Посещений:
МИЕЛИНИЗАЦИЯ



Роль кинезина Kif13b и каркасного белка Dlg1

Kif13b Regulates PNS and CNS Myelination through the Dlg1 Scaffold
Roberta Noseda, Marta Guerrero-Valero, Valeria Alberizzi,et al.
PLOS • Published: April 12, 2016 • http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002440

In Schwann cells, the Discs large 1 (Dlg1) protein is a known brake of myelination, which negatively regulates the amount of myelin produced so that myelin thickness is proportional to axonal diameter. In this paper, we report that in Schwann cells Dlg1 itself is tightly regulated to ensure proper myelination. We propose that Dlg1 function is further controlled by the Kif13b kinesin motor protein, which acts as a "brake of the brake" by downregulating Dlg1 activity. Surprisingly, we found that in oligodendrocytes Dlg1 is a positive and not a negative regulator of myelination. Thus, Kif13b-mediated negative regulation of Dlg1 ensures appropriate myelin production and thickness in the central nervous system. Our data further extend recently emerged unconventional roles for kinesins, which are usually implicated in cargo transport rather than in the modulation of signaling pathways. The elucidation of mechanisms regulating myelination may help to design specific approaches to favor re-myelination in demyelinating disorders in which this process is severely impaired.
Миелинизация - это многоступенчатый процесс, включающий распознавание и контакт с аксоном, покрытие оболочкой и биогенез миелина. В этом процессе отличающиеся наборы белков и липидов специфически собираются, чтобы создать и поддерживать определенные структурные и функциональные домены, необходимые для функции нервов [1-5]. Во время миелинизации позитивные и негативные регуляторы д. тонко контролировать, чтобы толщина миелина была строго пропорциональна диаметру аксона. Однако, молекулярные механизмы, которые способствуют и регулируют миелинизацию, а также молекулярные аппараты, ответственные за транспорт и целенаправленную доставку пузырьков во время биогенеза миелина, в основном неизвестны. Напр., Kif1b является единственным моторным белком, идентифицированным, как участник миелинизации ЦНС у Danio rerio (рыб) [6].
Ранее мы сообщали, что в Шванновских клетках Kif13b моторный белок (известен также как guanylate kinase-associated kinesin [GAKIN] у человека) является частью комплекса, контролирующего формирование мембраны во время миелинизации Шванновскими клетками [7]. Мы установили, что Kif13b взаимодействует с Discs large 1 (Dlg1) каркасным белком Шванновских клеток и что подавление экспрессии или Kif13b или Dlg1 в Шванновских клетках в нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) в совметных культурах снижает миелинизацию in vitro [7]. Др. независимое исследование сообщило, что замалчивание Dlg1 Шванновских клеток in vitro обнаруживает дефекты миграции и снижение экспрессии белка полярности Par3 [8]. Изредка замалчиваемые клетки преодолевали дефект миграции и миелинизировались, но возникающие в результате сегменты миелина были толще, чем в контроле, это указывает на то, что Dlg1 действует как негативный регулятор толщины миелиновой оболочки [8]. Эта роль делее оценивали in vivo и было установлено, что нервы мыши, лишенные экспрессии Dlg1 специфически в Шванновских клетках, обнаруживали избыточную миелинизацию, образование наружных складок (outfoldings) миелина и демиелинизацию вследствие нестабильности миелина [8,9]. Dlg1, как полагают, действует в комплексе с phosphatase and tensin homolog (PTEN), чтобы снизить активность AKT (v-AKT murine thymoma viral oncogene homolog); тем самым он тормозит миелинизацию [8].
Kif13b кинезин является моторным белком, нацеленным на плюс-конец, который обеспечивает транспорт некоторых грузов в поляризованных клетках [10-16]. В PC12 клетках, Kif13b негативно регулирует centaurin-α1/PIP3BP (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate binding protein), GTPase вктивирующий белок (GAP) для Arf6 (ADP-ribosylation factor) GTPase и способствует активации Arf6 плазматической мембраны [16]. В нейронах Kif13b транспортирует centaurin-α1/PIP3BP и PIP3 в кончики нейритов, чтобы способствовать полярности нейронов [11].
Для дальнейшего изучения функции комплекса Kif13b/Dlg1 в миелинизировании in vivo ? cs создали новый Kif13b floxed аллель и с кондиционным нокаутом модельных мышей со специфическим устранением Kif13b или Dlg1 или в Шванновских клетках, или в олигодендроцитах. Здесь мы показали, что Kif13b выполняет противоположную роль в миелинизации в периферической и центральной нервной систем. Наши данные показали, что в Шванновских клетках Kif13b взаимодействует с p38γ mitogen-activated protein kinase (MAPK)? чтобы способствовать фосфорилированию и убиквитинированию Dlg1. В соответствии с этим наблюдением, потеря Kif13b приводила к снижению уровней p38γ MAPK, увеличению экспрессии Dlg1 и снижению толщины миелина.
Наконец, мы установили, что Kif13b контролирует также функцию Dlg1 в олигодендроцитах, способствуя его негативной регуляции. Однако, наши данные показали. что в противоположность Шванновским клеткам, Dlg1 не снижает, а скорее усиливает активацию AKT в олигодендроцитах. Т.о., Kif13b является новым негативным регулятором миелинизации ЦНС.

