогда как избыточная экспрессия miR-132 оказывает противоположный эффект. Соотв. мишенью для miR-132 в этом контексте является транскрипционный фактор Nurr1, который является важным регулятором допаминергической дифференцировки. Используя TH промотором управляемый GFP репортер, авт. показали, что miR-132 концентрируется в популяции GFP-позитивных клеток, это может быть объяснено косвенно индуцируемым эффектом Nurr1 на экспрессию miR-132 (Yang et al. 2012). Nurr1, как известно, является активатором экспрессии BDNF (Volpicelli et al. 2007), тогда как сам BDNF индуцирует miR-132 (Klein et al. 2007). Благодаря этой линии доказательств, Yang et al. (2012) предположили, что miR-132 может регулировать допаминергическую дифференцировку как часть петли обратной связи с Nurr1 и BDNF. Необходимо упомянуть, что bona fide допаминергические нейроны среднего мозга характеризуются экспрессией определенного набора маркеров и транскрипционных факторов (Smidt and Burbach 2007; Ono et al. 2007). Оба исследования по влиянию miR-133b и miR-132 определяли количества TH-позитивных нейронов, которые могут оказаться недостаточными для действительной характеристики допаминергических нейонов.

Table 2 MicroRNAs impacting on in vitro dopaminergic differentiation 

miRNA        Target        Function        Cell-type        Reference
miR-133b        Pitx3        Inhibition of the generation of TH-positive neurons (no impact on DA neuron development in miR-133 knock-out mice)        Mouse ES cells        Kim et al.2007; Heyer et al.2012

miR-132        Nurr1        Inhibition of the generation of TH-positive neurons        Mouse ES cells        Yang et al.2012

miR-181a, miR-125b        -        Promotion of the generation of TH-positive neurons        Human ES cel- derived lt-NES cells        Stappert et al. 2013

miR-181a*        -        Inhibition of the generation of TH-positive neurons
DA dopaminergic, TH tyrosine hydroxylase


