Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА ПЕРЕДНЕЙ НЕЙРОЭКТОДЕРМЫ



Передача сигналов Wnt-Nodal

Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.
Yaguchi J, Takeda N, Inaba K, Yaguchi S
PLoS Genet (2016), 12(4): e1006001. doi:10.1371/journal.pgen.1006001

When early canonical Wnt is experimentally inhibited, sea urchin embryos embody the concept of a Default Model in vivo because most of the ectodermal cell fates are specified as anterior neuroectoderm. Using this model, we describe here how the combination of orthogonally functioning anteroposterior Wnt and dorsoventral Nodal signals and their targeting transcription factors, FoxQ2 and Homeobrain, regulates the precise patterning of normal neuroectoderm, of which serotonergic neurons are differentiated only at the dorsal/lateral edge. Loss-of-function experiments revealed that ventral Nodal is required for suppressing the serotonergic neural fate in the ventral side of the neuroectoderm through the maintenance of foxQ2 and the repression of homeobrain expression. In addition, non-canonical Wnt suppressed homeobrain in the anterior end of the neuroectoderm, where serotonergic neurons are not differentiated. Canonical Wnt, however, suppresses foxQ2 to promote neural differentiation. Therefore, the three-dimensionally complex patterning of the neuroectoderm is created by cooperative signals, which are essential for the formation of primary and secondary body axes during embryogenesis.
Эмбриональные клетки некоторых животных обнаруживают тенденцию дифференцировки в нейроэктодермальные клетки/нейральные предшественники, независимо от того, получают ли они внешние сигналы, т.наз. модель по умолчанию (default) [1,2]. Эта характеристика приложима также к эмбриональным стволовым клеткам млекопитающих и индуцированным плюрипотентным клеткам (e.g., [3,4]). Следовательно, нормальное развития у таких организмов может быть перефразировано как молекулярные механизмы, репрессирующие инициальную нейроэктодермальную судьбу и направляющие его на дифференцировку в разные типы клеток. Члены семейства transforming growth factor-β (TGFβ) являются одной из групп хорошо описанных сигнальных молекул, выполняющих важные роли по детерминации судеб не нейроэктодермальных клеток. Среди них Chordin и Noggin, которые первоначально были описаны как нейральные индукторы, участвующие в защите инициальной нейроэктодермальной судьбы на дорсальной стороне позвоночных от поникающих сигналов bone morphogenetic protein (BMP), которые экспрессируются на вентральной стороне и которые специфицируют не нейроэктодермальные судьбы [2]. Wnts, др. тип секретируемых синальных молекул, также участвует в репрессии инициальной передней нейроэктодермальной судьбы. У позвоночных функционирующий сзади Wnt ингибирует гены спецификации передней нейроэктодермы, такие как otx2 и приводит к спецификации задней нейроэктодермы [5]. Итак, эти секретируемые сигнальные молекулы, регулирующие образование оси тела, действуют, чтобы супрессировать инициальную нейроэктодермальную судьбу во время раннего эмбриогенеза. Однако, несмотря на большое количество этих не нейроэктодермальных сигналов, эмбрионы всё ещё поддерживают нейрогенный регион в его соответствующем размере и локализации. Кроме того, внутри оставшейся изначально нейрогенной эктодермы, любая окончательная клеточная дифференцировка в точности контролируется, чтобы организовать сложную нервную сеть, т.е., формирование паттерна нейрогенной эктодермы чрезвычайно осложняется в ограниченной нейроэктодерме нормальных эмбриорнов.
Было предположено, что до воздействия передачи сигналов клеточная судьба у эмбрионов морского ежа также является передней нейроэктодермой, наз. animal plate (AP). Это показано в экспериментах, в которых самая ранняя каноническая передача сигналов Wnt (cWnt) подавлялась с помощью инъекции внутриклеточного домена cadherin (Δcad)? чтобы помешать локализации в ядре β-catenin, в результате большая часть эктодермы таких эмбионов оказывалась специфицированной как AP и дифференцировалась в серотонергические нейроны, а также др. типы нейронов и не нейрональных клеток (Fig 1A: [6,7]). Увеличение AP у ранних cWnt-дефицитных эмбрионов приводило к отсутствию формирования паттерна, а серотонергические нейроны оказывались разбросаны по всей AP. Напротив в ограниченной AP нормальных эмбрионов дифференцировка в серотонергические нейроны происходила только на дорсальном/латеральном крае, т.e., серотонергические нейроны не обнаруживались на вентральном крае и в центральной части (на переднем конце) в AP (Fig 1A), даже если большинство клеток , ограниченных переденей нейрогенной областью, обладало потенциалом серотонергических нейронов [8]. Nodal-BMP2/4, посредством передачи сигналов Smad2/3-1/5/8 вдоль дорсо-вентральной оси, является одной из сигнальных сетей, регулирующих спецификацию клеточных судеб и формирование паттерна в этом регионе (rev. [9]),но их транскрипционные факторы мишени оставались неизвестны. Итак, онтогенетические свойства AP эмбрионов морского ежа следующие: 1) серотонергическая нейрональная судьба приобретается только на дорсальном/латеральном крае нейроэктодермы, 2) передний конец (т.e., центральная часть) в AP не дифференцируется в серотонергические нейроны и 3) серотонергические нейроны не возникают на вентральном крае AP. Хотя информация относительно морфологических и феноменологических характеристик развития AP у эмбрионов морского ежа накапливается. но детали молекулярных механизмов, создающих внутренне присущую систему спецификации судьбы серотонергических нейронов на дорсальном/латеральном крае нейроэктодермы и что супрессирует нейральную судьбу в др. регионах, всё ещё не определено.



