Мозжечковые granule cell precursors (GCPs) являются важной моделью развития нейронов и местом клинически важных онтогенетических аномалий. Пролиферация GCP является очень чувствительной к происходящему из клеток Пуркинье sonic hedgehog (Shh) в широком динамическом диапазоне [1-3]. Повышение или снижение передачи сигналов Shh может существенно менять динамику GCP, чтобы преобразовать мозжечок [4]. Соотв., независимая от лигандов передача сигналов Shh пути является распространенным признаком медуллобластомы, наиболее распространенной опухоли головного мозга у детей [5-7], и путь передачи сигналов Shh является предметом разработки терапевтического вмешательства [8-10]. Передача сигналов Shh осуществляется первичными ресничками, куда многие компоненты доставляются для создания сфокусированного сигнального модуля [11-14], она необходима для экспансии GCP [15]. Как передача сигналов Shh интегрируется с передачей сигналов, влияющих на пролиферацию, миграцию и дифференцировку GCP изучено недостаточно.
Посредством альтернативных взаимодействий со многими путями передачи сигналов и транскрипции, Zfp423 (и его человеческий ортолог, ZNF423) прекрасно расположен, чтобы интегрировать внеклеточные сигналы в когерентную онтогенетическую реакцию. Zfp423 впервые был описан (как Roaz) благодаря ингибирующему взаимодействию с EBF (Olf1) helix-loop-helix транскрипционными факторами [16]. Zfp423 является также коактиватором для активируемых с помощью BMP SMADs [17, 18], для рецепторов ретиноевой кислоты [19, 20] и Notch внутриклеточного домена [21]. Интересно, что активности Zfp423 на EBF и лигандами-активируемые факторы, по-видимому, оказывают взаимно ингибирующий эффект, подтверждая его функцию интеграции в сеть. ZNF423 также, по-видимому, является мишенью при некоторых раковых опухолях и обнаруживает низкую экспрессию в нейробластоме [20] или эпигенетическое замалчивание с помощью Polycomb repressive complex 2 в глиоме [22] , что ассоциирует с плохим прогнозом.
Hildebrandt с сотр. идентифицировали мутации в ZNF423 человека среди пациентов с диагнозом цилиопатия [30]. Пациенты из всех трех описанных ZNF423 семей обнаруживают гипоплазию червячка мозжечка или Joubert Syndrome, в то же время два имели также nephronophthisis и др. клинические проявления. Были выявлены эффекты мутаций пациентов на пролиферацию и реакцию на повреждения ДНК, представляющие новый патогенетический механизм проявлений цилиопатий, но не были исследованы структура или функции ресничек. Так воспроизводят ли мутации ZNF423 и Zfp423 фенокопии цилиопатий, действуя на нижестоящие события передачи сигналов, или представляют bona fide цилиопатии, затрагивающие функцию в ресничках вышестоящей передачи сигналов.
Полученные нами результаты проливают новый свет на
Zfp423-зависимые механизмы. Предложены совершенно отличные модели для гипоплазии мозжечка у
Zfp423 мышей и человека. Базируясь на экспрессии
Zfp423 gene-trap в постнатальных клетках Пуркинье, одна группа предложила клеточно неавтономный механизм, обусловленный снижением продукции Shh [25], т.е. обнаруживаются в некоторых клетках Пуркинье избирательные мутации [31]. Гибридизация
In situ , однако, выявила экспрессию
Zfp423 как в вентрикулярной зоне, так и в external germinal layer (EGL) развивающегося мозжечка, что целиком согласуется с GCP-intrinsic механизмом [23, 24]. Мы показали, что GCPs экспрессируют Zfp423 белок
in situ и в первичной культуре, потерявшей Zfp423 блокирование их способности отвечать на Shh, изменение морфологии ресничек, снижение транслокации Smoothened и увеличение экспрессии некоторых генов. связанных с ресничками. включая
Tulp3. Устранение избыточной экспрессии
Tulp3 восстанавливает частоту транслокаций Smoothened. Наши результаты демонстрируют прирожденную для GCP роль
Zfp423, стоящего выше передачи сигналов Shh и подтверждают избыточную экспрессию генов мишеней, таких как
Tulp3 как мишеней для улучшения функции клеток, дефицитных по
ZNF423/Zfp423.