Using human neural stem cells to study microRNAs in a human context


Большинство находок, описанных выше, базируются на экспериментах с модельными животными и не всегда мб. перенесены на нервные клетки человека (Gao 2009). Чтобы использовать miRNAs в качестве инструментов для генерации др. типов нервных клеток, таки как кортикальные, ретинальные или моторные подтипы нейронов, обращается интерес на передачу и расширение находок протоколов дифференцировки in vitro с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека (Benchoua and Peschanski 2013). Однако, генерация зрелых типов нервных клеток из клеток hPS посредством т. наз. run-through протоколов обнаруживает склонность к вариабельности. Пролиферативные нейральные стволовые клетки (NSCs), которые могут происходить из hPS клеток, стабильные промежуточные продукты могут быть использованы, чтобы уменьшить эту вариабельность. Доступно несколько протоколов чтобы получать разные популяции NSC из клеток hPS, такие как примитивные pre-rosette нейроэпителиальные стволовые клетки (Li et al. 2011b; Reinhardt et al. 2013), формирующие розетки нейроэпителиальные стволовые клетки (Elkabetz et al. 2008; Koch et al. 2009b) и подобные радиальной глие нейральные стволовые клетки (Conti et al. 2005). Эти популяции NSC могут различаться по своей морфологии, способности к самообновлению и потенциалу дифференцировки и, скорее всего, представляют собой разные стадии развития, сходные с рядом NSCs, генерируемыми in vivo (Conti and Cattaneo 2010 and Karus et al. 2014). Интересно, что NSCs со сходными свойствами были последовательно выделены у мышей (Hitoshi et al. 2004; Elkabetz et al. 2008) и даже головного мозга человека (Tailor et al. 2013), указывая, что эти in vitro сгенерированные NSCs могут быть ценной модельной системой раннего нейрального развития. Более того, принимая во внимание, что продукция и поддержание NSC базируются на ингибировании передачи сигналов BMP/TGFβ и активации передачи сигналов Wnt и Notch помимо прочих сигналов (e.g., Borghese et al. 2010; Li et al. 2011b; Reinhardt et al. 2013), то очень возможно, что miRNAs регулируют эти пути (как обсуждалось это выше) и м. тем самым влиять на судьбы NSC. Поэтому мы и др., использующие hPS клетки для получения NSCs, чтобы впервые оценить стадио-зависимые сигнатуры miRNA во время нейрональной дифференцировки у человека, цель, которую трудно достичь из-за ограниченного доступа к первичной нервной ткани человека (Wu et al. 2007; Liu et al. 2012; Stappert et al. 2013). Идентифицированные паттерны экспрессии miRNA во многих случаях перекрываются с данными предыдущих анализов получения профилей miRNA, осуществленных на модельных грызунах, ES клетках мышей или иммортализованных линиях клеток (Sempere et al. 2004; Krichevsky et al.2006; Smith et al. 2010), это указывает на то, что многие функции miRNA могут быть законсервированы между видами.
Чтобы выявить новые функции miRNA, связанные с дифференцировкой нейронов человека, мы использовали преимущества популяции долго живущих само-обновляющихся подобных нейроэпителиальным стволовых клеток (lt-NES) разработанные в нашем институте (Koch et al. 2009b; Falk et al. 2012). Эти клетки обнаруживают обширную способность к самообновлению, будучи культивируемыми в присутствии FGF2, EGF и низких концентраций B27 в клеточных культурах, они также сохраняют стабильный потенциал нейрогенной дифференцировки. Само-обновляющиеся lt-NES клетки организуются в небольшие структуры нейральных розеток, которые характеризуются экспрессией белка плотных соединений ZO1 (TJP1) в просвете розетки (Fig. 3a-d). Они также позитивны по маркерам NSCs, таким как Nestin, SOX2 и PLZF (ZBTB16) и в соответствии с их транскрипцией профиля экспрессируемых факторов обладают качественными особенностями передней части заднего мозга. После изъятия ростового фактора, lt-NES клетки дифференцируются в нейроны, маркированные экспрессией pan-нейронального маркера β-III tubulin (Fig. 3e). После продолжительной дифференцировки они также дают астроциты, а также немного олигодендроцитов. Интересно, что клетки со сходными свойствами были недавно получены из заднего мозга эмбрионов человека, указывая, что lt-NES клетки не являются артефактом дифференцировки hPS клеток in vitro (Tailor et al. 2013). Lt-NES клетки были успешно использованы для моделирования нейродегенеративных болезней человека (Koch et al. 2011, 2012) и для скрининга и оценки фармакологических соединений (McLaren et al. 2013; Mertens et al. 2013). Lt-NES клетки пригодны для стабильных и временных miRNA модификаций и реагируют на хорошо известные связанные с нейрональными судьбами miR-124, miR-125b и miR-9/9* (Stappert et al. 2013; Roese-Koerner et al. 2013). Мы показали, что избыточная экспрессия соотв. локусов miRNA, кодирующих эти miRNAs способствует дифференцировке нейронов из lt-NES клеток. Мы также показали, что две miRNAs, образующиеся из бифункционального локуса miR-9/9* оказывают различающиеся влияния на lt-NES клетки. Индивидуальная модуляция активностей как miR-9, так и miR-9* показывает, что обе miRNAs способствуют нейрональной дифференцировке lt-NES клеток, но только miR-9*, как было установлено, ингибирует пролиферацию клеток (Roese-Koerner et al.2013). Эти находки подчеркивают даже более сложную функцию miR-9/9* внутри сетей регуляторных генов, вносящих вклад в пролиферацию и нейрональную дифференцировку. Недавно мы идентифицировали три дополнительные miRNAs, т.e., miR-153, miR-181a/a* и miR-324-5p/3p, которые способствуют дифференцировке нейронов (Stappert et al. 2013; see also Fig. 3f).

