Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ НЕЙРИТОВ



Механизмы

Cytoskeletal and signaling mechanisms of neurite formation
Rajiv Sainath, Gianluca Gallo
Cell and Tissue Research January 2015, Volume 359, Issue 1, pp 267–278

The formation of a neurite, the basis for axons and dendrites, begins with the concerted accumulation and organization of actin and microtubules. Whereas much is known about the proteins that play a role in these processes, because they perform similar functions in axon branching and filopodia formation, much remains to be discovered concerning the interaction of these individual cytoskeletal regulators during neurite formation. Here, we review the literature regarding various models of filopodial formation and the way in which proteins that control actin organization and polymerization induce neurite formation. Although several different regulators of actin polymerization are involved in neurite initiation, redundancy occurs between these regulators, as the effects of the loss of a single regulator can be mitigated by the addition of neurite-promoting substrates and proteins. Similar to actin dynamics, both microtubule stabilizing and destabilizing proteins play a role in neurite initiation. Furthermore, interactions between the actin and microtubule cytoskeleton are required for neurite formation. Several lines of evidence indicate that the interactions between these two components of the cytoskeleton are needed for force generation and for the localization of microtubules at sites of nascent neurites. The general theme that emerges is the existence of several central regulatory pathways on which extracellular cues converge to control and organize both actin and microtubules to induce the formation of neurites.
Выпячивание нейрита является важной первой ступенью в формировании аксонов и дендритов, которые являются необходимыми компонентами для развития функциональной нервной сети. В то время как внеклеточные сигналы влияют на возникновение нейрита, реорганизация его актинового цитоскелета в конечном счете управляет морфологическими изменениями (rev. Da Silva and Dotti2002). Нейрит формируется путем регуляции цитоскелета внутриклеточного тела нейрона, чтобы сгенерировать филоподию, которая служит в качестве первой ступени в образовании нейрита. Исторически считалось, что это сопровождается заполнением её сетями актина и микротрубочек, выполняющих отдельные независимые роли, но было открыто несколько адапторных белков, которые связывают две сети и что эти две сети действуют сочетанно при формировании нейрита. Нейрофиламенты являются специфичными для нейронов промежуточными филаментами, которые регулируют цитоскелет и аксональный транспорт (Yuan et al. 2012). В то время как нервным ростовым фактором (NGF)-индуцированное образование нейрита ассоциирует с увеличением выраженности нейрофиламент, нокдаун и антитела против специфических нейрофиламент предупреждают дифференцировку нейритов в аксоны, но, по-видимому, он не играет главной роли в инициации нейритов (Lin and Szaro 1996; Lindenbaum et al. 1988; Shea and Beermann 1999; Szaro et al. 1991). Современная концепция понимания способа формирования нейрита представлена на Рис. 1.


Fig. 1 Overview of cytoskeletal dynamics and organization during neurite formation. a Prior to the emergence of neurites the neuronal cell body exhibits a submembranous actin filament (red) cytoskeleton that does not engage in protrusive activity. Microtubules (green) are formed at the perinuclear centrosome and emanate toward the periphery. bOne of the major events of neurite formation is the initiation of actin-filament-based protrusions from the periphery of the neuronal cell body. Microtubules and actin filaments are coordinated during this phase leading to the formation of a neurite. Inset B'Microtubules exhibit a preference for extending along filopodial bundles of actin filaments, relative to the more geometrically complex mesh of the interconnected filaments characteristic of lamellipodia. Thus, filopodial actin filament bundles serve as guides for the orchestration of these two components of the cytoskeleton. c Following the invasion of the filopodium by microtubules, the filopodium then develops polarity (i.e., develops a protrusive growth cone at its tip) and is now considered a neurite. The entry of microtubules allows the transport of a multitude of molecular cargoes and organelles into the nascent neurite

Наблюдения in vivo инициации нейритов затруднены из-за технических условий. Поэтому большинство доступных данных используют in vitro диссоциированные культуры, которые позволяют производить пространственные и временные наблюдения. Первичные культуры диссоциированного гиппокампа и коры воспроизводят многие нейрональные структуры, наблюдаемые во время развития, делая возможными наблюдения образования аксонов и дендритов и позднее формирование синапсов (Banker and Goslin 1988). Манипуляции с этими культурами часто технически затруднены и поэтому для изучения образования нейритов используются клетки нейробластомы или NGF-обработанные PC12 клетки, т.е. линия клеток от феохромоцитомы крыс мозгового слоя надпочечника. Эта альтернативная модельная система инициирует нейриты, которые напоминают предшественники аксонов и дендритов со сходной, но не идентичной организацией цитоскелета, но которые не развиваются далее в зрелые аксоны и дендриты (Dotti et al. 1988).

