Посещений:
ГРАДИЕНТЫ МОРФОГЕНА



Масштабируемость формируемого паттерна

Scaling of pattern formations and morphogen gradients
Hidehiko Inomata
Dev., Growth and Diff. Volume 59, Issue 1 January 2017 Pages 41-51

The concentration gradient of morphogens provides positional information for an embryo and plays a pivotal role in pattern formation of tissues during the developmental processes. Morphogen-dependent pattern formations show robustness despite various perturbations. Although tissues usually grow and dynamically change their size during histogenesis, proper patterns are formed without the influence of size variations. Furthermore, even when the blastula embryo of Xenopus laevis is bisected into dorsal and ventral halves, the dorsal half of the embryo leads to proportionally patterned half-sized embryos. This robustness of pattern formation despite size variations is termed as scaling. In this review, I focused on the morphogen-dependent dorsal-ventral axis formation in Xenopus and described how morphogens form a proper gradient shape according to the embryo size.


Рисунки к статье

Во время эмбриогенеза эмбрион генерирует множество разных типов тканей и органов. Чтобы воспроизводимо конструировать образцы тканей у эмбрионов, индивидуальные эмбриональные клетки должны общаться др. с др. Эти межклеточные коммуникации подразделяются на два типа: коротко- и дальнодействующая сигнальная трансдукция (Fig. 1). Передача сигналов Notch, это представитель короткодействующей передачи сигналов, вносит вклад в дифференцировку, пролиферацию клеток и гибель клеток. Трансмембранные Notch рецепторы непосредственно взаимодействуют с трансмембранным лигандом Delta или Jagged, которые экспрессируются на соседних клетках, приводя к выделению Notch intracellular domain (NICD) и активации генов мишеней для Notch (Andersson et al. 2011; Ranganathan et al. 2011) (Fig. 1A). Путь Notch регулирует короткодействующее формирование паттерна. Напр., рисунок типа соль и перец волосковых клеток во внутреннем ухе регулируется с помощью латеральной ингибиции, обеспечиваемой с помощью передачи сигналов Notch (Kiernan et al. 2005; Chrysostomou et al. 2012; Kiernan 2013). Более того, латеральное ингибирование передачи сигналов Notch репрессирует дифференцировку нейронов (Shimojo et al. 2011; Formosa-Jordan et al. 2013). Напротив, морфогены, которые диффундируют широко во внеклеточном пространстве, действуют как дальнодействующая передача сигналов и играют решающую роль в формировании паттерна разных тканей (Fig. 1B). In this review, I will explain the morphogen-dependent pattern formation using the dorsal-ventral (D-V) axis formation with Xenopus laevis as the model and will discuss how morphogens form a proper gradient shape according to the embryo size.

Figure 1. Schematic of short-range and long-rage signal transduction.

