Посещений: 
ЗАКРЫТИЕ НЕРВНОЙ ТРУБКИ
Передача сигналов FGF3-BMP
An FGF3-BMP Signaling Axis Regulates Caudal Neural Tube Closure, Neural Crest Specification and Anterior-Posterior Axis Extension. Anderson MJ, Schimmang T, Lewandoski M  PLoS Genet (2016), 12(5): e1006018. doi:10.1371/journal.pgen.1006018
|
During vertebrate axis extension, adjacent tissue layers undergo profound morphological changes: within the neuroepithelium, neural tube closure and neural crest formation are occurring, while within the paraxial mesoderm somites are segmenting from the presomitic mesoderm (PSM). Little is known about the signals between these tissues that regulate their coordinated morphogenesis. Here, we analyze the posterior axis truncation of mouse Fgf3 null homozygotes and demonstrate that the earliest role of PSM-derived FGF3 is to regulate BMP signals in the adjacent neuroepithelium. FGF3 loss causes elevated BMP signals leading to increased neuroepithelium proliferation, delay in neural tube closure and premature neural crest specification. We demonstrate that elevated BMP4 depletes PSM progenitors in vitro, phenocopying the Fgf3 mutant, suggesting that excessive BMP signals cause the Fgf3 axis defect. To test this in vivo we increased BMP signaling in Fgf3 mutants by removing one copy of Noggin, which encodes a BMP antagonist. In such mutants, all parameters of the Fgf3phenotype were exacerbated: neural tube closure delay, premature neural crest specification, and premature axis termination. Conversely, genetically decreasing BMP signaling in Fgf3mutants, via loss of BMP receptor activity, alleviates morphological defects. Aberrant apoptosis is observed in the Fgf3 mutant tailbud. However, we demonstrate that cell death does not cause the Fgf3 phenotype: blocking apoptosis via deletion of pro-apoptotic genes surprisingly increases all Fgf3 defects including causing spina bifida. We demonstrate that this counterintuitive consequence of blocking apoptosis is caused by the increased survival of BMP-producing cells in the neuroepithelium. Thus, we show that FGF3 in the caudal vertebrate embryo regulates BMP signaling in the neuroepithelium, which in turn regulates neural tube closure, neural crest specification and axis termination. Uncovering this FGF3-BMP signaling axis is a major advance toward understanding how these tissue layers interact during axis extension with important implications in human disease.
|
Удлинение оси у эмбрионов позвоночных нуждается в координации многочисленных генетических и морфологических процессов внутри и между зародышевыми слоями: энтодермой, мезодермой и происходящим из эктодермы нейроэпителием. Такая координация нуждается в многочисленных сигнальных факторах для регуляции ключевых событий.
Примером тому является нейроэпителий, который подвергается морфологическим движениям, которые трансформируют слой клеток в нервную трубку. Лежат в основе и управляют этим важным процессом многочисленные сигнальные пути, генетические и эпигенетические механизмы и внешние сигналы [1-3]. Учитывая эту сложность, вполне понятно, что neural tube defects (NTDs) являются наиболее часто встречающимися врожденными дефектами в популяциях людей (1:1000) [4] и идентифицировано большое количество мышиных моделей NTD (более 240) [5-7].
Нейруляция во время удлинения оси позвоночных подразделяется на первичную и вторичную фазы. Во время первичной нейруляции нервная трубка формируется путем образования складок из нервной пластинки, так что два края пластинки пространственно сближаются, делая возможным слияние по дорсальной срединной линии [8]. Закрытие вдоль спинальной оси инициируется на границе между спинным и задним мозгом и распространяется каудально, заканчиваясь закрытием заднего нейропора в области туловища. Нарушения закрытия нейропора приводят к spina bifida (Latin for "split spine"), которое напоминает наиболее частый тип NTD у человека, несмотря на снижение частоты после обязательного добавления фолиевой кислоты в крупяные изделия в США[9]. При расщеплении позвоночника до года выживают 79 - 96%, в зависимости от расового и этнического происхождения [9]; однако, выжившие пациенты часто недееспособны в течение всей жизни и обнаруживают высокую смертность в юном возрасте [10].
Закрытие заднего нейропора означает конец первичной нейруляции. Образование нервной трубки каудальнее этой области происходи т посредством процесса вторичной нейруляции, связанной с привлечением мезенхимно-эпителиального перехода клеток внутри хвостовой почки, чтобы сгенерировать трубку [11,12]. Эти клетки располагаются в области хвостовой почки, наз. "chordoneural hinge" (CNH), который содержит не только предшественники нервной трубки, но и также клетки, которые генерируют каудальные сомиты и хорду [13-15].