Fig 1. The pre-signaling state of most of the ectoderm is neurogenic and the region is patterned along the dorsal-ventral axis after restricted anteriorly. (A) A brief summary of the early cWnt-deficient embryonic phenotype, in which the initial (default) neuroectoderm covers most of the embryo and a number of serotonergic neurons are differentiated. In the drawings, the pink field and green spots indicate neuroectoderm and serotonergic neurons, respectively. (B-F) foxQ2 patterns during the embryogenesis of the sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus. foxQ2 is initially expressed at the anterior half (B) and gradually restricted to the anterior end by the blastula/gastrula stages (C-E). (F) foxQ2 is expressed ventrally in the restricted AP region in the early pluteus stage. Left is ventral (V) and right is the dorsal (D) side. Arrowhead indicates the position where foxQ2 gene expression is missing in the AP region. (G, H) FoxQ2 is required for the development of serotonergic neurons. Without FoxQ2, serotonergic neurons are not differentiated at 48 h (H) compared to control (G). (I-L) Sagittal section of the neuroectoderm field in a prism larva. Serotonergic neuron is differentiated at the dorsal edge of the AP and never includes FoxQ2 protein in its nucleus. Bar in (F) is 20 µm.

Серотонергические нейроны у эмбрионов морского ежа дифференцируются в AP в виде почти билатерального паттерна (Fig 1A: [9,10]). Среди транскрипционных факторов, которые экспрессируются в АР зигот, самым ранним является foxQ2. Базируясь на паттерне его экспрессии и предыдущих данных, FoxQ2 присутствует во всех клетках AP во время раннего эмбриогенеза (Fig 1B-1E: [11,12]), aи является важным для спецификации большинства типов клеток в регионе AP, включая серотонергические нейроны и апикальный пучок Hemicentrotus pulcherrimus (Fig 1G and 1H: [8,13]) и Strongylocentrotus purpuratus [12]. Однако, мРНК FoxQ2 исчезает с дорсального/латерального края нейроэктодермы, где дифференцируются серотонергические нейроны (Fig 1F, arrowhead: [13]), и белок не может быть обнаружен в дифференцированных серотонергических нейронах (Fig 1G-1J). Кроме того, FoxQ2 играет важную роль в формировании ресничек апикального пучка (tuft) посредством поддержания гена ankAT-1 на поздних стадиях [14]. Поскольку клетки апикального tuft не являются серотонергическими, то эти данные указывают на то, что FoxQ2 является первым, необходимым для спецификации большинства AP клеток [12] , но что его экспрессия постепенно супрессируется в клетках дорсального/латерального края AP, где приобретается судьба серотонергических нейронов. Т.о., идентификация регуляторных механизмов, формирования паттерна FoxQ2/foxQ2 вдоль дорсо-вентральной оси д. быть одним из ключевых для понимания того, как первоначальная нейрогенная эктодерма формирует паттерн во время эмбриогенеза у морского ежа.