Morphogen-dependent D-V axis formation


Базовый принцип градиента морфогена описан Wolpert в 1969 как модель французского флага. В этой модели морфоген секретируется из локального источника клеток и передается диффузно во внеклеточном пространстве, формируя концентрационный градиент в эмбрионе (Fig. 1B). Этот градиент заставляет клетки экспрессировать разные гены мишени, в соответствии с порогами концентрации (T1 и T2 на Fig. 1B) и индуцирует три разных типа ткани, подобно рисунку французского флага (blue, white и red cells inклетки на Fig. 1B). Следовательно, градиент морфогена предоставляет позиционную информацию эмбриону зависимым от концентрации способом.
Если градиент морфогена динамически меняет свою форму, то будет трудно сформировать соотв. паттерны в эмбрионе. Следовательно, д. поддерживаться стабильный градиент во время эмбриогенез. Поскольку прекращение синтеза морфогена клетками источником будет приводить к униформному распределению морфогена, то необходима постоянная его продукция. Однако, непрерывный синтез морфогена в закрытом пространстве, таком как эмбрион и ткань, будет вызывать постоянное увеличение концентрации морфогена. В 1970, Crick предложил модель источник-слив (source-sink), согласно которой морфогены, продуцируемые клетками источника свободно диффундируют в эмбрионе и деградируют в локальном сливе, расположенном на противоположном от источника конце, приводя к возникновению линейного стабильного градиента. Морфогены, как известно сегодня, образуют стабильный градиент в отсутствие локального слива. Напр., если морфоген деградирует в целом эмбрионе, то стабильный градиент возникает в результате баланса между синтезом и деградацией. Следовательно, форма градиента морфогена в основном регулируется тремя факторами синтезом-диффузией-деградацией (Fig. 1B). Градиент морфогена может быть математически представлен с использованием reaction-diffusion модели, которая представлена комбинацией термина реакция (синтез и деградация морфогена) и термина диффузия (диффузия морфогена) (Turing 1952; Gierer & Meinhardt 1972; Wartlick et al. 2009; Meinhardt 2015).
Скорость диффузии секретируемых белков отличается в зависимости от свойств молекул (Kicheva et al. 2012; Muller et al. 2013). В простейшем случае диффузии, морфогены, такие как fibroblast growth factor 8 (Fgf8) у рыбок данио, свободно диффундируют во внеклеточном пространстве благодаря Броуновскому движению (Yu et al. 2009). С другой стороны, морфогены непосредственно соединяются с внеклеточным матриксом. Секретируемый белок Noggin соединяется с heparin sulfate proteoglycans (HSPGs) посредством heparin-связывающего домена, снижая скорость диффузии (Groppe et al. 2002; Paine-Saunders et al. 2002; Inomata et al. 2013). HSPGs взаимодействуют также с разными молекулами морфогенов, такими как Wnt и Fgf, и регулируют их биологические активности (Reichsman et al. 1996; Hacker et al. 1997; Lin & Perrimon 2000; Matsuo & Kimura-Yoshida 2013). Поэтому возможно, что частота взаимодействия морфогена и внеклеточного матрикса и определяет скорость диффузии морфогена in vivo. Помимо диффузии во внеклеточном пространстве, предложены две разные модели базирующегося на клетках транспорта морфогенов: модель трансцитоза и модель цитонем (Williams et al. 2004; Muller et al. 2013). В модели трансцитоза клетки, потребляют морфоген посредством эндоцитоза и высвобождают его посредством экзоцитоза. Путем повторения этих ступеней морфоген постепенно распространяется в онтогенетическом поле и формирует концентрационный градиент (Dierick & Bejsovec 1998; Kruse et al. 2004; Bollenbach et al. 2007; Gallet et al. 2008; Chang & Sun 2014). В цитонемной модели морфоген транспортируется c помощью филоподия-подобных структур, наз. цитонемами (Ramirez-Weber & Kornberg 1999, 2000; Sato & Kornberg 2002; Hsiung et al. 2005; Kornberg 2012, 2014; Roy et al. 2014; Stanganello & Scholpp 2016). Напр., перемещение hedgehog (Hh) в крыловом диске и абдоминальном эпидермисе Drosophila , скорее всего, регулируется c помощью цитонем (Bischoff et al. 2013). В соответствии с этой идеей, супрессия образования цитонем сужает длину градиента Hh. Однако, неясно, как эти разные способы диффузии морфогена или транспорта собственно используются во время процессов развития.
Формирование D-V оси у Xenopus также вызывается c помощью различных секретируемых белков (De Robertis et al. 2000; De Robertis & Kuroda 2004). Инициация формирования оси D-V начинается с оплодотворения, запускающего образование кортикальных микротрубочек и ротацию кортекса яйцеклетки (cortical rotation) (Fig. 2A). Материнские дорсальные детерминанты также движутся от вегетативного полюса к проспективному дорсальному региону, который располагается на противоположной стороне от места проникновения спермия (De Robertis et al. 2000; Weaver & Kimelman 2004). Здесь он локально стабилизирует β -catenin. Затем β-catenin индуцирует организатор, который действует как источник клеток для дорсализующих факторов, таких как Chordin (Chd) (Fig. 2B) (Heasman et al. 1994, 2000; Larabell et al. 1997). Локально синтезированные Chordin белки диффундируют во внеклеточное пространство и формируют концентрационный градиент в эмбрионе: на дорсальной стороне (high Chordin) и на вентральной (low Chordin) (Sasai et al. 1994, 1995; De Robertis & Sasai 1996; Piccolo et al. 1996). Напротив, 4 основных лиганда BMPs (BMP2/4/7 и ADMP) экспрессируются во всем эмбрионе и вентрализуют эмбрион посредством BMP рецепторов (Reversade & De Robertis 2005; Reversade et al. 2005). BMP рецепторы состоят из type I рецепторов и постоянно активных type II рецепторов. Эти рецепторы формируют гетеротетрамерные комплексы путем связывания BMP лигандов (Moustakas & Heldin 2009; Heldin & Moustakas 2016). Образование комплексов вызывает активацию type I рецепторов посредством type II рецепторов и фосфорилирует нижестоящие мишени R-Smads (Smad1/5/8). Фосфорилированные R-Smads затем образуют комплексы с Co-Smad (Smad4) и регулируют транскрипцию генов мишеней для BMP (Massague 2000). BMP4 и BMP7 в основном экспрессируются в вентральном регионе, тогда как BMP2 и ADMP экспрессируются в дорсальном регионе (Inomata et al. 2008). Chordin непосредственно взаимодействует с этими BMPs и усиливает дорсализацию путем препятствования взаимодействию между BMPs и BMP рецепторами (Fig. 2B) (Piccolo et al. 1996). Градиент Chordin индуцирует три разных типа тканей вдоль D-V оси, в соответствии с порогом концентрации Chordin (T1 и T2 на Fig. 3A): dorsal (D; high Chordin), lateral (L; middle Chordin) и ventral (V; low Chordin) регион (Inomata et al. 2013).