Одновременно с удлинением оси и нейруляцией происходит образование нервного гребня: временного мигрирующего клона из дорсальной стороны нервной трубки и формируются различные типы клеток, включая меланоциты, черепно-лицевые хрящи и кости, и периферические и энтерические нервы и глию. Время эмиграции нервного гребня туловища, как было установлено, были установлено, контролируется с помощью каудальных сигналов FGF и ростральных сигналов ретиноевой кислоты от соседней мезодермы [16].
Нарушения в нервном гребне человека, это синдромы, вызываемые нарушениями регуляции нервного гребня, часто появляются как NTDs [17,18], и имеется ограниченное перекрывание двух типов синдромов [17]. Сходным образом, имеется субнабор мышиных мутантов, чьи дефекты возникают при закрытии нервной трубки и развитии нервного гребня [5]. Сюда входят мутации компонентов сигнального пути BMP, демонстрируя, что собственно регуляция этого пути является важной для обоих событий [19-22]. В каудальной части туловища, экзогенный BMP должен ингибировать необходимые морфогенетические движения внутри нейроэпителия, которые необходимы для закрытия нейропора, поскольку преждевременное закрытие происходит у Bmp2 нулевых гомозигот [23]. Однако, после закрытия передача сигналов BMP необходима для выделения нервного гребня из этого региона. BMP4 и BMP7 д. индуцировать программы клеток нервного гребня [24], а данные по манипуляции с эмбрионами кур подтверждают идею, что BMP4 в дорсальной части нервной трубки необходим для вычленения каудальной части нервного гребня [25-27]. Т.о., дорсальная активность BMP в каудальной части нервной трубки д. быть противоположной, поскольку она затрудняет закрытие нервной трубки, но после этого необходима для развития нервного гребня. Один из путей у эмбрионов позвоночных тщательно калибрует активность BMP в этом регионе - это баланс между BMPs и их антагонистом, NOGGIN [25,26]. В соответствие с этой идеей, Noggin нулевые гомозиготы д. обнаруживать как открытую нервную трубку, так и избыточное развитие нервного гребня [23,28-30].
Мы продемонстрировали, что передача сигналов FGF3 из пресомитной мезодермы (PSM) представляет другой уровень регуляции передачи сигналов BMP в каудальной части нервной трубки. Многие FGFs экспрессируются в пресомитной мезодерме, и мы недавно продемонстрировали, что Fgf4 и Fgf8 могут кодировать классическую активность, известную как "фронт волны", который предотвращает дифференцировку PSM во время сомитогенеза [31]. Одновременная инактивация обоих этих генов Fgf в разные временные точки эмбриогенеза вызывает укорочение AP оси [31,32]; однако, инактивация любого в отдельности из этих Fgfs не вызывает очевидных дефектов удлинения оси, демонстрируя избыточность этой системы [31,33]. Более того, инактивация одиночного гена у мышей демонстрирует, что 5 др. Fgfs экспрессируются в PSM (Fgf3, Fgf5, Fgf15, Fgf17 и Fgf18), и только Fgf3 необходим для удлинения оси (rev. [27]). Наше исследование показало, что Fgf3 укорочение оси вызывается с помощью усиления активности BMP сигналов от каудальной части нервной трубки, что эти сигналы вызывают также увеличение нейроэпителиальной пролиферации, задержку закрытия нервной трубки и преждевременное образование нервного гребня.
Discussion
Fgf3 занимает специальное положение в истории генетики как первый не селектируемый локус, инактивируемый у мышей с помощью генного targeting [81]. Мыши, лишенные Fgf3 имеют дефекты в развитии ушей и хвоста; хотя большинство было изучено в отношении первого фенотипического отклонения, поэтому мало известно относительно возникновения дефектов хвоста [35,36]. Наши находки суммированы на Fig 10. Мы продемонстрировали, что дефекты хвоста возникают на ст.E9.5, за счет преждевременной инициации передачи сигналов BMP (Bmp4 и Bmp7) от дорсальной части нервной трубки. Это имеет два последствия в нейроэпителии: задержку закрытия заднего нейропора и аномальную экспансию нервного гребня во время первичной нейруляции.
Fig 10. Model and timeline of phenotypes.