Discussion
Наша работа предоставляет на головном мозге мышей и культурах клеток человека, впервые механистическую связь между фенотипами цилиопатии. вызываемой ZNF423/Zfp423, и функцией первичных ресничек. Поскольку тяжесть фенотипа и диапазон вовлечение органов варьируют, но гипоплазия червячка мозжечка составляет уникальный постоянный признак у описанных трех ZNF423 дефицитных пациентов [30] и при пяти Zfp423 мутациях мыши на разных линейных генетических фонах [23-26]. Предыдущая работа на мышах продемонстрировала потерю пролиферации предшественников [23], хотя место действия осталось невыясненным, то ли это внутренне присущие клеткам (potentially cell-autonomous) механизмы в клоне гранулярных клеток или клеточно неавтономные механизмы, обусловленные экспрессией Shh в клетках Пуркинье. Анализ модельных клеточных культур, ранее обнаруживших дефектные реакции на повреждения ДНК в качестве нового клеточного механизма действия мутаций ZNF423 у пациентов [30], но не были определены эффекты на первичные реснички и остался открытым вопрос, действительно ли ZNF423 может также действовать как вышестоящий в ресничке, чтобы регулировать её функцию, или как нижестоящий, смягающий её эффекты. Результаты, полученные здесь, демонстрируют роль для человеческого и мышиного гомологов функции в ресничке и внутренне присущего свойства предшественникам гранулярных клеток, действующих, по крайней мере, частично путем усиления экспрессии TULP3.
4 линии доказательств указывают, что Zfp423 является настоящим геном цилиопатии. Во-первых, рецессивная поте6ря функции и потенциально доминантные мутации дают фенотипы спектра цилиопатий, включая гипоплазию червячка мозжечка у мышей и людей, nephronophthisis у людей и разные степени др. последствий, которые могут отражать силу аллелей или генетические, средовые или стохастические модификаторы [23, 24, 26, 30]. Во-вторых, наш анализ изображений показал, что поскольку Zfp423-нулевые животные первоначально продуцируют реснички с нормальной частотой, потеря Zfp423 приводит к аномальному распределению морфологических отклонений. На изображениях с двумя маркерными белками реснички на мутантных клетках GCPs, в виде групп, выглядят более широкими вблизи основания (Figs 3 and 4), где располагаются некоторые белки Joubert Syndrome и nephronophthisis [45-48], и стремятся быть более длинными. Структуры в основании действуют, чтобы регулировать доставку сигнальных гурзов в и из реснички [49, 50]. Это поразительное отличие морфологии ресничек может быть объяснено измененным временным профилем динамичных состояний, т.к. диапазоны измерений в основном перекрываются между генотипами, несмотря на имеющиеся различия в распределении. Хотя возможно, что некоторая часть сдвига в Ac-αTub-базирующихся измерений может быть обусловлена изменениями в локальных концентрациях этой модификации у мышей, нокдаун ZNF423 у DAOY модели не столь драматически изменяет общий уровень Ac-αTub (Fig 5C). Кроме того, любое изменение локального уровня Ac-αTub может само по себе указывать на функциональное изменение динамики ресничек, т.к. ацетилирование стабилизирует микротрубочки аксонемы, а деацетилирование необходимо для разборки [51, 52]. В-третьих, передача сигналов посредством первичной реснички функционально дефектна после потери активности Zfp423 . Zfp423-истощенные первичные GCPs оказываются нечувствительными к экзогенному Shh (Fig 2). ZNF423-истощенные клетки DAOY медуллобластомы постоянно оказываются дефицитными в отношении транслокации в ресничку Smoothened (Fig 5) и IFT88 (Fig 6), которые необходимы для нормального процессинга передачи сигналов [12, 13, 53-55] и особенно для экспансии GCPs [15]. Снижение транслокации IFT88 также наблюдается в мышиных GCPs in situ (Fig 6), хотя наблюдаемая нами повышенная длина противоречит отсутствию или сильному укорочению ресничек, наблюдаемому в Ift88 дефицитных клетках [56, 57]. В-четвертых, мы нашли изменения в уровнях экспрессии ключевых компонентов ресничек, которое характерно для ZNF423-knockdown DAOY клеток и Zfp423-мутантных GCPs и указывает на нарушения передачи сигналов, по крайней мере, одного из тех, которые функционально важны и, скорее всего, обусловлены непосредственной регуляцией. TULP3 лучше всего подтвержденная мишень для Zfp423 в нашем анализе. TULP3 является ингибитором передачи сигналов Shh и потеря Tulp3 у мышей приводит к усилению передачи сигналов Shh [58-60]. На клеточном уровне, TULP3 регулирует поставки в реснички как с помощью ретроградного транспорта, так и с помощью проникновения в ресничку посредством её взаимодействия с IFT-A [61, 62]. ChIP эксперименты с первичными GCPs с двумя разными антителами против Zfp423 показали, достоверное обогащение сайта Tulp3 интрона 1, которое было предсказано ранее на модели культуры P19 клеток [32]. Функциональное устранение TULP3, вызываемое с помощью истощения ZNF423 в DAOY модели, в основном устраняет дефекты транслокации Smoothened в клетках с нокдауном ZNF423 (Fig 9).