Homeobrain (Hbn: LC064116 for Hemicentrotus pulcherrimus Hbn) является paired-подобным гомеобоксным геном, который относится к семейству homeobrain-like (hbnl) [15]. Паттерн экспрессии членов семейства описан у плодовых мушек [16], sandworm [15], морчкого ежа [17,18] и морских анемон [19], но ген hbn не идентифицирован в геноме хордовых. Паттерн экспрессии hbn впервые изучен у Drosophila melanogaster, где он первоначально появляется в передней дорсальной части зачатка головы, который образует части головного мозга и затем вентральный нервный тяж во время поздних стадий развития. У sandworms (Capitella sp. I), экспрессия hbn обнаружена в развивающемся головном мозге, как и плодовых мух и в их личиночных глазах. У морской анемоны Nematostella vectensis, hbn экспрессируется повсюду в бластодерме за исключением полоски вокруг бластопора и его экспрессия исключается из аборального полюса, где формируются апикальный tuft и последующая нейрогенная область. Паттерн экспрессии hbn у эмбрионов морского ежа определен во время секвенирования генома Strongylocentrotus purpuratus[17,18,20,21]. В этих исследованиях hbn первоначально экспрессируется в регионе анимального полюса на ст. ранней бластулы, на более поздних ст. он обнаруживается вне него и затем исчезает из AP, где экспрессируется foxQ2. Несмотря на сообщения о существовании гена у некоторых видов, контроль экспрессии м его молекулярная функция не изучены у всех животных. Здесь мы исследовали функцию Hbn, поскольку он экспрессируется в том же самом регионе, что и ген foxQ2 на ранней ст. спецификации AP. Мы описали роль Hbn в спецификации серотонергических нейронов и регуляцию экспрессии hbn и foxQ2 с помощью Wnt и TGF-β сигналов, важных для формирования точного эмбриональной AP у H. pulcherrimus.

Discussion


Хотя ряд генов были идентифицированы в нейрогенной эктодерме S. purpuratus [17,18,35], этого оказалось недостаточно, чтобы объяснить молекулярные пути, которые регулируют образование AP и нейральную дифференцировку. Наши данные показали, что экспрессия транскрипционных факторов внутри AP д. точно контролироваться с помощью внутренних и внешних молекул TGF-β и Wnt и сто эта регуляция важна для развития AP и нейронов. Мы также определили функцию Hbn в спецификации инициальной нейроэктодермальной судьбы. Вместе с функцией Hbn мы рассматривали функцию FoxQ2 в спецификации и дифференцировке нейрогенной AP. FoxQ2 первоначально необходим для спецификации большинства типов клеток в AP с помощью мезенхимы на ст. бластулы [12], но он не нужен позднее для нейральной дифференцировки, поскольку его функция заключается в поддержании экспрессии апикального tuft [13]. Следовательно, ключом к пониманию молекулярных механизмов, которые поддерживают и супрессируют инициальную нейроэктодермальную судьбу является регуляция, контролирующая эти два фактора транскрипции у эмбрионов морского ежа.