Figure 2. Molecular mechanism of dorsal-ventral axis formation.

Figure 3. Chordin-dependent dorsal-ventral axis formation.

Деградация морфогена играет важную роль в образовании стабильного градиента (Fig. 1B). Chordin-специфические цинк металлопротеиназы, такие как BMP1 и Xolloid-related (Xlr), расщепляют Chordin по специфическим сайтам, погашая способность связывать BMP и дорсализующую активность хордина (Fig. 2B) (Piccolo et al. 1997). Однако предыдущее исследование описало возможность, что расщепленный Chordin (cysteine-rich domain 1) сохраняет дорсализующую активность, но приводит к меньшей активности по сравнению с Chordin полной длины (Larrain et al. 2000). Экспрессия bmp1 в основном обнаруживается в дорсальном регионе, тогда как xlr экспрессируется в передней и вентральной задней части мезодермы на стадии средины гаструлы (Inomata et al. 2008). Более того, Sizzled участвует в деградации Chordin (Salic et al. 1997; Collavin & Kirschner 2003; Lee et al. 2006; Muraoka et al. 2006). Экспрессия Sizzled обнаруживается в вентральном регионе, поскольку его экспрессия усиливается c помощью факторов вентрализации BMPs (Fig. 2B). Sizzled непосредственно соединяется с Chordin-специфической металлопротеиназой и ингибирует её протеазную активность (Fig. 2B). Хотя Sizzled является секретируемым членом семейства Frizzled-related protein (sFRP) (антагонистов Wnt), он неспособен супрессировать каноническую передачу сигналов Wnt.