Actin dynamics during neurite initiation


Инициация нейрита начинается с образования богатой актином филоподии из ела клетки нейрона, что сопровождается расширением филоподии в нейрит. Однако, специфический механизм, который координирует актиновый цитоскелет к образованию филоподии остается неясным (Faix et al. 2009; Mattila and Lappalainen 2008; Mellor 2010; Svitkina et al. 2003; Vignjevic et al. 2006). Две господствующие модели инициации филоподий сведены в модель элонгации и модель нуклеации de novo. Модель конвергентной элонгации предполагает, что сеть разветвленных актиновых филамент, формируемая с помощью Arp2/3 комплекса внутри ламеллиподии, удлиняется с помощью факторов, таких как anti-capping белки, и затем образует пучок в филоподию посредством белков, таких как fascin (Svitkina et al. 2003). Модель нуклеации de novo предполагает, что филоподии формируются посредством факторов, которые нуклеируют актин и удлиняют актиновые волокна в одном направлении, что сопровождается поперечными связываниями в пучки актина филоподий (Vignjevic et al. 2006). Эти две модели образования филоподий не обязательно взаимно иключают др. др. и механизмы образования филоподий в специфические нейрональные популяции, по-видимому, зависят от типа клеток и окружения.

Actin-binding proteins regulate actin polymerization and organization


Актиновый цитоскелет, дающий филоподию, регулируется большим набором актин-связывающих белков, которые контролируют нуклеацию, полимеризацию и организацию актина внутри клетки. Комплекс Arp2/3, главный компонент модели конвергентной элонгации, является комплексом нуклеации актина, который связывает существующие актиновые филаменты и дает начало новым филаментам, приводя к образованию сети разветвленных актиновых филамент (Dotti et al. 1988; Yang and Svitkina 2011). Интересно, что Dip1, который является новым активатором комплекса Arp2/3, может давать одиночные филаменты без необходимости в присутствии др. актиновых филамент и не образует разветвленные филаменты потенциально смазывая линию раздела между "ортодоксальными" формами модели нуклеации de novo и конвергентной элонгации (Wagner et al. 2013). Роль комплекса Arp2/3 относительно образования нейрита неясна. Некоторые наблюдения, сделанные с использованием дифференциальной интерференсной контрастной микроскопии первичных нейронов гиппокампа подтверждают, что основной движущей силой формирования филоподий нейритов является конвергентная элонгация. Эти исследования четко демонстрируют, что широкие ламеллиподии, образуемые на теле клетки, которые затем сегментируются в определенных местах, что сопровождается накоплением микротрубочек в виде упорядоченных наборов и удлиняющихся прочь от тела клетки (Dehmelt et al. 2003; Dotti et al. 1988; Tang and Goldberg 2000; Yu et al. 2001). Однако, потеря функции комплекса Arp2/3 в нейронах гиппокампа посредством вызванного с помощью short interfering RNA (siRNA) нокдауна Arp3 и p34-Arc субъединиц, не подавляют образование нейритов; вместо этого происходит увеличение появления нерегулярных нейритов, которые короче и шире (Korobova and Svitkina 2008). Напротив, избыточная экспрессия активатора комплекса Arp2/3 , N-WASP (neural Wiskott-Aldrich syndrome protein) в культурах гиппокампа увеличивает общее количество нейритов (Pinyol et al. 2007). В третьем исследовании экспрессия пептидов, которые предупреждают активацию комплекса Arp2/3 не оказывают эффекта на образование аксонов нейронов гиппокампа или общее количество дендритов (Strasser et al. 2004). В то время как специфическая роль комплекса Arp2/3 в инициации нейритов остается неясной, эти данные указывают, что инициация нейритов с помощью комплекса Arp2/3 зависит от точных уровней нуклеации сети разветвленного актина. Это подтверждается данными из культур не нейронов, демонстрирующих, что actin-capping белки, которые предупреждают полимеризацию колючего конца актина, могут вносить вклад в Arp2/3-обусловленное ветвление филамент (Bear and Gertler 2009; Skoble et al. 2001). Когда актиновые филаменты покрыты шапочкой (capped), большинство G-actin, как полагают, становится доступным для Arp2/3 нуклеации, вместо элонгации филамент и приводит к предпочтительному образованию сетей разветвленного актина; однако, если это так, то до какой степени anti-capping влияние Arp2/3-обусловливает ветвление, остается неизвестным (Akin and Mullins 2008; Korobova and Svitkina 2008; Mogilner and Rubinstein 2005).
F-BAR (Bin-Amphiphysin-Rvs) белки первоночаль были исследованы относительно их роли в эндоцитозе, но в последние годы, некоторые F-BAR белки, включая Cdc42-interacting protein 4 (CIP4), как было установлено, играют роль в выпячивании филоподий и ламеллиподий (Carlson et al. 2011; Guerrier et al. 2009; Lee et al. 2010; Saengsawang et al.2012). CIP4 является адапторным белком, который связывает негативно заряженные мембранные фосфолипиды посредством своего F-BAR домена и связывает активный Cdc42 посредством своего HR1 домена и др. ассоциированные с актином белки посредством своего SH3 домена (Aspenstrom 2009; Carnahan and Gould2003; Heath and Insall 2008; Roberts-Galbraith and Gould 2010). Избыточная экспрессия CIP4 в кортикальных нейронах приводит к образованию ламеллиподий вокруг тела клетки и ингибирует образование нейритов, тогда как CIP4 нулевые кортикальные нейроны инициируют нейриты вдвое быстрее, чем в контроле (Saengsawang et al. 2012). Этот эффект зависит как от F-BAR домена, который локализует CIP4 на ведущем крае ламеллиподий, так и от SH3 домена, который не функционирует посредством Arp2/3 комплекса и возможно действует посредством formins, чтобы нуклеировать и удлинять актин или Ena/VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) anticapping белки (Saengsawang et al. 2013). Эти данные демонстрируют, что в противоположность его роли в не-нейрональных клетках, CIP4 в нейрональных клетках, по-видимому, снижает образование нейритов посредством контроля ламеллиподий, а не путем регуляции эндоцитоза или образования филоподий.