Fig 8. Models for anterior neuroectoderm patterning. (A) Schematic images of signaling pathways regulating foxQ2 and hbn expression. Anterior views. foxQ2 (green) is suppressed by cWnt mediated by Wnt7/LRP6 from the blastula to gastrula stages. Nodal inhibits the signal from the ventral side. Serotonergic neurons (blue) begin to be differentiated in the foxQ2-missing area, i.e., the dorsal/lateral edge of the AP. hbn (magenta) expression shifts towards the dorsal/lateral edge of the AP. Nodal and non-cWnt mediated by Wnt6/JNK signals regulate the suppression, whereas BMP2/4 promotes its expression. The dotted line indicates the dorsal border of the AP. MBL, mesenchyme blastula; early G, early gastrula; late G, late gastrula. (B) Summary of signaling pathways regulating the serotonergic neural fate at the dorsal/lateral edge of the AP. Before receiving extrinsic signals beginning from early cWnt, the cell fate of most cells in sea urchin embryos are the AP, which differentiates a number of serotonergic neurons. However, under normal conditions, five signals restrict its fate to a small region.

TGF-β signals regulate the dorsoventral patterning of the neurogenic ectoderm


Ранее сообщалось, что серотонергические нейроны в нейрогенной AP эмбрионов морского ежа формируются на дорсальном/латеральном краях региона [9,10] и что дифференцировка серотонергических нейронов на вентральной стороне супрессируется с помощью Nodal, который экспрессируется в вентральной части эктодермы [6]. Мы установили, что экспрессия hbn супрессируется с помощью Nodal на вентральной стороне, но поддерживается с помощью BMP2/4 на дорсальной стороне. Экспрессия hbn устраняется с анимального полюса, скорее всего, с помощью non-cWnt пути, обеспечиваемого с помощью Wnt6/JNK после ст. бластулы, а его экспрессия образует подковообразную форму (Fig 8A). Такой паттерн не описан у др. морского ежа, S. purpuratus [18], но у H. pulcherrimus, очевидно, что экспрессия отсутствует на вентральной стороне нормальной AP. Потеря функции Nodal подтверждает это наблюдение, поскольку Nodal морфанты имеют кольцеобразную форму экспрессии hbn вокруг нейрогенной эктодермы (Fig 4). Поскольку экспрессия foxQ2 также находится под контролем формирования вторичной оси с помощью Nodal и BMP2/4 путей (this study; [14]), пока неясно регулируется ли с помощью Nodal и/BMP2/4 непосредственно или косвенно и каковы цис-регуляторные модули foxQ2 и hbn.
У позвоночных передача сигналов TGF-β также функционирует в формировании паттерна нервной пластинки вдоль дорсо-вентральной оси тела [36]. Напр., bmp2 и bmp7 экспрессируются вне нервной пластинки и необходимы для развития норадренергических нейронов посредством индукции гомеодоменового белка, phox2a, у эмбрионов рыбок данио [37]. Nodal, с др. стороны, необходим для супрессии преждевременного приобретения передним мозгом характеристик у эмбрионов мышей [38]. Наши данные показывают, что эмбрионы морского ежа используют сходные механизмы для формирования паттерна нейроэктодермы, контроля времени и расположения дифференцировки серотонергических нейронов. Кроме того, поскольку имеются и др. типы нейронов на вентральной стороне AP у эмбрионов морского ежа [7], то будущие исследования д. выяснить взаимоотношения между клеточными факторами, характеризующими эти нейроны, а передача сигналов TGF-β, исходящая извне нейрогенного AP региона, позволит понять нам консервативные механизмы формирования нейрального паттерна во всем царстве животных.