Discussion


Базирующиеся на микротрубочках кинезиновые моторы выполняют многие клеточные функции, включая транспорт различных грузов в разные части клетки [42]. Моторные белки также используются для перемещения грузов на длинные расстояния, напр., сигнальных комплексов или онтогенетических детерминантов в нейронах или эмбрионах, соотв. Однако, выявлены недавно неожиданные функции, установлено, что кинезины действуют также как каркасные белки и сигнальные молекулы [43]. В частности, Kif13b, как было установлено, в гепатоцитах работает как каркасный белок и усиливает зависимую от caveolin-1 интернализацию рецептора LRP11 [12]. В Т клетках Kif13b действует как сигнальная молекула, которая контролирует локализацию CARD11 каркасного белка в синапсах и подавляет передачу сигналов TCR [13]. Здесь мы выявили новый механизм, с помощью которого Kif13b моторный белок регулирует активность каркасного белка Dlg1 и контролирует передачу сигналов PI3K/AKT с двумя противоположными исходами миелинизации в PNS и CNS (Fig 9).

Fig 9. Kif13b regulates myelination in PNS and CNS through the Dlg1 scaffold. The PI3K-AKT-mTOR signaling axis is one of the signaling pathways regulating myelination in both PNS and CNS, as recently reviewed [49-56,64]. Our results suggest that in Schwann cells, Kif13b is a positive regulator of myelination. Kif13b promotes p38? MAPK-mediated Dlg1 phosphorylation and ubiquitination. Dlg1, in complex with PTEN, is known to reduce AKT activation and thus negatively regulates myelination. Dlg1 loss is associated with increased myelin thickness and myelin outfoldings, as a result of increased PIP3 and AKT phosphorylation levels [8,9,47]. On the contrary, in oligodendrocytes, loss of Kif13b-mediated negative regulation of Dlg1 and the consequent increase in Dlg1 levels are associated with transient hypermyelination. Of note, we found that in the CNS Dlg1 is a promoter and not an inhibitor of myelination, and it likely modulates PI3K class I activity.