Controlling actin polymerization and depolymerization in neurite formation


Актиновый цитоскелет также модифицируется путем контроля полимеризации колючего конца актина, приводя к образованию длинных актиновых филамент посредством anticapping белков, таких как Ena/VASP (rev. Menna et al. 2011). Полимеризация актиновых филамент происходит путем добавления G-actin к колючему концу, поэтому покрытие шапочкой (capping) колючего конца предупреждает полимеризацию (Menna et al. 2011). В модели de novo нуклеации, Ena/VASP, который располагается на плазматической мембране, инициирует образование филоподии путем поддержки роста актиновых филамент на мембране, превращающейся в длинное выпячивание (Breitsprecher et al. 2008). В модели конвергентной элонгации сети разветвленного актина реорганизуются в пучки, а фламенты внутри пучков защищены от capping с помощью Ena/VASP, чтобы формировать филоподию (Svitkina et al. 2003). Интересно, что связывающий в пучки актин белок fascin, который сам по себе несущественен для образования нейритов, может увеличивать эффективность полимеризации актина, связанной с Ena/VASP, указывая на возможную кооперативную роль между организацией актина и полимеризацией актиновых филамент при инициации нейритов (Winkelman et al. 2014; Yamakita et al. 2009). Культивируемые Ena/VASP-дефицитные кортикальные нейроны не продуцируют филоподий и соотв. нейритов, а вместо этого обнаруживают широкие ламеллиподии (Kwiatkowski et al. 2007). В то время как потеря экспрессии Ena/VASP предупреждает образование нейритов, эти эффекты могут быть смягчены путем культивирования нейронов на субстратах, способствующих образованию нейритов, таких как ламинин или фибробласты или путем экспрессии др. anticapping белков, таких как mDia2 или путем экспрессии myosin X, нешаблонного белка кончикового комплекса (Dent et al. 2007). Эти данные продемонстрировали, что несколько механизмов может быть использовано для генерации актинового цитоскелета филоподий, при этом сетевая регуляция полимеризации локализованного актина и нуклеации становятся ведущим принципом, а множественные актин регулирующие белки или пути могут приводить к одному конечному результату.
Актиновый цитоскелет является динамичной структурой, а изучение роли дополнительных актин регулирующих белков проиллюстрировало путь, который отвечает за баланс полимеризации актина, который может приводить к образованию нейритов. Нокдаун фактора, деполяризующего актин, (ADF)/cofilin, который способствует деполимеризации заостренного конца актиновых филамент и может также разъединять филаменты, ингибирует удлинение нейрита как у PC12 клеток, так и в нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) кур (Endo et al. 2007). Современная модель предполагает, что ADF/cofilin усиливает оборот актина, т.е. скорость, с которой филаменты подвергаются рециклингу в мономеры. Наблюдения на не-нервых клетках продемонстрировали, что ADF/cofilin располагается в основании разветвляющихся актиновых веточек во время выпячивания ламеллиподий, при этом разборка актина непрерывна в направлении тыльной стороны, тогда как актин добавляется на ведущем крае, демонтируя механизм, с помощью которого ADF/cofilin могут генерировать нейрит (Svitkina and Borisy 1999). Соотв., генетическое устранение ADF/cofilin серьезно нарушает появление нейритов на кортикальных нейронах in vitro и in vivo (Flynn et al. 2012). Исследование Flynn et al. (2012) предоставило также доказательства, что активность ADF/cofilin, обслуживающая актиновые филаменты, больше всего имеет отношение к его регуляции образования нейритов, чем к его роли в обеспечении деполимеризации заостренных концов филамент. Потеря активности ADF/cofilin имеет дальнейшие последствия для способности микротрубочек проникать на периферию тела клетки нейрона и создавать основу зарождающегося нейрита, возможно благодаря регуляции организации актиновых филамент на периферии тела клетки нейрона. Т.о., посредством регуляции динамики актиновых филамент во время ранних стадий образования нейритов, ADF/cofilin вносит вклад в регуляцию актиновых филамент и реорганизацию микротрубочек, необходимых для образования нейритов.
Противоположно к cofilin функцией обладает profilin, белок, связывающий актиновые мономеры, который способствует полимеризации актиновых филамент в разных типах клеток (Haarer et al. 1990; Haugwitz et al. 1994; Kang et al. 1999; Pantaloni and Carlier 1993; Verheyen and Cooley1994). Культивируемые нейроны гиппокампа от мышей, нокаутных по profilin IIa, обнаруживают больше, чем контроле, нейритов, а избыточная экспрессия вызывает противоположные эффекты, указывая, что profilin является негативным регулятором инициации и элонгации нейритов (Da Silva et al. 2003). Нокаутные мыши также обнаруживают повышенные уровни G-actin и меньше F-actin и противоположное наблюдается при избыточной экспрессии profilin в клетках (Da Silva et al. 2003). Эти данные по cofilin и profilin иллюстрируют, что баланс полимеризации актина и деполимеризации вносит вклад в формирование нейритов, возможно локально вокруг тела клетки нейрона.
Tropomyosins, которые образуют полимеры вдоль большой борозды актиновых филамент, могут индуцировать образование нейритов в клетках нейробластомы и могут взаимодействовать с несколькими актин-связывающими белками, подтверждая возможный механизм регуляции нейритов (Curthoys et al. 2013). Клетки млекопитающих обладают свыше 40 разными изоформами тропомиозина, некоторые из которых могут конкурировать с актин-связывающими белками, такими как fascin, который соединяет актин в пучки и способствует полимеризации актина или который увеличивает неактивную фракцию ADF/cofilin, когда избыточно экспрессируется в клетках нейробластомы (Bryce et al. 2003; Creed et al. 2011; Gunning 2008).
Myosin II является связывающим актиновые филаменты и генерирующим силы моторным белком, который может ингибировать или способствовать удлинению дифференцированных аксонов контекст-зависимым способом (Ketschek et al. 2007). Подавление функции myosin II в культивируемых нейронах переднего мозга кур способствует элонгации нейритов из тела клетки нейрона, но нейроны генерируют примерно на 20 % меньше нейритов (Kollins et al. 2009). В том же исследовании ингибирование активности RhoA, который управляет контрактильностью myosin II и многих др. эффекторных систем, как было установлено, увеличивает количество нейритов и их длину (Kollins et al. 2009). Эти наблюдения показывают, что функциональный результат индивидуальных финальных эффекторов (напр., myosin II) приводит к разным исходам по сравнению с инактивацией эффекторов, когда стоящие выше позитивные регуляторы также подавлены (напр., RhoA), которые вместо этого приводят к координированным изменениям функции множественных эффекторных систем.
Хотя многое предстоит открыть о функции этих актин регулирующих белков и способе, с помощью которого они специфически контролируют динамику актина во время формирования нейритов, полученные доказательства показывают, что их активность играет роль в балансе актина, на котором базируется удлинение нейритов. В целом, литература подтверждает, что нейроны могут использовать разные белки, регулирующие актиновые филаменты, чтобы контролировать инициальные стадии формирования нейритов. Однако, лежащей в основе темой является тема локальных различий в динамике актиновых филамент и организации, приводящих к локальному возникновению формирующегося нейрита. Основными недостающими компонентами являются динамика и организация актиновых филамент в телах клеток нейронов перед возникновением выпячивания (e.g., filopodia). Недавние микроскопические исследования высокого разрешения выявили новые формы организации актиновых филамент в зрелых аксонах (Xu et al. 2013).

