Одонтобласты - это окончательно дифференцированные и поляризованные клетки, происходящие из краниального нервного гребня (Tziafas 1995; Ruch 1998). Они необходимы для синтеза и секреции внеклеточных матричных белков дентина (Ruch et al. 1995), который включает коллагеновые и не коллагеновые белки collagenous and non-collagenous proteins (NCPs) (Qin et al. 2007; Balic et al. 2010). Dentin Sialophosphoprotein (DSPP) и dentin matrix protein-1 (DMP1) относятся к NCPS и являются маркерами дифференцировки одонтобластов (Qin et al. 2007; Balic et al. 2010; Janebodin et al. 2011). Dental papilla cells (DPCs), предшественники одонтобластов обладают потенциалом дифференцировки в одонтобласты (Begue-Kirn et al. 1998; Tziafas & Kodonas 2010). Показано, что разные сигнальные молекулы (fibroblast growth factor, bone morphogenetic protein и wintless) транскрипционные факторы (KLF4, DLX3 и OSX) играют ключевые роли в этом процессе дифференцировки (Thesleff 2003; Arany et al. 2009; Lin et al. 2011; Duverger et al. 2012; Yang et al. 2014).
Транскрипционный фактор specificity protein 1 (SP1) является первым идентифицированным и клонированным членом семейства specificity protein/Kruppel-like factor (SP/KLF) (Philipsen & Suske 1999; Suske et al. 2005; Deniaud et al. 2009), которое содержит SP1-like подгруппу и две KLF подгруппы и обладающие типичными свойствами, включая домен регуляции транскрипции на N-конце и домен связывания ДНК с тремя Cys2His2 Zinc (Zn) пальчиковыми мотивами на C-конце (Kadonaga et al. 1987; Philipsen & Suske 1999; Suske et al. 2005). Предыдущие исследования показали, что некоторые члены SP/KLF семейства играют важные роли в развитии зубов. Напр., SP3 нокаутные мыши обнаруживают дефекты образования эмали из-а отсутствия белков эмалевого матрикса amelogenin и ameloblastin (Bouwman et al. 2000). SP7 экспрессируется во всех развивающихся костях и зубах и играет важную роль в дифференцировке остеобластов и одонтобластов (Chen et al. 2009; Yang et al. 2014). Наши предыдущие исследования установили, что KLF4 способствует дифференцировке одонтобластов путем связывания промотора Dmp1 (Lin et al. 2011, 2013b). Экспрессия SP1 существенно варьирует в разных типах клеток (Saffer et al. 1991). SP1 может регулировать экспрессию многочисленных генов благодаря взаимодействию с GC боксами посредством ДНК-связывающего домена и затем он играет важную регуляторную роль во многих биологических процессах, включая рост клеток, дифференцировку, апоптоз и иммунный ответ (Philipsen & Suske 1999; Deniaud et al. 2009). SP1, как было установлено, участвует в дифференцировке остеобластов, клеток нейронов и клеток хрусталика (Zhang et al. 2009; Gong et al. 2014; Guo et al. 2014).
Изучали участие SP1 в дифференцировке одонтобластов с помощью избыточной экспрессии и нокдауна SP1 в линии клеток из зубных сосочков. Показано, что SP1 способствует дифференцировке одонтобластов из клеток зубных сосочков.
Discussion
Ранее было установлено, что SP1 может способствовать дифференцировке некоторых типов клеток, таких как миобласты, клетки хрусталика и нейробласты (Yuan et al. 2013; Gong et al. 2014; Guo et al. 2014). Однако, известно, что SP1 может выполнять и негативную роль в эритроидной дифференцировке и дифференцировке адипоцитов (Tang et al. 1999; Hu et al. 2007). В данном исследовании мы установили экспрессию SP1 в дифференцирующихся одонтобластах in vivo и предположили, что SP1 может участвовать в регуляции дифференцировки одонтобластов.
Разнообразные транскрипционные факторы были изучены, чтобы установить молекулярные механизмы, лежащие в основе дифференцировки одонтобластов из DPCs (Kim et al. 2014; Kuzynski et al. 2014; Yang et al. 2014). В данном исследовании экспрессия SP1 во время дифференцировки одонтобластов была установлена с помощью иммуногистохимии в нижних резцах PN2 мышей. Наши результаты показали, что SP1 не экспрессируется в пре-одонтобластах, но экспрессируется на высоком уровне в поляризованных одонтобластах. Экспрессия SP1 постепенно усиливалась в одонтобластах на секреторной и зрелой стадиях.
Клетки зубных сосочков (DPCs) считаются предшественниками одонтобластов и обладают способностью дифференцироваться в одонтобласт-подобные клетки in vitro (Tziafas & Kodonas 2010). Ранее полученная линия из иммортализованных клеток зубных сосочков (mDPC6T клетки) была использована для изучения роли SP1 in vitro. mDPC6T культивировали в среде, способствующей дифференцировке одонтобластов в определенное время. DSPP, DMP1 и ALP рассматривались как маркеры дифференцировки одонтобластов (Narayanan et al. 2001; Fisher & Fedarko 2003; Zhao et al. 2011). Все эти три гена активировались после индукции дифференцировки одонтобластов, указывая, что mDPC6T клетки были дифференцированы в одонтобласты. Между тем мы установили, что экспрессия SP1 может играть важную роль в регуляции дифференцировки одонтобластов.
Вызывали избыточную или недостаточную экспрессию SP1 в mDPC6T клетках с помощью метода временной трансфекции. Было установлено, что уровень экспрессии SP1 значительно повышается при избыточной экспрессии SP1. Соотв. экспрессия DSPP и DMP1 явно увеличивалась как на уровне мРНК, так и белка. Активность ALP была увеличена в соотв. с увеличением экспрессии ALP мРНК. Происходило усиление активности этих специфических маркеров дифференцировки одонтобластов в mDPC6T клетках. Более того, формирование минеральных узелков подтверждало дифференцировку одонтобластов (Yu et al. 2007), т.к. минеральные узелки обнаруживались при окраске ализарином красным. Мы установили, что существенно возрастают после индукции и что SP1 усиливает потенциал минерализации mDPC6T клеток. С др. стороны, нокдаун SP1 снижает активность этих генов маркеров, а также образование минеральных узелков.
Итак, мы продемонстрировали, что экспрессия SP1 прогрессивно усиливается во время одонтобластной дифференцировки in vivo и in vitro. Избыточная экспрессия и нокдаун SP1 способствует и супрессирует одонтобластную дифференцировку mDPC6T клеток, соотв. Следовательно SP1 способствует одонтобластной дифференцировке клеток зубных сосочков.
