В данном исследовании мы идентифицировали Shriveled как ключевой фактор для сохранения целостности ниш и количества GSC в семенниках дрозофил in vivo. Мы показали, что Shv является секретируемым белком, который активирует передачу сигналов интегрина и тем самым контролирует уровни DE-cadherin. Поскольку предыдущие эксперименты подтвердили, что интегрин и DE-cadherin работают независимо на этапах, связанных с закреплением хаба и прикрепления к хабу GSC [19,26,28,29,37], соотв., но наши результаты вывявили тесную связь между активацией интегрина и уровнями DE-cadherin в hub клетках. Кооперация между передачей сигналов integrin и DE-cadherin может служить для гарантии поддержания трехмерной структуры хаба, способствуя взаимодействию между hub клетками и адгезии между GSC и hub клетками, после закрепления хаба. Более того, секреция Shv соматическими клетками и GSCs , с другой стороны, действовать как сигнал обратной связи для поддержания оптимума активности интегрина, экспрессии DE-cadherin и функциональности ниш стволовых клеток во время старения (смоделировано на Fig 7C).

Наши данные по иммуноокрашиванию выявили, что Shv обнаруживается во многих типах клеток и в разных местах клеток семенников дрозофил. Обусловленные сильными нарушениями фенотипа хаба у мутантов shv1 в апикальных кончиках обнаруживались несмотря на присутствие shv РНК во многих типах клеток, включая GSCs, белок Shv не был обнаружен внутри GSCs, но часто наблюдался на границах hub/GSCs или germ/cyst клетками. Всё это подтверждает высвобождение Shv во внеклеточное пространство, мы полагаем, что Shv эффективно секретируется в семенниках с помощью GSCs. В соответствии с этим экспрессия Shv в GSCs устраняет мутантный фенотип shv1, но не тогда, когда сигнальный пептид делетирован. Hub и CySCs также, скорее всего, секретируют Shv, т.к. он также присутствует на границах hub-hub или hub-CySC клетками, а экспрессия Shv, с использованием hub+cyst клеточного драйвера, устраняет мутантный фенотип. Итак, внеклеточный Shv может делать возможными многонаправленные коммуникации между разными типами клеток для поддержания ниш. Отметим, что неправильное расположение хаба не вызывает стерильности [26,27], мы также не с читаем, что структура и локализация хаба, наблюдаемые у мутантов shv1, вносят непосредственный вклад в стерильность юных мух. Принимая во внимание, что Shv обнаруживается также в ядрах сперматоцитов, то, скорее всего, Shv выполняет множественные роли во время сперматогенеза. Дальнейшие исследования функции Shv в ядре и факторов, регулирующих субклеточное распределение Shv приведут к лучшему пониманию его множественных ролей в семенниках и сперматогенезе Drosophila.

После высвобождения Shv активирует передачу сигналов integrin. Это подтверждается 1) генетическими данными, демонстрирующими взаимодействие между Shv и βPS integrin, и 2) данные in vitro показали, что внеклеточное воздействие Shv запускает integrin-зависимые изменения в pFAK, и 3) мутирование Shv в потенциальных сайтах взаимодействия с интегрином уменьшают его способность активировать передачу сигналов integrin. Базируясь на наших данных in vitro, что предварительная инкубация с RGD пептидом может блокировать способность Shv соединяться с integrin, мы предположили, что Shv может соединяться с группой Position Specific 2 (PSs) интегринов, что обеспечивается связыванием посредством RGD пептида. У Drosophila, предполагается, что αPS3, αPS4, αPS5 и одна из βPS субъединиц (mys) экспрессируются в гонадах [26,66]. Поэтому возможно, что одиночные клетки экспрессируют множественные интегриновые рецепторы, следовательно, возможны нарушения разных αPS субъединиц вместе с βPS, тем самым делается возможным связывание разных лигандов, чтобы способствовать адгезии в зависимости от времени и пространства. Более того, интегриновые рецепторы обладают разным сродством к разным лигандам. Можно предположить, что Shv действует, чтобы выполнить роль по модулированию, а не конкурировать за связывание с нормальным лигандом. Итак, наши результаты демонстрируют, что Shv является новым лигандом, который взаимодействует и активирует интегрины внеклеточно.