Regulation of microtubules during neuritogenesis


Зрелые нейриты, как аксоны, так и дендриты, поддерживаются с помощью микротубулярного цитоскелета, состоящего из пучков микротрубочек. Удлинение микротрубочек в богатые актином филоподии является фундаментальной ступенью формирования нейрита. Первичной субъединицей микротрубочек является гетеродимер из одного α- и одного β-тубулинового полипептида и некоторые изоформы α- и β-tubulin обнаруживают повышенную экспрессию во время формирования нейрита и инициации нейрита с помощью NGF (Joshi and Cleveland 1989; Knoops and Octave 1997; Sullivan 1988). Тип III β-tubulin является единственной специфичной для нейронов изоформой; было также показано, что она фосфорилирована вследствие индукции образования нейрита с помощью NGF, но значение фосфорилирования неясно (Aletta 1996).
Микротрубочки могут удлиняться в филоподии за счет проникновения стабилизированных микротрубочек в богатые актином выпячивания или за счет полимеризации, оба эти процесса вносят вклад в созревание филоподий в нейриты в культурах как кортикальных, так и симпатических нейронов (Dent et al. 2007; Smith 1994). Экспрессия двигательных белков, базирующихся на микротрубочках, которые могут перемещать филаменты, такие как на "+ конец" направленный кинезин, достаточна, чтобы вызвать образование нейрит-подобной структуры в культивируемых клетках Sf9 насекомых, а возникающие в этих экспериментах нейриты обнаруживали полярные микротрубочки, напоминающие таковые в дендритах и аксонах в зависимости от двигательного белка (Sharp et al. 1996, 1997). Сходным образом, индуцированное с помощью microtubule-associated protein 2c (MAP2c) формирование нейритов зависело от на "- конец" направленного моторного белка dynein, а антитела, блокирующие функцию dynein в neuro2a клетках существенно подавляли образование нейрит-подобных выпячиваний (Dehmelt et al. 2006). Эти данные вместе с наблюдением, что максимальный эффект таксола, лекарства, стабилизирующего микротрубочки, заключается в 50 % ингибировании образования нейритов, подтверждают, что зависимая от моторных белков перестройка стабильных микротрубочек играет важную роль в формировании нейритов (Letourneau and Ressler 1984).