(A) Timeline of phenotypes due to loss of Fgf3, indicating onset and duration of observed increased BMP signaling in the neural tube, aberrant neural tube width and caudal neural crest expansion, loss of tailbud progenitors (indicated by Fgf8intronstaining), and decreased PSM. Red "X" indicates premature loss of tailbud progenitors (Fgf8intron lost around ~48 ss as opposed to normal loss at >55 ss), and premature loss of PSM. NCC, neural crest cells; NT, neural tube; PSM, presomitic mesoderm. (B) Model of FGF3 signaling from the PSM to limit BMP signaling in the neural tube, which positively affects neural crest cell specification, and negatively affects neural tube closure and tailbud progenitors in the mesoderm.
Усиленная экспрессия Bmp в дорсальной части нервной трубки предполагает усиление экспрессии гена Wnt и через действие WNT повышение клеточной пролиферации и нервного гребня [19,23,26,27,74,82]. В соответствии с этим, мы наблюдали усиление Wnt1 и Wnt3a в каудальной части нервной трубки и усиление пролиферации в Fgf3 нервной трубке. Избыточная пролиферация была связана с дефектами закрытия нервной трубки [83,84], неудивительно, учитывая сложные паттерны пролиферации и клеточных движений, которые сопровождают закрытие нервной трубки [85]. Когда мы генетически изменяли передачу сигналов BMP вверх или вниз, это сопровождалось увеличением или снижением дефектов Fgf3 нервной трубки, мы наблюдали одновременное увеличение или понижение, соотв., пролиферации. Следовательно, повышение пролиферации, с помощью увеличения активности BMP, может быть основой Fgf3 фенотипических отклонений в нервной трубке.
На ст. E10.5, спустя 24 ч после повышения передачи сигналов BMP, мы наблюдали первые доказательства укорочения оси: потерю клеток предшественников PSM (уменьшение Fgf8 intron domain) и более короткую PSM (уменьшение Msgn1 expression domain). Эти изменения возникали во время формирования вторичной оси; т.о., Fgf3 фенотипические отклонения затрагивают первичную и вторичную нейруляцию и формирование оси. Мы показали, что экзогенного BMP4 достаточно, чтобы редуцировать домен предшественников PSM. Более того, когда наши генетические манипуляции с передачей сигналов BMP у Fgf3 мутантов влияли на фенотип нервной трубки, они, скорее всего, затрагивали дефекты удлинения оси, или путем увеличения её, когда один аллель Noggin удалялся или уменьшения её, когда Bmpr1b был инактивирован. Единственный способ смотреть на мутантов Fgf3 в том, что они предоставляют генетический фон, сенсибилизированный к различиям в передаче сигналов BMP.
Does FGF3 signal directly to the neural tube?
Хотя наши данные подтверждают модель, в которой FGF3 регулирует передачу сигналов BMP в нейроэпителии, эта регуляция может быть достигнута посредством передачи сигналов FGF3 непосредственно в нейроэпителий или косвенно через промежуточные звенья. Поскольку данное исследование не может убедительно выбрать между этими возможностями, мы склоняемся в пользу первой идеи (прямой передачи сигналов). Поскольку мы не нашли доказательств передачи сигналов FGF3 в PSM, регуляция др. фактора, который передает сигналы в нервную трубку, напр., отсутствует снижение экспрессии известных генов мишеней для FGF, Spry2 или Etv4 в PSM у Fgf3 мутантов (S4 Fig). Ранее мы опубликовали данные, демонстрирующие, что эти FGF гены мишени снижают саою активность, когда инактивированыFgf4 и Fgf8 в PSM, несмотря на экспрессию Fgf3, указывают, что FGF3 недостаточен для их экспрессии [31].
Непосредственная передача сигналов FGF3 в нервную трубку может осуществляться посредством FGFR1 или FGFR2, т.к. мутации любого из них ведут к уродствам нервной трубки. Развитие нулевых Fgfr1 гомозигот останавливается до закрытия нервной трубки [86,87], но химерные эмбрионы со вкладом Fgfr1 нулевых клеток в задней части нервной трубки обнаруживают spina bifida и хвоста с изломом [88]. Более того, эмбрионы, несущие мутации FGFR1, которые устраняют передачу сигналов к MAPK и PI3K путям, имеют NTDs [89]. Столь же неотразим случай с FGFR2. IIIb изоформа FGFR2 связывает FGF3 и преимущественно экспрессируется в эпителии, таком как нейроэпителий [90]. Эмбрионы, гомозиготные по мутациям, который устраняют только эту Fgfr2 изоформу, имеют дефекты, идентичные тем, что у Fgf3 мутантов (neural development was not examined in these studies) [91,92]. Специфичные для нервной труби делеции этих рецепторных генов необходимы. чтобы исследовать действительно ли сигналы FGF3 действуют непосредственно на нейроэпителий.
