Биогенез микроРНК (miRNA) начинается с синтеза первичной miRNA (pri-miRNA) с помощью RNA polymerase II (1). Структура ствол-петля (stem-loop), вставленная в pri-miRNA, вырезается с помощью комплекса Microprocessor, состоящего из DROSHA и DGCR8 (2-6). Высвобожденная шпилька, наз. предшественником miRNA (pre-miRNA), экспортируется в цитоплазму с помощью Exportin 5 (XPO5) зависимым от Ran-GTPспособом (7-9). В цитоплазме pre-miRNA подвергается дальнейшему преобразованию с помощью DICER, продуцирующего дуплексную РНК из ~22 nt с их 3' концами, имеющими довесок в два нуклеотида (10-13). Дуплекс загружается на ARGONAUTE (AGO) белки и одна нить дуплекса остается как зрелая miRNA, тогда как др. нить выбрасывается с AGO (11, 14). Выбор нити обеспечивается в основном относительной термродинамической стабильностью двух концов дуплекса: нить, чьи 5' терминальные нуклеотиды оказываются менее стабильны, выбирается как зрелая miRNA (15, 16). miRNAs, происходящие с 5' и 3' нитей pre-miRNA, обозначаются как 5p и 3p miRNAs, соотв. Млекопитающие имеют 4 близко родственных AGO белка (AGO1-4), которые взаимодействуют с факторами деаденилирования и аппаратом трансляции, чтобы индуцировать деградацию мРНК и репрессию трансляции.
Хотя упомянутый выше канонический путь объясняет продукцию большинства miRNAs (1),было установлено, что существуют альтернативные (неканонические) пути биогенеза miRNA, которые пропускают часть ступеней биогенеза, упомянутых выше. Mirtrons являются первой группой miRNA, описанных как неканонические miRNAs, которые не нуждаются в DROSHA для своей продукции (17-19). Поскольку mirtrons располагаются внутри коротких интронов генов хозяев, а их концы часто конкурируют за сайты сплайсинга, пи этом вырезанные (spliced-out) интроны могут служить в качестве pre-miRNAs и подвергаться преобразованию с помощью DICER. Функциональные miRNA могут также возникать из малых ядрышковых РНК, ACA45,зависимым от DICER, но не от DROSHA образом (20). Более того, эндогенные endogenous siRNAs (endo-siRNAs), которые не нуждаются в DROSHA, но зависят от DICER, были идентифицированы в соматических тканях (21). Др. группа, наз."5' capped pre-miRNAs", включающая miR-320 и miR-484 , была идентифицирована недавно (22). pre-miRNA содержит 7-methylguanosine шапочку поскольку её 5' конец генерируется непосредственно при транскрипции. 3' конец у 5' capped miRNA, как полагают, предопределяется с помощью завершения транскрипции.
Из-за независимого от DICER созревания, miR-451 является единственным известным примером, продуцируемым без DICER (23-25). Из-за своей короткой длины, pre-miR-451 не расщепляется с помощью DICER, а вместо этого непосредственно инкорпорируется на AGO2. Pre-miR-451 расщепляется с помощью AGO2 в середине 3' нити и далее подстригается с помощью 3'-5' экзорибонуклеазы PARN, чтобы создать зоелую форму miR-451 (26).
Ступень экспорта из ядра обеспечивается с помощью XPO5, но она не были исследована столь активно как др. ступени созревания. Недавнее исследование показало, что семейство miR-320 нуждается в Exportin 1 (XPO1) вместо XPO5, поскольку эти pre-miRNAs имеют шапочку (которая распознается с помощью XPO1 посредством адапторной молекулы PHAX) вместо обычного 5' монофосфата (22). Остается неизвестным, какая часть miRNAs зависит от (или не зависит от) XPO5 поскольку более ранние исследования XPO5 исследовали индивидуальные miRNAs без использования транскриптомного подхода. Более того, нокаут XPO5 ещё не производился. Поэтому неизвестно, насколько важен XPO5 для биогенеза miRNA и существуют ли дополнительные альтернативные пути экспорта pre-miRNA.
В данном исследовании мы использовали технику геномного инженеринга для вызова нокаута DROSHA, XPO5 и DICER в одно и той же клеточной линии. Путем анализа и сравнения профилей экспрессии miRNA с помощью глубокого секвенирования ключевых факторов биогенеза, пришли к открытию неожиданных альтернативных механизмов и ранее неидентифицированных неканонических miRNAs.