Canonical and non-canonical Wnt signals regulate the anteroposterior patterning of the neurogenic ectoderm


Присутствие FoxQ2 и апикальных tufts в AP регионе у LRP6 морфантов строго показывает, что путь cWnt необходим для супрессии FoxQ2 и осуществляет выбор нейральной судьбы, хотя известно, что ранний cWnt, выявляемый с помощью ядерной локализации β-catenin, обнаруживается только в задней половине эмбриона вплоть до ст. гаструлы [22]. Наши результаты подтвердили, что Wnt7 работает как лиганд на LRP-cWnt пути в AP, который супрессирует FoxQ2 в точный момент времени (Fig 6). Хотя мы не может исключить возможность, что Wnt7 действует косвенно извне AP у нормальных эмбрионов, исходя из паттерна его экспрессии и строгой экспрессии wnt7 в утолщенной AP нормальных (Fig 6) и Δcad эмбрионов (S6E и S6H Fig) подтверждается, что он играет внутренне присущую роль в супрессии FoxQ2 в AP. Различие между LRP6 морфантами (abundant FoxQ2 and no serotonergic neurons) и Δcad эмбрионами (less FoxQ2 and a number of serotonergic neurons) может быть объяснено продолжительностью времени действия экзогенного Δcad мРНК и/или белка. Поскольку инъецированная мРНК, по крайней мере, сохраняется почти 24 ч (e.g., S8A и S8B Fig), то только ранний cWnt, но не поздний cWnt супрессируется у Δcad эмбрионов. Эта идея прекрасно подтверждается с помощью Top-Flash метода (Fig 6). Конечно, мы не можем полностью исключить, что только Δcad достаточен, чтобы блокировать все cWnt, даже на ранних ст. Поскольку экспрессия foxQ2 обнаруживает градиент с переднего кончика к периферии (Fig 1; [11]), то область наибольшего эффекта удаления foxQ2 с помощью Wnt7/cWnt может быть на краю AP региона, приводя к старту дифференцировки серотонергических нейронов в этой позиции, Ранее [31] было показано, что foxQ2 экспрессирующиеся в задней половине, где его ген никогда не обнаруживается с помощью гибридизации in situ у нормальных эмбрионов, если Axin экспрессируется эктопически, то обнаруживается, что foxQ2 исходно экспрессируется по всему эмбриону, а ранний cWnt супрессирует его в задней половине. Т.о., ожидается, что механизмы, супрессирующие экспрессию foxQ2 также действуют в AP регионе после того, как он ограничивается передним концом...
Путем комбинирования наших результатов в предыдущими исследованиями мы предполагаем следующие ступени передачи сигналов регулируют образование серотонергических нейронов на дорсальном/латеральном крае AP у эмбрионов морского ежа (Fig 8A and 8B): 1) задняя передача сигналов cWnt/non-cWnt ограничивает AP, которая специфицирована с помощью раннего FoxQ2, передним концом [6,31], 2) Wnt7/cWnt позднее супрессируют FoxQ2, это индуцирует апикальные пучки ресничек и репрессирует нейральную судьбу, по караю, ограниченному AP вдоль переднезадней оси, 3) дорсо-вентральное распространение Nodal супрессирует Wnt7/cWnt, чтобы поддерживать позднюю экспрессию FoxQ2 на вентральной стороне, 4) Wnt6/non-cWnt супрессируют нейральный спецификатор Hbn, предупреждая его экспрессию на переднем конце, и 5) BMP2/4 строго поддерживают экспрессию нейрального спецификатора Hbn на дорсальной стороне, в то время как Nodal супрессирует его на вентральной стороне. После ограничения AP регуляция экспрессии двух транскрипционных факторов с противоположной функцией, нейрального спецификатора Hbn и позднего нейрального супрессора suppressor FoxQ2, осуществляется с помощью молекулярных механизмов формирования нейрального паттерна в AP. Общение Wnts вдоль первичной оси и Nodal вдоль вторичной оси осуществляется во время процесса супрессии судьбы серотонергических нейронов на вентральной стороне AP. Хотя супрессии спецификатора нейронов, Hbn, на вентральной стороне, по-видимому, достаточно, однако, поддержание супрессора, FoxQ2, внутри того же самого региона существенно поддерживает систему, гарантируя устранения нейральной судьбы.
Мы не знаем, как Nodal путь контролирует размер всей AP посредством взаимодействий с передачей сигналов cWnt в AP. Поскольку wnt7 экспрессируется обильно в AP (Fig 6), Nodal путь может воздействовать на регуляцию его экспрессии, даже если сам Nodal может связывать рецептор в немногих рядах на вентральном крае AP. Кроме того, нижестоящие передачи сигналов Nodal факторы, напр., Lefty и BMP2/4, могут диффундировать в регион AP [12,14,23], и они могут взаимодействовать с путем cWnt прямо или косвенно, чтобы регулировать размер AP.
У S. purpuratus, имеются указания, что Nodal регулирует экспрессию foxQ2, контролируя транскрипционные факторы, Not и Emx. Их взаимоотношения, по-видимому, осложняются во время формирования пространственно-временного паттерна [57,58], и ни один из них не проанализирован у H. pulcherrimus. Однако, наши данные по потере и избыточности функции Nodal довольно воспроизводимы на этих стадиях (Fig 3), и даже у S. purpuratus Nodal морфанты имеют меньших размеров AP, подтверждая идею, что Nodal поддерживает экспрессию foxQ2 у эмбрионов морского ежа.