Fgf3 signaling and genetic redundancy
Хотя экспрессия Fgf3 непрерывна в возникшей мезодерме, начиная со ст. E7.5 (this study and [37]), самое раннее проявление потери Fgf3 не обнаруживается в течение 24 ss (~ E9.5). Следовательно, если существует более ранняя потребность в FGF3 из этого домена, то она может перекрываться др. FGF(s). Генетические исследования на мышах показали, что FGF3 имеет общую функцию с FGF8 и FGF10 в развитии внутреннего уха 34,93-95], и с FGF10 в сердечно-сосудистом развитии [96] и с FGF8 в фарингеальном морфогенезе [97]. Кандидаты Fgf генов, экспрессирующихся внутри или вблизи PSM, которые могут функционировать вместе с Fgf3 включают Fgf4, Fgf5, Fgf8, Fgf15, Fgf17 и Fgf18 [98], при этом Fgf4 и Fgf8 безусловно наиболее подходящие кандидаты, исходя из потребности в них для удлинения оси [31,32]. Мы недавно опубликовали, что Fgf3 и Fgf4 функционально перекрываются при поддержании мезодермы в хвостовой почке во время формирования вторичной оси; однако, мы не обнаружили дополнительных дефектов в формировании паттерна мезодермы или нервной трубки вдоль первичной оси [99]. В данной работе мы продемонстрировали, что не существует функционального перекрывания между Fgf3 и Fgf8.
Мы полагаем, что Fgf4 и Fgf8 необходимы при удлинении оси ждя экспрессии и поддержания генов в PSM, тогда как FgF3 необходим во время промежутка, в течение которого происходит переход между удлинением первичной и вторичной оси для экспрессии гена в нейроэпителии и нормального морфогенеза во время действия BMP. Подтверждает эту идею то, что экспрессия генов мишеней для FGF в PSM невозможна, если Fgf4 и Fgf8 инактивированы [31,32], даже в присутствии остаточной экспрессии Fgf3 [31,32]. Хотя Boulet and Capecchi обнаружили дефекты нервной трубки, когда были инактивированы Fgf4 и Fgf8, остается неясным, действительно ли эти дефекты обусловлены их эффектом на первичное или вторичное удлинение оси. Более того, Boulet and Capecchi установили, что экспрессия Wnt3a, единственного маркера нервного гребня в их исследовании, не увеличивается в нервной трубке [31,32], как это мы наблюдали у Fgf3 мутантов (Fig 6).
Cell death in neural tube closure and axis extension termination
Мы открыли дефекты закрытия нейропора у Fgf3 мутантов, потому что это драматически усиливало у эмбрионов отсутствие про-апоптических факторов BAK и BAX, при которых апоптоз устранялся. При нормальном развитии клетки нервного гребня подвергаются апоптозу перед и после закрытия нервной трубки [100-102]. Необходим ли этот апоптоз для нормального закрытия нервной трубки на сегодня спорный вопрос. Ингибирование апоптоза с помощью pan-caspase ингибиора, zVAD-fmk, вызывает неспособность закрытия нервной трубки у птиц [102], но не у мышей [103]. Хотя мыши, лишенные генов, которые кодируют внутренне присущие апоптические факторы, такие как Casp3, Casp9 или Apaf1, обнаруживают дефекты закрытия нервной трубки [104-106], Copp с сотр. установили, что передний мозг и регионы спинного мозга закрывают нервную трубку у мутантов Casp3 и Apaf1 [103]. противоречивые данные, связанные с необходимостью этих факторов, могут быть объяснены чувствительностью этих дефектов к генетическому фону [104]. Также, потребности в апоптозе могут быть легкими; Yamaguchi et al продемонстрировали, что если происходит закрытие у мутантов Apaf1 и Casp3, то происходит это с задержанной кинетикой [101], мы наблюдали это у Fgf3 нулевых гомозигот.