Scaling of morphogen gradients


Помимо трех факторов (synthesis-diffusion-degradation), размер эмбриона также имеет большое значение для становления градиента морфогена. Даже если образуется стабильный градиент в эмбрионе, изменения размера эмбриона нарушают формирование паттерна. Напр., если размер эмбриона составляет половину от крупного эмбриона, то не образуются соотв. пропорциональные паттерны; эмбрион занимает избыточный дорсальный регион (D), а вентральный регион (V) будет отсутствовать (Fig. 3B). Следовательно, размер эмбриона д. строго контролироваться. Однако, диаметр яиц Xenopus варьирует в размере от приблизительно 1.0 до ~ 1.5 mm. Однако, несмотря на изменчивость размера эмбрионы обнаруживают неотличимые по масштабу паттерны (Inomata et al. 2013). Более того, если эмбрион Xenopus на ст. бластулы разрезать на дорсальную и вентральную половины, то вентральная половина формирует кусок живота, представленный только вентральной тканью. Однако дорсальная половина развивается в пропорционально сформированный эмбрион половинного размера (Reversade & De Robertis 2005; De Robertis 2006; Inomata et al. 2013). Эти наблюдения показывают, что локальные паттерны, такие как глаза и сомиты увеличиваются или уменьшаются в соответствии размера эмбриона. Такая помехоустойчивость формирования паттерна несмотря на изменение размера называется масштабируемость (scaling).
Система масштабирования наблюдается и у др. видов животных, включая мышей и дрозофил (Tam 1981; Lauschke et al. 2013). У эмбрионов Drosophila мРНК bicoid расплагается на переднем полюсе и формирует концентрационный градиент белка bicoid в синцитии (Driever & Nusslein-Volhard 1988a,b). Этот градиент bicoid индуцирует нижестоящие gap гены, такие как orthodenticle, hunchback, и krüppel, приводя к образованию передне-задней оси (A-P) (Ephrussi & St Johnston 2004; Porcher & Dostatni 2010). Распределение белков bicoid и экспрессия gap генов вдоль A-P оси масштабируется в зависимости от размера эмбриона (Gregor et al. 2005, 2007; Cheung et al. 2011, 2014; Wu et al. 2015).
Какого типа взаимоотношения между градиентом морфогена и размером эмбриона необходимы для поддержания масшабируемости? Теоретически, зависимые от размера изменения в форме градиента необходимы для сходного формирования паттерна тканей. Крупные эмбрионы формируют пологие градиенты и широкие паттерны, тогда как крутые градиенты индуцируют узкие паттерны у маленьких эмбрионов (Fig. 3A,C). Однако, способ, c помощью которого геометрическая информация регулирует форму градиента, изучен недостаточно.

Chordin/Sizzled-dependent scaling model


Мы недавно сообщали о молекулярном механизме масштабирования у рассеченных эмбрионов Xenopus (Inomata et al. 2013). Дорсальная половина эмбриона д. формировать градиент Chordin, соответствующий размеру эмбриона c помощью регуляции трех факторов, synthesis-diffusion-degradation. Однако, если три фактора динамически изменяют свои значения, то довольно трудно анализировать систему масштабирования. Чтобы устранить эту сложность, мы искусственно создавали клетки источники, которые синтезировали постоянные количества белка Chordin не изменяя размер эмбриона или активность BMP (метод восстановления D-V оси). Во-первых, эмбрионам инъецировали β-catenin-MO и chordin/noggin-MO (β CN-MO), чтобы элиминировать клетки источники (организатор) и экспрессию эндогенных дорсализующих факторов, соотв. (Fig. 4) (Heasman et al. 2000; Oelgeschlager et al. 2003a). Затем, используя этих полностью вентрализованных эмбрионов, лишенных градиента, мы локально инъецировали мРНК chordin , чтобы создать экзогенный градиент Chordin у эмбрионов. Это приводит к формированию трех отличающихся регионов, dorsal (D), lateral (L) и ventral (V) егионов, как и у контрольных эмбрионов. Если величина продукции белка Chordin увеличивалась c помощью инъекции в 4-кратной дозы мРНК, то эмбрионы демонстрировали умеренные изменения в формировании D-V оси. Следовательно, форма градиента Chordin, по-видимому, в основном регулируется за счет деградации.

Figure 4. D-V axis reconstitution assay.

Далее мы сфокусировались на ассоциации между Chordin и Sizzled, которая контролирует стабильность белка Chordin (Fig. 2B). Чтобы проверить скорость диффузии использовали методы fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) или fluorescence correlation spectroscopy (FCS) и установили, что Chordin и Sizzled, также как и секреторная форма mEGFP, быстро диффундируют. Напротив, скорости деградации каждого из белков сильно отличаются. Белок Sizzled был стабильным у эмбрионов, тогда как белок Chordin (26.7 fmol per embryo) деградировал очень быстро с периодом полу-жизни приблизительно в 30 мин. Такая нестабильность белка Chordin полностью блокировалась при избыточном количестве Sizzled, указывая, что большая часть деградации Chordin зависит от metalloproteases BMP1 и Xlr. Более того, градиент Chordin динамичеки изменяет свою форму с крутого на уплощенный в зависимости от концентрации Sizzled, даже когда скорость продукции Chordin фиксируется c помощью метода восстановления D-V оси. Эти результаты показывают, что форма градиента Chordin в основном регулируется за счет деградации, чья скорость зависит от количества белка Sizzled.
Исходя из экпериментальных наблюдений, мы предложили модель Chordin/Sizzled-зависимого масштабирования. До гаструляции bmps и его ген мишень sizzled экспрессируются по всему эмбриону (Fig. 5A). Однако, когда организатор (клетки источника) формируется локально у эмбриона на ранней ст. гаструлы, то синтезируемый Chordin распространяется посредством диффузии во внеклеточное пространство и постепенно супрессирует область экспрессии sizzled, ингибируя активность BMPs (Fig. 5A). Во время этого процесса белок Sizzled постепенно накапливается в эмбрионе благодаря его низкой скорости деградации (Fig. 5B). В сложившихся обстоятельствах дорсальная часть эмбриона, область экспрессии sizzled, быстро супрессируется c помощью диффузии Chordin (Fig. 5A; bottom). Накопление Sizzled становится ниже, чем у контрольных эмбрионов (Fig. 5B; bottom). В этой дорсальной половине эмбриона с низким уровнем Sizzled, деградация Chordin увеличивается и формируется круто падающий градиент, подходящий для маленького эмбриона (Fig. 5C).