Kif13b Regulates PNS Myelination through the Dlg1 Scaffold


Мы установили, что подавление экспрессии Kif13b в Шванновских клетках связано с уменьшением толщины миелина, снижением активации AKT и увеличением уровня Dlg1, известного тормоза миелинизации PNS, действующего на путь PIP3-AKT-mTOR [8,9]. Поскольку Kif13b и Dlg1взаимодействуют в Шванновских клетках- [7], то мы предположили, что Kif13b может контролировать миелинизацию посредством самого каркасного белка Dlg1 путем регуляции его стабильности и функции. В самом деле, в подтверждение нашего предположения Kif13bFl/Fl//Dlg1Fl/+; P0-Cre в дважды мутантных седалищных нервах уровни экспрессии Dlg1 и толщина миелина были одинаковы с контролем.
Интересно, что Kif13bFl/Fl P0-Cre нервы, в которых уровни экспрессии Dlg1 повышены, миелинизация не задерживается на очень ранних ст. постнатального развития нервов, а пониженная толщина миелина показывает, когда активация AKT начинает физиологически снижаться, после ст. P20 [8,9]. Это наблюдение согласуется с фенотипом мутантных мышей, лишенных Dlg1, особенно в Шванновских клетках [9]. Ранее мы сообщали о временном увеличении толщины миелина и случайных outfoldings миелина в Dlg1Fl/Fl P0-Cre нервах, начиная со ст. P10 [9]. Однако, даже при усилении, миелинизация не ускорялась в Dlg1Fl/Fl P0-Cre нервах, и на очень ранних стадиях постнатального развития нервов количество миелинизированных волокон и толщина миелина были сходными с контрольными нервами. Т.о., Dlg1 может действовать как тормоз миелинизации, подавляя активацию AKT на пике миелинизации, когда начинает снижаться фосфорилирование AKT. В подтверждение этой гипотезы, outfoldings миелина, фокальные формы избыточной миелинизации, которые связаны с избыточной экспрессий AKTи потерей Dlg1-обеспечиваемого негативного контроля миелинизации, наблюдаются в нервах после 3 недель постнатального развития [44].
Стабильность Dlg1 контролируется с помощью фосфорилирования и убиквитинирования [8,21,22,27,28,30,45,46]. У Drosophila, PAR1 киназа непосредственно фосфорилирует Dlg1 в консервативных сайтах и негативно регулирует его подвижность м целенаправленное воздействие на постсинаптические мембраны нейро0мышечных сроединений [27]. Осмотические стрессы, вызываемые фосфорилированием серина в Dlg1 с помощью p38γ MAP киназы может вызывать диссоциацию Dlg1 от glucokinase-associated dual specificity phosphatase (GKAP) и цитоскелета, регулируя негативно Dlg1 [28]. Наконец, фосфорилированый DLG1 взаимодействует с β-TrCP убиквитин лигазным рецептором, который обеспечивает убиквитинирование белка [30]. Т.о., мы исследовали, действительно ли уровни экспрессии улучшенного Dlg1 белка в Kif13bFl/Fl P0-Cre нервах коррелируют со снижением фосфорилирования по серину и/или убиквитинирования. В соответствии с нашей гипотезой, мы установили, что в Kif13bFl/Fl P0-Cre нервах Dlg1оказывается менее фосфорилирован и менее убиквитинирован, подтверждая, что Kif13b способствует радиальному росту миелина за счет непосредственного или косвенного влияния на стабильность и экспрессию.
Мы также подтвердили, что p38γ MAPK может быть киназой, которая стоит ниже Kif13b, фосфорилирует Dlg1, чтобы регулировать его активность. В самом деле, p38γ MAPK, как известно, взаимодействует с и фосфорилирует сериновые остатки в Dlg1 в др. клетках [28]. Мы идентифицировали p38γ при анализе дву-гибридного скрининга у дрожжей, используя библиотеку cDNA и Dlg1 в качестве затравки [7,33].Более того, мы покали, что p38γ, Dlg1 и Kif13b образуют в нервах комплекс. Более важно, что седалищные нервы p38γ-нулевых мышей недостаточно миелинизированы, тем самым подтверждается гипотеза, что p38γ, путем фосфорилирования и негативной регуляции Dlg1, действует как промотор миелинизации нижестоящим Kif13b. К сожалению, антитела, которые могли был специфически распознавать фосфорилированную p38γ, недоступны потому что активированная p38γ может взаимодействовать с Kif13b и Dlg1.
Интересно, что роль p38γ MAPK в регуляции миелинизирования PNS пока не оценена. Предыдущие исследования подтвердили, что p38 MAPK обеспечивает передачу сигналов laminin in vitro, чтобы способствовать элонгации Шванновских клеток и их расположению на самых первых стадиях дифференцировки [34]. Hossain et al., подтвердили, что p38 управляет дифференцировкой Шванновских клеток путем регуляции экспрессии Krox-20, подтвердив тем самым роль p38 MAPK как позитивного регулятора миелинизации PNS [35]. Однако, на основании использованных ингибиторов MAPK, наблюдаемый эффект был, скорее всего, обусловлен с помощью p38α или p38β [35]. В недавнем исследовании сообщалось, что in vitro p38 MAPK способствует состоянию де -дифференцировки Шванновских клеток во время Wallerian дегенерации, за счет индукции экспрессии c-Jun и за счет ингибирования экспрессии гена миелина и также было подтверждено, что p38 MAPK является негативным регулятором дифференцировки и миелинизации Шванновских клеток во время развития [36]. На основании антител, используемых для распознавания фосфорилированного состояния MAPK , также как и MAPK ингибитора (SB203580), др. изоформы скорее, чем p38γ обеспечивают эту функцию [36].
Как могут Kif13b и p38γ контролировать фосфорилирование, убиквитинирование и стабильность Dlg1? Kif13b может транспортировать и локализовать киназу на мембранах, где концентрируется Dlg1, чтобы подавлять в комплексе с PTEN, уровни PIP3 и активацию AKT [47]. В самом деле, в Kif13b-нулевых, но не в Dlg1-нулевых нервах уровни экспрессии p38γ снижены, подтверждается тем самым, что p38γ стоит ниже Kif13b и выше Dlg1. Напротив, связывание Kif13b с Dlg1, которое обеспечивается с помощью доменов ассоциированной с мембраной guanylate kinase гомолога binding stalk (MBS) и guanylate kinase гомолога (GUK), соотв., может ослабить внтуримолекулярное ингибирование или в Kif13b или Dlg1, как уже сообщалось [48]. Напр., после связывания Kif13b конформационное изменение Dlg1 (открытое состояние) может приводить к тому, что остатки мишени для фосфорилирования серина может быть открыты и доступны для p38γ киназой обусловленного фосфорилирования. К сожалению, p38γ-специфичные ингибиторы не доступны для дальнейшего исследования этих механизмов.
Наши данные выявили новую функцию Kif13b/p38γ в качестве негативного регулятора Dlg1 в сигнальном пути PI3K/AKT. Интересно, что Kif13b уже был заподозрен как негативный регулятор в др. исследованиях. Напр., в PC12 клетках, KIF13B негативно регулирует centaurin-α1/PIP3BP (PIP3 связывающий белок), GAP для Arf6, способствуя тем самым активации Arf6 GTPase плазматической мембраны [16]. Далее в T клетках, KIF13B негативно регулирует передачу сигналов TCR к NF-kB, путем перераспределения CARD11 каркасного белка из центра синапса к более дистальному региону [13].