Fig. 3 Lt-NES cells can be used to study miRNA functions associated with human neuronal differentiation. (a-d) Self-renewing lt-NES cell form small neural rosettes with characteristic ZO1 expression in the lumen (b, d). They express the neural stem cell markers Nestin (b), SOX2 (c) and PLZF (d). (e) When induced to enter differentiation by growth factor withdrawal, lt-NES cells give rise to β-III tubulin-positive neurons as shown here after 7 days of differentiation. (f) The rate of neuronal differentiation can be further increased by lentivirus-mediated overexpression of neuronal fate-associated miRNAs such as miR-181a/a*. Ctr lt-NES cell cultures transduced with a control lentiviral construct coding for a scrambled miRNA. DAPI labels nuclei, all scale bars50 µm. The pictures in (c, d) were kindly provided by Johannes Jungverdorben
В отношении спецификации подтипов нейронов, мы идентифицировали две miRNAs, которые способствуют генерации допамин-подобных нейронов из lt-NES клеток (Stappert et al. 2013). Lt-NES клетки обнаруживают строгую дифференцировку, склонную к GABAergic нейронам. Однако, они не могут также давать др. фенотипы нейронов, такие как двигательные нейроны и допаминергические нейроны, когда культивируются в присутствии паттерн формирующих сигналов. Напр., культивирование lt-NES клеток в присутствии SHH и FGF8b, двух морфогенов, которые важны для спецификации допаминергических нейронов (Ye et al. 1998), приводит к генерации TH-позитивных допамин-подобных нейронов (Koch et al. 2009b; Falk et al. 2012). Более того, спецификация подтипов нейронов из дифференцирующихся lt-NES клеток может испытывать влияние со стороны специфических miRNAs (Stappert et al. 2013). Эксперименты по избыточности и недостаточности функции показали, что miR-181a и miR-125b специфически способствуют возникновению TH-позитивных допамин-подобных нейронов из lt-NES клеток. Интересно, что miR-181a* ингибирует образование этой популяции нейронов, указывая на прирожденный регуляторный механизм бифункциональных miR-181a/a* на допаминергическую дифференцировку. Это может также отражать уровни экспрессии miR-181a в противовес miR-181a*, соотношение которыъ увеличивется в среднем мозге плодов человека по сравнению с экстрактами из головного мозга плодов человека. Более того, имитируется временное высвобождение соотв. miRNA, а ингибиторы оказались достаточны, чтобы влиять на спецификацию подтипов нейронов из lt-NES клеток и это т.о. может быть использовано для усиления воздействия паттерн-формирующих сигналов. Т.о., было бы интересно комбинировать miRNA модуляции с недавно улучшенным протоколом, специфически нацеленным на эффективную генерацию допаминергических нейронов среднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека (Kriks et al. 2011; Kirkeby et al. 2012; Xi et al. 2012).
Генерация аутентичных типов нейрональных клеток, полностью напоминающая их in vivo экземпляры, всё ещё остается одной из главных задач в исследовании стволовых клеток. Для некоторых типов нейрональных клеток всё ещё неясно, какие маркеры необходимы, чтобы продемонстрировать аутентичность желаемых типов клеток. Эта проблема ещё больше усложняется тем фактом, что общее знание циркуитов регуляторных генов, вносящих вклад в диверсификацию нейронов и нейрональных функций, специфичных для трансмиттеров, существенно ограничено (rev., e.g., Ernsberger2012; Sandoe and Eggan 2013). Данные, представленные выше, демонстрируют, что miRNAs играют важные роли в регуляции нейральной дифференцировки и в обеспечении качественных характеристик нейронов и поэтому необходимо учитывать при аннотациях специфичных для подтипов нейронов маркеров профилей генной экспрессии. В этом контексте субтип-специфичные репортерные клеточные линии и анализ секвенирования РНК д. быть использованы для оценки кодируемого и не кодируемого транскриптома специфических типов нейрональных клеток по глобальной шкале.

Conclusions


Recent findings have placed miRNAs in the midst of gene regulatory networks involved in neural induction, neuronal differentiation and fate specification. MicroRNAs contribute to the establishment of transcriptional codes determining the ground-state of cellular identity. However, knowledge on the impact of miRNA-based regulation during human neural development is still limited-a gap that could be closed by the increasing availability of human neural cell types generated from human pluripotent stem cells. In this context, well-defined populations of human neural stem cells, such as lt-NES cells, could be used to study miRNAs with regard to early human neural development. As indicated by a few pioneer studies, miRNAs could be envisioned as tools to direct the differentiation of pluripotent stem cells and derived neural stem cells towards medically relevant neuronal subtypes. Each miRNA may have numerous mRNA targets and modulating a single miRNA may thus alter the entire differentiation process, making miRNA-based regulation an attractive approach for in vitro specification of neuronal cell fates. Furthermore, miRNA activity may be transiently modulated by applying synthetic miRNA mimics and inhibitors, which could be easily combined with other patterning cues. Finally, deregulation of miRNA activity is associated with many neurodegenerative diseases. Therefore, miRNAs may represent promising targets to develop novel therapeutic approaches (reviewed by, e.g., Junn and Mouradian 2012; Maciotta et al. 2013), whose potential might be evaluated using the iPS cell technology. Altogether, connecting miRNAs to specific functions during human neural development has a great value for the deeper understanding of both physiological and pathological processes in the CNS.