Figure 5. Chordin/Sizzled-dependent scaling model.

В этой модели масштабирования мы полагаем, что размер эмбриона регулирует стабильность белка Chordin путем накопления белка Sizzled. Чтобы проверить эту возможность фиксировали продукцию Chordin, используя метод восстановления D-V оси, а размер эмбриона искусственно изменяли путем разрезания. Несмотря на фиксированную продукцию отмечалось уменьшение белка Chordin у разделенных на две части эмбрионов. В соответствии с моделью Chordin/Sizzled-зависимого масштабирования эти изменения в стабильности белка Chordin исчезали, если взывали истощение Sizzled c помощью morpholino. Более того, мы сконструировали математическую модель, базирующуюся на этих экспериментальных результатах: (i) идентичная скорость диффузии Chordin и Sizzled; (ii) более низка скорость деградации Sizzled, чем Chordin; (iii) Sizzled-зависимая регуляция деградации Chordin; и (iv) супрессия области экспрессии Sizzled за счет диффузии Chordin. На этой математической модели мы подтвердили, что имеются отличающиеся регионы, дорсальный, латеральный и вентральный, которые масштабируются, исходя из размера эмбриона посредством накопления Sizzled.

Expansion-Repression (Ex-R) model


Несколько математических моделей было предложено для масштабирования градиента морфогена (Ben-Zvi et al. 2011). Здесь мы рассмотрим привлекательную Ex-R модель, представленную Ben-Zvi et al. (Ben-Zvi & Barkai 2010). В этой модели предполагается наличие двух молекул, морфогена и expander. Морфоген индуцирует разные ткани зависимым от концентрации способом (Fig. 1B). Напротив, для необходимы три свойства, чтобы создавать масштабируемую систему. Во-первых, expander расширяет распределение морфогена (правило 1). Напр., the expander непосредственно соединяется с морфогеном и расширяет его распространение (Mii & Taira 2009). Более того, expander может также расширять распределение морфогена путем блокирования его деградации. Во-вторых, expander является стабильным и эффективно диффундирует у эмбриона (правило 2). В-третьих, экспрессия expander супрессируется c помощью морфогена (rule 3).
Сравнение Ex-R модели и Chordin/Sizzled-dзависимой модели масштабирования показало, что Chordin и Sizzled находятся в хорошем соответствии с представлением о морфогене и expander, соотв.. Sizzled расширяет градиент Chordin путем супрессии деградации Chordin (правило 1). Наши экспериментальные результаты показали, что белок Sizzled стабилен и образует пологий градиент (правило 2). Более того, диффузия Chordin постепенно супрессирует область экспрессии sizzled во время гаструляции (правило 3). Поскольку эти две модели обладают многими общими свойствами, то дальнейший прогресс в математическом анализе может помочь понять общий механизм системы масштабирования.
Ben-Zvi сообщает, что ADMP и BMP4/7 действуют как expander и морфоген, соотв., во время формирования у Xenopus D-V оси (Ben-Zvi et al. 2008). Следующие три предположения необходимы для становления модели Ex-R : (i) деградация Chordin облегчается, когда Chordin образует комплекс с BMPs; (ii) Chordin преимущественно соединяется с BMP4/7 по сравнению ADMP; и (iii) относительная диффузия BMPs усиливается, когда BMPs формируют комплекс с Chordin. Т.к. относительно первого предположения это остается неуловимым, действительно ли происходит зависимая от BMP лиганда деградация Chordin у Xenopus. У Drosophila комплекс Sog (гомолог Xenopus Chordin)/Dpp (гомолог Xenopus BMP) облегчает деградацию Sog (Marques et al. 1997; Shimmi & O'connor 2003). Однако, у Xenopus, свободный Chordin эффективно деградирует без лигандов BMP in vitro (Piccolo et al. 1997; Inomata et al. 2008). Более того, мы установили, что истощение всех BMPs (BMP2/4/7 и ADMP) усиливает деградацию Chordin in vivo скорее, чем супресструет, как ожидалось согласно первому предположению (Inomata et al. 2013). Этот результат согласуется с моделью Chordin/Sizzled-зависимого масштабирования, где деградация Chordin регулируется c помощью концентрации Sizzled; поскольку эмбрионы с истощенными BMPs не могут экспрессировать свой ген мишень sizzled, то деградация Chordin строго усиливается. Хотя эти результаты подтверждают модель Chordin/Sizzled-зависимого масштабирования, и д. гены кандидаты участвуют в деградации Chordin, таие как xTsg и ONT1, они могут вносить вклад в систему ADMP-зависимого масштабирования (Oelgeschlager et al. 2000, 2003b; Inomata et al. 2008). Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы понять, действительно ли Sizzled- и ADMP-зависимая система двойного масштабирования вносит вклад в формирование D-V оси (Ben-Zvi et al. 2014).