Regulation of microtubules by MAPs


Подобно динамике актина оба микротрубочки стабилизирующий белок, такой как MAP1b и дестабилизирующий белок, такой как stathmin-like 2, играют роль в инициации нейритов (Dehmelt et al. 2003; Li et al. 2009; Riederer 2007; Teng et al. 2001; Vandecandelaere et al. 1996). MAP1b, способствует нуклеации микротрубочек, полимеризации и стабилизации in vitro и in vivo, а siRNA нокдаун в PC12 клетках ингибирует инициацию нейритов, вызываемую NGF (Brugg et al. 1993; Pedrotti and Islam 1995; Takemura et al. 1992; Vandecandelaere et al.1996). Интересно, что специфичный для нейронов белок stathmin-like 2 (который может соединяться с микротрубочками, подавляет их сборку и вызывает разборку микротрубочек), когда избыточно экспрессируется в PC12 клетках, то увеличивает количество нейритов, а будучи подавленным в клетках гиппокампа приводит к тому, что аксоны обнаруживают меньшую способность к образованию, указывая, что необходим баланс полимеризации и деполимеризации (Riederer et al. 1997).
Помимо их роли в стабилизации микротрубочек, MAPs могут такде играть роль в их транспорте. Эмбриональная изоформа MAP2, MAP2c, экспрессируется в нейробластах перед образованием нейритов и запускает инициацию нейритов (Dehmelt et al. 2003). Получение изображений вживую этих neuro-2a клеток показало, что MAP2c запускает формирование нейритов за счет быстрого накопления и связывания в пучки стабильных связанных с MAP2c микротрубочек, а в нейронах гиппокампа потеря или в MAP2c домена, связывающего микротрубочки, или protein-kinase-A-binding домена в MAP2c нарушает формирование нейритов (Dehmelt et al. 2006). Экспрессия более высокого м.в. MAP2a и MAP2b изоформ обычно происходит после роста нейрита и во время созревания нейрона, хотя их экспрессия наблюдалась и в развивающихся нейробластах в optic tectum перед дифференцировкой в мультиполярные клетки; однако, роль MAP1a и MAP2b в отношении инициации нейритов в этом случае неизвестна (Matus et al. 1990; Schoenfeld and Obar 1994; Yasuda and Fujita2003).

Coordination of microtubules and actin during neurite formation


MAP2c также связывает актиновые филаменты посредством своего домена, связывающего микротрубочки; это обязательно для обеспечения образования нейритов, подтверждая, что MAP2C может физически связывать актин и цитоскелет из микротрубочек (rev. Dehmelt and Halpain 2004; Kim et al. 1979; Roger et al. 2004). Базируясь на данных не-нейрональных клеток и ростовых конусов Aplysia, эти взаимодействия указывают на то, что связь микротрубочек с сетью актиновых филамент позволяет моторным белка, таким как dynein или kinesin, использовать актин в качестве каркаса для перемещения микротрубочек и генерации сил, выпячивающих клеточную мембрану наружу (Dehmelt et al. 2006; Lu et al. 2013; Salmon et al.2002; Schaefer et al. 2002). Микротрубочки также наблюдались расположенными вдоль пучков актиновых филамент в ростовых конусах Aplysia, подтверждая, что пучки актиновых филамент в филоподии служат для отлавливания и направления движения микротрубочек во время ранних ступеней образования нейритов (Schaefer et al. 2002). После отрезания аксона, микротрубочки могут давить на мембрану и давать филоподия-подобные выпячивания и этот процесс может таекже происходить в присутствии лекарств, блокирующих полимеризацию актина (Goldberg and Burmeister 1992). Более того, инициация нейритов может происходить в присутствии лекарств, деполимеризирующих актин (Goldberg and Burmeister 1992; Lu et al. 2013). Эти данные показывают, что если актин в самом деле представляет сосбой каркас для двигательных белков, чтобы перемещать микротрубочки, оказывая давление на клеточную мембрану, то д. существовать функциональное перекрывание с использованием скольжения микротрубочек по микротрубочкам, чтобы генерировать силы, чтобы двигать мембрану и формировать нейрит (Lu et al. 2013).
Сходным образом, Drebrin, актиновые филаменты связывающий белок, регулирует динамику и актина и микротрубочек (Geraldo et al. 2008). Drebrin основным связывающим актин белком, экспрессирующимся в головном мозге во время формирования нейронов и играет роль в миграции нейронов и формировании нейрит-подобных выпячиваний (Dun et al. 2012; Dun and Chilton2010; Hayashi et al. 1996; Mizui et al. 2009). Drebrin соединяется со стороной одиночных актиновых филамент, где он конкурирует с белками, связывающими актиновые филаменты, такими как α-actinin, tropomyosin и fascin in vitro and in vivo (Biou et al. 2008; Ishikawa et al. 1994; Sasaki et al. 1996). Интересно, что в то время как Drebrin позитивного регулятора формирования нейритов, некоторые белки, связывающие актиновые филаменты, с которыми он конкурирует, также, по-видимому, позитивно регулируют инициацию нейритов, такие как α-actinin, которые при нокауте в клетках нейробластомы ингибируют формирование нейритов, а изоформы тропомиозина в случае избыточной экспрессии индуцируют формирование нейритов (Curthoys et al. 2013; Torii et al. 2012). В дополнение к этой активности, Drebrin также связывает регулятор микротрубочек EB3, белок, который соединяется с "+ концами" микротрубочек, подтверждая, что путем связывания EB3 с актином, Drebrin также целенаправленно воздействует на кончики микротрубочек в богатых актином филоподиях (Bazellieres et al. 2012; Geraldo et al. 2008). Эти исследования показали, что адапторные молекулы, связывающие микротрубочки с актиновыми филаментами, представляют основной регуляторный момент, рассматриваемый дополнением к полимеризации и организации.
Итак, эти исследования показали, что полимеризация и динамика микротрубочек, их организация (т.е. образование пучков) и моторными белками управляемые процессы координируются, чтобы вносить вклад в формирование компонента нейритов, микротрубочек. Как в случае с актиновыми филаментами, отсутствует полное понимание организации микротрубочек в телах клеток нейронов и во время инициальной ступени процесса формирования нейритов (Letourneau and Wire 1995). Эти исследования демонстрируют, что микротрубочки формируют сеть вокруг ядра и служат в качестве потенциальных организаторов аппарата Гольджи внутри тела клетки. Микротрубочки, ассоциированные с Гольджи, также дают пучки, вступающие в нейриты, возможно предоставляя непосредственный субстрат для механизмов, базирующихся на транспорте в нейриты. Однако, динамику и реорганизацию микротрубочек при переходе от круглых тел клеток к форме клеток, обладающей нейритами, ещё предстоит определить.