Kif13b Regulates CNS Myelination through the Dlg1 Scaffold


Мы также показали, что Kif13b является негативным регулятором миелинизации CNS. В самом деле, мы наблюдали, что подавление экспрессии Kif13b в олигодендроцитах приводит к увеличению толщины миелина и активации AKT, что согласуется с ролью AKT в обеспечении миелинизации CNS [32]. Как и в PNS, мы установили, что Kif13b взаимодействует с Dlg1 и что потеря Kif13b связана с повешением уровней Dlg1, это подтверждает негативную регуляцию, обеспечиваемую с помощью Kif13b в отношении Dlg1. Учитывая это сходство, мы исследовали, могут ли повышенные уровни и стабильность Dlg1 в олигодендроцитах также возникать в результате снижения p38γ-обеспечиваемого фосфорилирования. В самом деле, мы установили, что Kif13b, Dlg1 и p38γ MAPK взаимодействуют в зрительных нервах и что экспрессия p38γ снижена у Kif13b, но не у Dlg1 мутантов, как и в PNS. Эти находки подтверждают, что p38γ может действовать ниже Kif13b и выше Dlg1, чтобы негативно регулировать активность Dlg1.
Роль изоформы p38γ в регуляции миелинизации CNS ещё не оценена. Как и в PNS, только p38α была исследована в CNS. Подавление активности p38α или экспрессии in vitro в системе совместного культивирования, как было установлено, предупреждает дифференцировку и миелинизацию предшественников олигодендроцитов [37-39]. Др. исследование подтвердило, что p38α MAPK поддерживает экспрессию гена миелина в головном мозге посредством нескольких механизмов, действующих на позитивные и негативные регуляторы дифференцировки [40]. Недавно обнаружено, что миелинизация нарушена у мышей с кондиционной инактивацией p38α MAPK в клетках предшественников олигодендроцитов [41]. Интересно, что те же самые авт. наблюдали противоположный эффект p38α MAPK на повторную миелинизацию, поскольку мутантные мыши обнаруживали более эффективную ремиелизацию по сравнению с контролем после демиелинизации [41]. Эти исследования еще больше подтвердили мнение, что регуляция миелинизации является очень сложным процессом, при котором различные сигналы, происходящие от внеклеточного матрикса, аксонов и астроцитов в CNS, д. быть правильно интегрированы во времени и пространстве внутри одной и той же клетки, чтобы достичь гомеостаза [49-56].
Если Dlg1 тормозит миелинизацию в CNS , как и в PNS, то как может потеря Kif13b и повышение Dlg1 вызывать увеличение толщины миелина в CNS? Неожиданно, наши данные показали, что в олигодендроцитах Dlg1является позитивным, а не негативным регулятором миелинизации, т.к. его потеря ассоциирует с уменьшением толщины миелина и активности AKT. Интересно, что помимо Dlg1, др. молекулы, как было установлено, могут контролировать миелинизацию противоположным образом в PNS и CNS [57-60]. Напр., фосфорилирование легкой цепи миозина II способствует миелинизации в PNS и ингибирует миелинизацию в CNS [57].
Чтобы определить механизм, с помощью которого Dlg1 может способствовать миелинизации CNS, действуя на путь PI3K-AKT, мы предполагаем исследовать регуляторную субъединицу PI3K class I, p85, известного посредника Dlg1 в эпителиальных клетках [29]. В соответствии с этим мы установили, что Dlg1 взаимодействует с p85 в зрительном нерве, скорее всего, чтобы модулировать активность PI3K class I, уровни PIP3 и в конечном итоге активацию AKT. Интересно, что фосфорилирование DLG1 по серину и треонину, как известно, предупреждает взаимодействие DLG1с SH2 доменами p85/PI3K [29]. Т.о., мы можем предполагать, что Dlg1, будучи недостаточно фосфорилирован, может обладать более высоким сродством к SH2 доменам p85, чья активация необходима для регуляции активности PI3K [61].