Perspective


Morphogen in growing and deforming tissues


В ходе формирования у Xenopus D-V оси и у Drosophila формирования A-P оси, не обнаруживаются очевидные изменения в росте и размере эмбрионов. Следовательно, эти экспериментальные системы не подходят для изучения масштабирования. Напротив, многие ткани растут и динамически изменяются в своих размерах во время формирования паттерна. Однако, способ, c помощью которого градиент морфогена может соотв. образом масштабироваться, чтобы растущая ткань оставалась, предстоит определить. Крыловые имагинальные диски Drosophila драматически увеличиваются в размере и имеется в них градиент Dpp, который вносит вклад в формирование A-P оси крыла. Если размер диска искусственно изменен c помощью активной или доминантной негативной формы PI3-киназы, pMAD (phosphorylated form of MAD), которая фосфорилируется c помощью Dpp, то наблюдается соотв. масштабирование с изменением размера крыла (Teleman & Cohen 2000). Более того, градиент Dpp, как известно, контролирует не только формирование паттерна, но и также рост крылового имагинального диска. Мутантный Dpp крыловой диск неспособен расти, а эктопическая экспрессия Dpp вызыает образование эктопического крыла (Zecca et al. 1995). Следовательно, клеточная пролиферация д. строго зависеть от градиента Dpp; тогда скорость пролиферации в регионе с высоким уровнем Dpp д. быть быстрее, чем в регионе с низким уровнем Dpp. Однако, наблюдается униформная пролиферация в крыловом диске. Как же градиент Dpp обеспечивает униформную пролиферацию клеток? Предложены две разные модели контроля Dpp-зависимого роста в крыловом диске. в модели temporal rule, клетки ощущают временные изменения в уровнях передачи сигналов Dpp и при 50% увеличении уровня Dpp, они управляют клеточными делениями (Wartlick et al. 2011). Фактически увеличение концентрации Dpp, наблюдаемое в растущем крыловом диске, использует функциональный GFP-Dpp (green fluorescence protein (GFP)-tagged Dpp). Напротив, модель, уравнивания роста указывает на то, что Dpp вносит вклад только в рост центрального региона, тогда как пролиферация латеральных клеток не зависит от Dpp. Чтобы исследовать эту модель был использован новый morphotrap подход, чтобы манипулировать с градиентом Dpp в крыловом диске (Harmansa et al. 2015). Morphotrap - это трансмембранный белок, обладающий одиночным доменом nanobody против GFP во внеклеточном регионе. Следовательно, morphotrap закрепляет GFP-Dpp на клеточной мембране, это подавляет свободную диффузию GFP-Dpp во внеклеточном пространстве. Когда блокируется образование GFP-Dpp градиента c помощью экспрессии morphotrap (GFP-Dpp накапливается в центральном регионе крыла), не наблюдается никаких изменений в униформной пролиферации, подтверждая модель уравнивания (equalization) роста.
Помимо роста онтогенетическое поле, как известно, динамически меняет свою форму. Напр., во время гаструляции у Xenopus, конвергентное удлинение (convergent extension) динамически меняет форму дорсальной ткани, включая организатор (source cells) (Wallingford et al. 2002; Tada & Heisenberg 2012). Хотя эти клеточные перемещения д. сильно нарушать форму градиента, паттерны тканей оказываются устойчивыми к позиционным шумам. Одним из пионерских исследований стало использование toto imaging анализа у рыбокданио (Xiong et al. 2013). У позвоночных вентро-дорсальный градиент Sonic Hedgehog (Shh) важен для формирования D-V оси в нервной трубке (Dessaud et al. 2008). Однако, Shh-продуцирующие клетки динамично меняют свою форму и паттерны экспрессии во время образования нервной трубки, приводя к пространственной гетерогенности передачи сигналов Shh и к смешанным паттернам. Интересно, что cadherin-зависимая сортировка клеток корректирует эти неправильные паттерны и образует четкие границы. Необходимо определить, как градиенты морфогена и тканевые паттерны собственно формируются в растущем и деформирующемся онтогенетическом поле.