Extrinsic cues and signaling pathways underlying neurite formation


Внеклеточные сигналы, такие как NGF и brain-derived neurotrophic factor (BDNF), регулируют формирование филоподий, ламеллиподий и нейритов посредством нескольких общих сигнальных путей, которые контролируют цитоскелет (rev. Gonzalez-Billault et al. 2012; Jackson et al. 1996; Mai et al. 2009). Локальные градиенты кальция и cAMP/cGMP могут обеспечивать образование филоподий и рост нейритов в ответ на эти сигналы (Emery et al. 2014; Gysbers et al.2000; Mai et al. 2009; Shelly et al. 2010; Zheng and Poo 2007). В культивируемых клетках гиппокампа на полосках мембран-проницаемые флюоресцентные аналоги cAMP или cGMP демонстрируют, что локальные активности cAMP и cGMP достаточны, чтбы индуцировать образование аксонов и дендритов, соотв. (Shelly et al. 2010). GTP усиливает NGF-зависимое образование нейритов в клетках PC12 и увеличивает внутриклеточный кальций (Gysbers et al. 2000; Gysbers and Rathbone 1996a, 1996b). Этот эффект усиление нейритов ослабляется блокированием L-type кальциевых каналов или за счет предупреждения высвобождения внутриклеточного кальция из хранилищ, указывая, что кальций играет роль в инициации нейритов (Gysbers et al. 2000).
Добавление NGF к PC12 клеткам вызывает преходящую активацию GTPases Rac1 и Cdc42 периферии клетки и локализует циклическую активность на подвижном кончике филоподий (Aoki et al. 2004). Конституитивная активность Rac1 способствует образованию нейритов, а инактивации Rac ингибирует нейриты в нескольких типах клеток, включая первичные ретинальные нейроны кур и нейроны гиппокампа крыс (Albertinazzi et al. 1998; Schwamborn and Puschel 2004). Рекрутирование и активация Rac1 в выпячивания, богатые актиновыми филаментами, также ассоциированы со снижением GTPase RhoA, которая если постоянно активна может предупреждать BDNF-зависимую инициацию нейритов и вызывать ретракцию нейритов (Da Silva et al. 2003; Izawa et al. 1998; Katoh et al. 1998; Sebok et al. 1999; Yamaguchi et al. 2001). Очевидно, эти сигнальные пути тщательно регулируются и могут вызывать разные клеточные реакции при разных клеточных условиях. Напр., постоянно активные Rac1 и Cdc42, экспрессируемые волокнами гигантских нейронов Drosophila, ингибируют выросты нейритов, а доминантно негативный Rac1 может способствовать формированию нейритов в клетках DRG кур (Allen et al. 2000; Fournier et al. 2003). Эти данные подтверждают, что идеальные условия для инициации нейритов могут быть не просто продуктом конституитивно "on" или "off" GTPases, а скорее идеал инициации нейритов нуждается в специфической локализации GTPases или осуществляемой во времени циклической активности GTPases "on и off", которая может, напр., вызывать Cdc42, чтобы индуцировать добавочные аксоны в клетках гиппокампа (Schwamborn and Puschel2004). Эти исследования показали, что сигналы, способствующие образованию нейритов, конвергируют в несколько общераспространенных путей, Rac и Cdc42 становятся центральными регуляторами инициации нейритов, а Rho ингибирует инициацию нейритов и вызывает ретракцию нейритов. Однако, функциональные результаты активности этих GTPases д. рассматриваться в контексте дополнительных соображений, таких как временной контроль активации, тип клеток, субстрат т факторы роста.