Exerting neural fate through FoxQ2 and Hbn functions


Пока мы не можем полностью получать культуры из единственной клетки и не можем утверждать, что по умолчанию (default) судьба клеток морского ежа является нейроэктодермальной или нейрональной. Однако, если самый ранний известный сигнал, cWnt, который действует в задней половине вначале ст. 8-16 клеток [59],блокируется, то почти вся область развивается в нейрогенную AP [31], указывая на то, что инициальная или pre-signaling судьба клеток морского ежа является передней нейроэктодермой. В пределах этой pre-signaling AP, эмбрионы дифференцируют ряд серотонергических нейронов, которые разбросаны по всей AP, в которой др. клетки продуцируются с длинными, неподвижными, апикальными tuft ресничками [12,13]. Устранение передачи сигналов Notch из AP способствует увеличению количества и образованию кластеров серинергических нейронов, указывая на то, что латеральное ингибирование в AP является др. сигналом, который ингибирует судьбы серотонергических нейронов у эмбрионов морского ежа [8]. FoxQ2 необходим для наделения инициальной судьбой серотонергических нейронов [12]. Однако, FoxQ2 является бифункциональным транскрипционным фактором, который необходим на ранней стадии для спецификации большинства типов клеток в передней нейроэктодерме, а затем он д. быть удален из поздних клеток, которые впоследствии принимают судьбу серотонергических нейронов [8,12-14]. По-видимому, первоначальная специфицирующая функция FoxQ2 может быть сходной с таковой для Zfp521 у эмбрионов мыши. Zfp521 экспрессирующиеся у зигот с помощью механизма, внутренне присущего клеткам, чтобы вызывать инициальную нейральную судьбу [60]. У морских ежей, однако, инициальная спецификация обеспечивается др. фактором, Hbn, поскольку функция FoxQ2 становится иной, которая действует против дифференцировки серотонергических нейронов после ст. бластулы. Итак, неизвестные механизмы, которые первоначально индуцируют foxQ2 и/или hbn на переднем конце эмбрионов морского ежа, и являются теми субстанциями, которые детерминируют инициальную клеточную судьбу, это будет выяснено в будущем анализом цис-элементов генов foxQ2 и hbn genes. Пока не опубликовано данных о функции Hbn в др. системах, но выяснение этих механизмов д. привести к ответу на вопрос, какова на самом деле изначальная (default) клеточная судьба эмбриона морского ежа и у др. организмов.