Discussion
Наше исследование предоставило ценные ресурсы для изучения miRNA. С помощью анализа небольшой популяции РНК в этих нокаутных клетках, мы оценили современную догматическую модель канонического пути miRNA. Устранение DROSHA и DICER приводило к истощению 96.5% и 96% определяемых видов miRNA с помощью ≥ 0.1-fold (knockout/parental), соотв. (Fig. 2E). Мы также подтвердили вклад XPO5 в большинство miRNAs: 75.5% обнаруженных видов miRNA были снижены ≥ 0.5-fold.
Оказалось неожиданным, однако, то, что после нокаута XPO5 снижение оказалось значительно более умеренным, чем ожидалось: лишь 29% miRNAs было снижено ≥ 0.1-fold. Следовательно, DROSHA и DICER в самом деле являются кртическими для канонического биогенеза miRNA, тогда как XPO5 не является обязательным фактором и может быть замещен др. потенциально множественными механизмами. Т.о., потребность в XPO5 не может быть надежным классификатором для miRNA.
Это первое исследование нокаута XPO5. В предыдущем исследовании, где XPO5 был идентифицирован как фактор фактор экспорта в ядро pre-miRNA, заключение базировалось на методе связывания, экспериментах нокдауна и детекции let-7a-5p (9). Мы установили, что let-7a-5p является одной из наиболее чувствительных miRNAs к устранению XPO5 [0.027-fold снижение (knockout/parental) (Dataset S1)]. В др. исследовании функция XPO5 была исследована с помощью измерения уровня эктопически экспрессируемой miRNA в клетках с нокдауном XPO5 (7). Наш современный глобальный анализ с использованием нокаутных по XPO5 клеток подтвердил участие XPO5 в пути miRNA, но в то же самое время показал, что XPO5 не является существенным фактором для биогенеза miRNA, по крайней мере, ы HCT116 клетках. Недавно было сообщено, что генетический дефект в XPO5 снижает продукцию зрелых miRNAs (38). Гетерозиготная мутация приводит к C-терминальному укорочению белка XPO5в субнаборе раковых клеточных линий. С помощью повторного анализа данных микромассивов из этого исследования мы установили, что значительные количества miRNAs всё ещё экспрессировались в клетках с укороченным XPO5 (38). Т.о., укорачивающая мутация может оказывать ограниченный эффект на miRNAs, хотя умеренного снижения может быть всё ещё достаточно, чтобы повлиять на физиологию рака.
Базируясь на результатах этого и предыдущих исследований, мы можем подразделить miRNAs на 6 групп (Fig. 6, modified from ref. 1). Большинство miRNAs классифицируется как группа 1 miRNAs, для биогенеза которых необходимы DROSHA и DICER. С др. стороны, дополнительные ступени процессинга или модифицированный путь биогенеза используются др. не каноническими miRNAs (groups 2 - 6).Продукция miRNAs группы 2 нуждается в monouridylation pre-miRNAs для их эффективного процессинга с помощью DICER, поскольку эти pre-miRNAs имеют короткий (1 nt) 3' довесок (39). Большинство членов let-7 позвоночных и miR-105 принадлежат к группе 2. Группа 3 miRNAs происходит из 5' capped pre-miRNAs, которые не нуждаются в DROSHA для своей продукции (22). В данном исследовании мы идентифицировали две дополнительные не каноническиеl miRNAs, которые могут принадлежать к группе 3 (miR-3615 и miR-7706). Их последовательности законсервированы только у приматов, т.е. эти miRNAs могли возникнуть недавно. Группа 4 включает miR-451a, короткую шпилечную miRNA, которая не нуждается в ступени расщепления с помощью DICER во время своего биогенеза (23-25). Группа 5 состоит из mirtrons, которые продуцируются из интронов, подвергшихся сплайсингу, вместо DROSHA-обеспечиваемого процессинга (17-19). Наконец, miRNAs , которые преобразуются из структурированных некодирующих РНК с помощью DICER, могут быть отнесены к группе 6 miRNAs (1). Наши данные подтверждают, что miR-1254-5p может принадлежать группе 6, т.е. она, по-видимому, продуцируется из Alu-происходящей длинной stem-loop и непосредственно расщепляется с помощью DICER. В соответствии с предыдущими сообщениями, неканонические miRNAs из групп 3-6, найденные в данном исследовании, в целом редки и плохо законсервированы, за исключением семейства miR-320 (законсервированного у позвоночных) и miR-484 (законсервированного у млекопитающих).