Наиболее вероятный механизм, посредством которого передача сигналов neurotrophin может контролировать Rac1, Cdc42 и RhoA, подтвержден при получении изображений вживую формирования филоподий в аксонах DRG кур; это демонстрирует, что NGF усиливает образование микродоменов phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), которые локализуются совместно с флюоресцентно меченными участками актина, из которых возникают филоподии (Ketschek and Gallo 2010). TrkA является тирозиновой рецепторной киназой, которая активирует phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K), необходимую для активации с помощью NGF Rac1 и Cdc42 в PC12 клетках и для ингибирования RhoA (Aoki et al. 2004; Nusser et al. 2002). Сходным образом, передача сигналов BDNF посредством TrkB рецептора активирует PI3K, вызывает in vivo накопление PIP3 и увеличение подвижности дендритных филоподий и количество дендритов гиппокампа (Luikart et al. 2008). Передача сигналов PI3K может активировать Rac и Cdc42, которые являются вышестоящими мишенями для нескольких белков, модифицирующих цитоскелет, таких как Arp2/3 комплекс, которые рассматривались выше, и может играть роль в формировании нейритов (Derivery and Gautreau 2010; Gallo 2010). Итак, предполагаемый каскад для пути, что нейротрофины могут индуцировать нейриты, согласуется с: NGF/BDNF, TrkA/TrkB, PI3K, повышенным локальным PIP3 с повышением Cdc42 и Rac со снижением передачи сигналов RhoA. В то время как роли Rac1, Cdc42 и RhoA в качестве основных регуляторных пунктов в инициации нейритов в основном хорошо установлены, многое ещё предстоит определить, как и способ с помощью которого они специфически регулируют цитоскелет в инициируемом нейрите. Nakamura et al. (2008) выявили несколько линий доказательств относительно пространственно-временных паттернов PIP3, Rac1 и их активатора Vav, вместе с SHIP2 (SH2 domain-containing inositol phosphatase) в линии клеток PC12, чтобы генерировать количественную модель, согласующуюся с биологическими данными в отношении детерминации мест появления нейритов (Fig. 2). В этой модели активация TrkA, рецептора для NGF, приводит к формированию доменов активности PI3K-Vav-Rac1, которые первоначально гомогенны по периметру клетки. Однако, согласно реакционно-диффузионной системе Тьюринга при участии петли негативной обратной связи SHIP2 , PIP3 превращается в PI (3, 4) P2 в длинных боковых доменах, делая возможным образование локальных доменов активности PIP3-Rac1, чтобы сформировать места пониженной диффузии Vav. Экспериментальный анализ этой модели с использованием субклеточно локализованных activation/inactivation подходов, нацеленных на предполагаемый путь, необходим для тестирования этой интригующей модели.

Fig. 2 Hypothetical model for the formation of localized domains of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)-Rac1 signaling; these domains determine the sites of neurite formation from the cell body. a This model is derived from studies of nerve growth factor (NGF)-induced neurite formation from PC12 cells (for further details of this model, see the paper initially describing it by Nakamura et al. 2008). The model is based on the activation of PI3K and the antagonistic phosphatase SHIP2 by NGF (TrkA tyrosine kinase receptor-A,SHIP2 SH2 domain-containing inositol phosphatase). Initially, PI3K-driven increases in phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP 3 ) levels at the membrane drive the activation of Rac1 by Vav. Rac1 then signals back to PI3K and SHIP2 through positive (PI3K) and negative (SHIP2) feedback loops. The diffusion coefficient of SHIP2 is greater than that of Vav, consistent with the requirement for the negative and positive feedback loops in the context of a Turing's reaction-diffusion system (Aoki et al. 2005). b The function of the mechanism in a is to drive the initially homogeneous activation of the PI3K-Rac1 pathway (red) at the perimeter of the neuronal cell body into discrete domains of activation. The discrete domains are then able locally to drive the formation of neurites through the positive feedback loop, while suppressing formation elsewhere along the perimeter through the negative feedback loop