Simplification and regulation of the developmental system


В целом система развития слишком сложна для проверки гипотетических моделей. Один способ избежать этой проблемы заключается в упрощении системы развития и реконструкции искусственных онтогенетических полей, позволяющих верификацию модели. Мы использовали подход восстановления D-V оси, чтобы исключить влияние передачи сигналов Wnt (блокирование его нижестоящей мишени c помощью β -catenin-MO) и фиксировать скорость продукции белка Chordin (Inomata et al. 2013). Используя этот метод, мы исследовали зависимую от размера стабильность белка Chordin. Ту же самую стратегию использовали и в др. исследованиях. Напр., для оценки формирования паттерна мезодермы у мышей и масштабирования сегментов, авт. разработали метод ex vivo культивирования первичных клеток (Lauschke et al. 2013). Используя этот новый метод, они получили в реальном времени изображения передачи сигналов Notch в разной длины монослое из клеток пресомитной мезодермы (mPSM), чтобы проверитьих математическую модель.
С др. стороны, искусственный контроль параметров также необходим для верификации модели. В целом форма морфогенетического градиента регулируется c помощью трех факторов synthesis-diffusion-degradation. Следовательно, разработка экспериментальных систем, способных к искусственной регуляции этих трех факторов д. быть пригодна для верификации гипотетической модели. Существует много методов регуляции белкового синтеза, такие как системы Tet-On и Tet-Off (Gossen & Bujard 1992). Более того, путем постановки генов мишеней под контроль хитшокового промотора, возможно будет регулировать продукцию белка, используя лазер инфракрасного диапазона (infrared laser-evoked gene operator [IR-LEGO]) (Kamei et al. 2009). Для контроля над скоростью диффузии в некоторых исследованиях попытались искусственно снизить скорость диффузии, напр., методом morphotrap (Harmansa et al. 2015). Комбинация упрощенных онтогенетических систем и искусственно регулируемых параметров, по-видимому, позволят понять зависимое от морфогена формирование паттерна. v

Collapse of scaling and diversity of shape


Значение системы масштабирования в обеспечении устойчивости формирования паттерна несмотря на вариации размера. Эмбрионы Xenopus обнаруживают удивительное сходство независимо от размера. Однако, у некоторых насекомых, таких как муравьи и жук-рогач, образуются разные формы в зависимости от размера эмбриона. В случае Pheidole instabilis, типа муравья, голова и челюсти становятся непропорционально большими при увеличенном размере личинки, результат возникают муравьи солдаты. Напротив, при маленькой личинке муравьи становятся рабочими с маленькой головой. Этот феномен может указывать на коллапс системы масштабирования. В соответствии с этой идеей искусственное изменение концентрации Sizzled может давать эмбрионов с разным соотношением структур. D-V (Inomata et al. 2013).