Наша находка, что Shv-зависимая передача сигналов integrin модулирует экспрессию DE-cadherin в hub клетках стала сюрпризом, поскольку эти две адгезивные молекулы, как полагают, действуют в разных путях, используемых для закрепления хаба и прикрепления GSC. Несмотря на это эффекты активации интегрина на уровни DE-cadherin в hub клетках, ранее не были исследованы, поскольку снижение уровней DE-cadherin в отдельности не влияло на расположение хаба [26], вклад DE-cadherin в закрепление хаба не был исключен. В самом деле, мы показали, что DE-cadherin вносит вклад в закрепление хаба, по-видимому, только когда функция интегрина нарушена. Более того, экспрессия DE-cadherin повышалась после внеклеточного воздействия Shv, но не тогда, когда интегриновые рецепторы молчали, указывая на непосредственные взаимоотношения между DE-cadherin и путем передачи сигналов integrin. Shv-зависимая активация integrin может приводить к усилению транскрипции и/или трансляции DE-cadherin скорее. чем к перераспределению положения DE-cadherin на клеточной поверхности. это подтверждается наблюдениями на S2 клетках, показавшими общее увеличение интенсивности DE-cadherin скорее, чем перераспределение в мембране вследствие инкубации с Shv. Кроме того, в соответствии с данными, что потеря DE-cadherin нарушает компактность хаба, а снижение DE-cadherin в хабе и CySCs ведет к потере hub клеток [28,31], shv1 мутанты обнаруживают фенотипические отклонения в компактности хаба, при этом hub клетки, по-видимому, оттаскиваются прочь от апикального кончика, и происходит постепенная потеря hub клеток во время старения. В самом деле, усиление активности DE-cadherin в семенниках shv1 успешно восстанавливает неправильное расположение хаба, а также структуру растаскивания хаба, подтверждая, что DE-cadherin находится ниже Shv, чтобы поддерживать функциональность структуры ниш стволовых клеток. Итак, скорее всего, зависимая от Shv активация интегринов усиливает экспрессию cadherin, это гарантирует соотв. межклеточную адгезию во время старения. Это может приводить к физическому барьеру, который вносит пассивный вклад в закрепление hub клеток путем снижения свободы (ease) в результате чего hub клетки могут перемещаться прочь от кончика. Заметим, что хотя активация интегрина и модулирует экспрессию cadherin, др. внутренне присущие и внешние факторы, скорее всего, также регулируют экспрессию cadherin независимым образом, особенно во время раннего эмбриогенеза. Это может объяснить, почему mys нулевые мутанты всё ещё обнаруживают нормальное образование GSCs вокруг неправильно расположенных hub клеток на эмбриональных стадиях[26]. Однако, некоторое снижение передачи сигналов integrin у взрослых приводит к зависимой от возраста потере хабов [26], как у мутантов shv1.

Идентификация нового активатора передачи сигналов integrin может иметь широкие последствия, поскольку интегрины участвуют в широком круге биологических процессов от развития до рака [67]. Интересно, что человеческий гомолог Shv, DNAJB11, недавно был идентифицирован при профилировании secretome как белок, как активируемый в в сквамозных клетках карциномы ротовой полости [68], а также секретировался во время активации реакции развертывания белка [52]. Кроме того, DNAJB11, как было установлено, секретируется у мышей и влияет на передачу сигналов integrin [51,69], подтверждая, что функции Shv могут быть эволюционно законсервированы. Мы установили, что активация Shv достаточна для сохранения количества hub клеток и GSCs, которые обычно снижаются при старении. Чтобы понять, как Shv действует для поддержания ниш, с другой стороны, помочь в будущем терапии стволовыми клетками, поскольку активация integrin с помощью Shv может в принципе усилить нашу способность оптимизировать ниши и способствовать жизнеспособности in vitro стволовых клеток после трансплантации.