Organelle distribution during neurite formation


Митохондрии генерируют АТФ, который может использоваться локально вблизи митохондрий или диффундировать по цитоплазме, чтобы служить высоким потребностям в АТФ во время развития нейронов, например, для полимеризации актина (Bernstein and Bamburg 2003; Jones1986). Недавняя работа идентифицировала локальные функции митохондрий вдоль аксонов во время развития; сходная роль митохондрий может действовать в теле клетки, внося вклад в детерминацию мест образования нейритов (Courchet et al. 2013; Spillane et al. 2013; Sun et al. 2013; Tao et al. 2013). Местоположение митохондрий и их дыхание вносят вклад в определение мест аксонов, из которых будут появляться коллатеральные веточки (Courchet et al. 2013; Spillane et al. 2013; Tao et al. 2013). Образование коллатеральных веточек сходно с инициацией нейритов из тела клетки, оно инициируется появлением аксональной филоподии (Gallo 2010). Места образования аксональных филоподий, по большей части, детерминируются с помощью позиционирования митохондрий вдоль аксона и их дыхания (Ketschek and Gallo 2010; Spillane et al. 2013; Tao et al. 2013). Роль позиционирования митохондрий внутри тела клетки во время инициального образования нейритов не было тщательно изучено; однако, в культивируемых нейронах гиппокампа митохондрии были описаны, как располагающиеся в основании нейрита, предназначенного стать зрелым аксоном, за счет митохондрий, нацеленных на нейриты, которые д. дифференцироваться в дендриты (Mattson and Partin 1999). В др. исследовании, предпочтительное целенаправленное воздействие митохондрий на возникающий аксон наблюдалось в той же самой популяции нейронов, но не в агрегатах в основании аксонов (Ruthel and Hollenbeck 2003). Дальнейшее определение возможного вклада митохондрий в появление и дифференцировку нейритов было бы весьма интересным.
Подобно митохондриям изменение позиции центросомы и аппарата Гольджи, как было установлено, коррелирует с образованием нейрита в некоторых исследованиях, но взаимоотношения между этими органеллами и местами появления нейритов не было установлено (Caceres et al. 2012). Кроме того, эндоплазматический ретикулум может играть роль в формировании нейритов за счет локального высвобождения сигнальных компонентов, подобно тому, как активность Rac1 индуцирует фокальное высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума в ростовых конусах Aplysia (Zhang and Forscher 2009). Блокирование высвобождения кальция из внутриклеточных хранилищ ингибирует появление нейритов, а доставка пузырьков из эндоплазматического ретикулума может обеспечивать пространственную специфичность по доставке хранилищ кальция к месту инициации нейритов (Gysbers et al. 2000). Детерминация способа, с помощью которого индуцируется формирование нейрита с помощью разных внеклеточных сигналов, отличается по своим ответам на цитологическом уровне, на что указывают исследования N-cadherin-обусловленного формирования нейритов в культурах гиппокампа; в этом исследовании обнаружена корреляция между репозиционированием центросомы и Гольджи и формированием нейрита при контакте с кусочками покрытыми N-cadherin extracellular-domain, но не с кусочками с Tenascin C (Gartner et al.2012). Хотя четкая картина взаимоотношения распределения органелл и мест образования нейритов пока не установлена, это представляет интересный аспект для дальнейшего анализа.

Concluding remarks and perspectives


Taken together, the available information indicates the need for a consideration of the initiation of neurite formation at the systems level. Investigation of specific proteins will yield potential components of the mechanism of neurite initiation but as a system, the mechanism possibly utilizes various proteins with redundant functions. Although much is known about the way that single molecules control actin or microtubules, the next step will be to understand the means whereby these molecules act in concert to control neurite initiation. Several adaptors physically link actin filaments and microtubules that are necessary for neurite formation. However, much remains to be understood about the interplay between these two components of the cytoskeleton with regards to neurite formation; the provision of mechanical forces for growing or for moving microtubules and the flow of actin filaments are likely mechanisms. Several extracellular cues converge on central pathways mediated by the Rho GTPases. The GTPases Rac, Cdc42, and Rho control and organize both actin and microtubules to induce the formation of neurites. The next steps are to determine the manner in which these GTPases lead to the localized activation of key cytoskeletal regulators to initiate a neurite and to analyze further the reaction-diffusion model proposed by Nakamura et al. (2008). Ultimately, our understanding of the mechanisms that determine the way that microtubule- and actin-filament-based traffic regulate the early stages of neurite formation and coordinate with the underlying cytoskeletal remodeling will also need to be integrated into the spatio-temporal aspects of relevant signaling pathways (for a review, see Villarroel-Campos et al. 2014). As noted above, our understanding of the cytoskeletal organization of the neuronal cell body prior to neurite formation is lagging relative to that of neurons with established neurites. This information will be required in order to generate relevant models for the function of individual molecules, signaling pathways and molecular modules in the transformation of the periphery and center of the neuronal cell body during neurite formation. In addition, further investigation is needed to understand the role of membrane trafficking in neurite initiation, which can use actin-based Ena/VASP or Arp2/3 exocytosis mechanisms to drive neurite formation and might turn out to be a major requirement for neurite initiation (Gupton and Gertler 2010). An understanding of the regulation of the cytoskeleton at multiple levels and of its integration with cytoplasmic reorganization might not only illuminate the formation of neurites but also provide insights into the greater context of growth cone turning, axon branching and possibly the restoration of neurites after injury.