Хотя Zfp423 необходим для митогенной реакции на Shh ex vivo, остаточная пролиферация в клетках с нокдауном и в EGL нулевых животных отличается от средней линии, показывая, что Zfp423 не является строго необходимым для всех митогенных реакций в GCPs. Более того, DAOY модель обнаруживает остаточную транслокацию IFT88 и Smoothened-EGFP в клетках с нокдауном. Одной из возможностей может быть то, что митогенный ответ GCPs является более чувствительным к потере Zfp423 при культивировании ex vivo, чем когда GCPs in situ или трансформированы в DAOY модели - поэтому неразумно ожидать, что внешнесредовые факторы и присущие клеткам различия будут иметь отношение к становлению клеточной линии и смогут усиливать пролиферативную реакцию. Напротив, (или дополнительно), может оказаться, что IFT-независимая диффузия Smoothened в ресничку [50] будет создавать умеренный уровень передачи сигналов, которая будет насыщенной на низких уровнях Shh, чем путь, зависимый от транслокации, что подтверждается различиями в чувствительности к Smoothened-EGFP и IFT88 локализации в ресничках DAOY клеток (Fig 6E).
Избыточная экспрессия Tulp3 может оказаться неожиданным кандидатом на роль ограничения транслокации Smoothened. Хотя Tulp3 противодействует передаче сигналов Shh, потеря Tulp3 не влияет на поставку Smoothened [61, 63]. Скорее Tulp3, как полагают, подавляет передачу сигналов Shh путем локализации Gpr161, чья активация повышает уровень cAMP, чтобы способствовать расщеплению Gli белков в их репрессорные формы [62]. Однако, этот хорошо задокументированный механизм базируется на на потере функции Tulp3 и он может обладать не только ингибирующим эффектом , когда Tulp3 экспрессируется существенно выше нормального урвоня, как ву случае ZNF423/Zfp423 дефицитных клеток (Figs 7 and 9). Избыток Tulp3 д. в принципе рекрутировать дополнительные ингибирующие молекулы в ресничку или титруют компоненты, ограничивающие поставку Smoothened, такие как Gprasp2 или Pifo [64, 65]. Также возможно, что избыток Tulp3 затрагивает состояние клеток способом, который косвенно влияет на транслокацию IFT88 и Smoothened или на концентрацию в первичной ресничке. Необходима проверка таких гипотез, которые не являются взаимно исключающими. Кроме того, поскольку Zfp423 вносит вклад в регуляцию нескольких генов, связанных с цилиопатиями, то полная степень молекулярных последствий, скорее всего, более сложна, а взаимодействия между аномально регулируемыми компонентами могут быть необходимы, чтобы полностью понять молекулярные механизмы в основе анатомических фенотипов у пациентов и модельных мышей.
Наши результаты обнаруживают определенное сходство с теми, что наблюдаются с цилиогенными транскрипционными факторами семейства RFX и Foxj1 [66, 67], но имеются и важные отличия. RFX белки крайне консервативные регуляторы, активирующие стержневые компоненты для образования подвижных ресничек, а потеря активности RFX приводит к потере или укорочению ресничек [68-72]. Foxj1 является геном мишенью для Shh, который также активирует компоненты, которые делают возможным формирование подвижных ресничек и которые достаточны для управления их образования, с дополнительными эффектами на первичные реснички при некоторых условиях [73-76]. Восстановление экспрессии генов мишеней частично ослабляет клеточные фенотипические отклонения [77]. Напротив, ZNF423 пациенты и Zfp423 мышиные модели имеют фенотипы более типичные для дефектов неподвижных ресничек, особенно при гипоплазии червячка мозжечка [23, 24, 30] и Zfp423 не обязателен для появления ресничек. Zfp423 необходим для эффективной передачи сигналов в ресничках клеток мозжечка и в клеточных моделях. Zfp423, по-видимому, модулирует компоненты, часто как негативный регулятор, и мы установили улучшение одного кле6точного фенотипа при ослаблении избыточной экспрессии лучше усего описанной мишени репрессии, TULP3, в DAOY клеточной модели.
Полученные результаты демонстрируют механизм передачи сигналов, комплементарный реакции на повреждения ДНК (DDR) Ю продемонстрированной Chaki et al. [30], для фенотипических отклонений нейронального развития у ZNF423-дефицитных пациентов и мышей, мутантных по ортологу Zfp423. Кроме того, представлена структурная и функциональная база для снижения передачи сигналов Shh в клетках гранулярных предшественников, наши результаты подчеркивают, что потеря Zfp423 репрессивной функции на Tulp3 и потенциально на др. гены является ключевым компонентом фенотипического отклонения.