Неожиданно эти дефекты закрытия нервной трубки у Fgf3 мутантов усиливались после устранения клеточной гибели, когда дополнительно устраняли функцию BAK/BAX. У этих Fgf3; Bak; Bax тройных нулевых мутантов были аномальными клетки не только PSM, где предупреждалась клеточная гибель, но и нормальная гибель клеток в дорсальной части нервной трубки также подавлялась (Fig 3A, bracket). Это может быть результатом сохранения нейральных клеток, экспрессирующих BMP, которые вместе с усилением экспрессии Bmp, обусловленной отсутствием Fgf3, обусловливают общие высокие уровни BMP, вызывающие наблюдаемые тяжелые открытые NTD. В самом деле, мы обнаружили высокий уровень экспрессии Bmp4 в дорсальной части нервной трубки у Fgf3; Bak; Bax тройных нулевых гомозиггот по сравнению с просто мутантами Fgf3 (S13 Fig). Более того, обнаруживаются увеличение мигрирующих и готовых к миграции клеток нервного гребня в каудальной части нервной трубки у этих компаундных мутантов (S13 Fig), что согласуется с гипотезой усиления передачи сигналов BMP.
Остается вопрос, действительно ли BMP-обусловленная потеря клеток предшественников PSM у Fgf3 мутантов ускоряет процесс, который происходит во время завершения нормальной оси. Перед нормальным завершением формирования оси, PSM-специфическая экспрессия Fgf3 подавляется (Fig 1C) а передача сигналов BMP увеличивается в домене предшественников PSM у эмбрионов дикого типа (как показывает экспрессия Msx1 на S11 Fig). Это согласуется с идеей, что передача сигналов оси FGF3-BMP может завершать передне-заднее удлинение. Генетической проверкой этой гипотезы было бы возникновение мышей с более длинными хвостами из-за инактивации генов, кодирующих компоненты передачи сигналов BMP. Хотя мы не наблюдали такого эффекта у Bmpr1b нулевых гомозигот (среднее количество каудальных позвонков было равным 30 у Bmpr1b-/-, n = 4 и Bmpr1bwt/wt, n = 3), др. гены кандидаты предстоит исследовать.
У эмбрионов рыб и кур современная модель завершения образования оси предполагает, что подавление FGFs и WNTs и повышение уровней ретиноевой кислоты (RA) приводит к гибели предшественников PSM [107-111]. Однако, эксперименты у мышей подтверждают, что завершение формирования оси происходит в отсутствие RA [112]. Более того, укорочение оси, обусловленное PSM-специфической инактивации Fgfr1 или Fgf4/Fgf8 происходит без изменений в уровнях RA [32,39]. Какими бы не были участвующие сигналы, наши данные подтверждают, что, по крайней мере, у мышей клеточная гибель не нужна для потери предшественников PSM, ни в норме во время удлинения оси, ни у Fgf3 мутантов с преждевременным завершение этого процесса, поскольку мы установили, что если ингибирован апоптоз с помощью инактивации Bak/Bax, то завершение образования оси всё ещё происходит в обоих случаях (S7 Fig, Fig 3).
Potential FGF3 role in human neural tube closure defects
Характеристика мышиных хвостовых мутантов привела к информации о синдромах у человека, затрагивающих удлинение оси. Напр., мутации в локусе T, которые вызывают укорочение хвоста у мышей [113], ассоциируют с spina bifida и уродствами позвонков у людей [114,115]. Поэтому мы полагаем, что мутации FGF3 у человека также могут вносить вклад в аномальное закрытие нервной трубки или уродства позвонков. Это согласуется с тем, что Fgf3 целенаправлено полученные аллели мыши, которые моделируют дефекты зубов и развития внутреннего уха у людей, были мутациями FGF3, вызывающими врожденную глухоту, microtia и microdontia. (http://omim.org/entry/164950?search=fgf3&highlight=fgf3).
В подтверждение этой идеи геномный скрининга NTDs у людей установил сцепление с регионами хромосомы 10 (10q25.3), который включает FGFR2 [116], который, как известно, кодируется рецептор для FGF3. Интересно, что Hillbertz et al полагают, что мутации внутри региона хромосомы 11 (11q13), который содержит тесно сцепленную группу генов, FGF3, FGF4 и FGF19, могут вызывать NTDs у людей, исходя из их находки, что дупликация этого региона вызывают гребень волосков и предрасположенность к дермоидным синусам у Ridgeback собак [117]. Дермоидные синусы вызываются неполным отделением нейроэпителия и эктодермы во время закрытия нервной трубки, а у людей, они часто ассоциируют со spina bifida occulta [118]. Мы полагаем, что FGF3 может быть важным геном в этом регионе, необходимым для нормального закрытия нервной трубки и каудального развития.
|