Посещений:
ДИНАМИКА МЕМБРАН



Секреторные и эндоцитические пути в сигнальной трансдукции

Membrane dynamics in mammalian embryogenesis: Implication in signal regulation.
Wada, Y., Sun-Wada, G.-H., Kawamura, N. and Yasukawa, J.
Birth Defect Res C,(2016), 108: 33-44. doi:10.1002/bdrc.21124

Eukaryotes have evolved an array of membrane compartments constituting secretory and endocytic pathways that allow the flow of materials. Both pathways perform important regulatory roles. The secretory pathway is essential for the production of extracellular, secreted signal molecules, but its function is not restricted to a mere route connecting intra- and extracellular compartments. Post-translational modifications also play an integral function in the secretory pathway and are implicated in developmental regulation. The endocytic pathway serves as a platform for relaying signals from the extracellular stimuli to intracellular mediators, and then ultimately inducing signal termination. Here, we discuss recent studies showing that dysfunction in membrane dynamics causes patterning defects in embryogenesis and tissue morphogenesis in mammals. Birth Defects Research (Part C) 108:33-44, 2016.
Эмбриогенез чрезвычайно запутанный сложный процесс, при котором различные клеточные активности контролируются, чтобы создать общую биологическую систему млекопитающих. Множество исследований посвящено изучению молекулярных механизмов сложных процессов развития, участвующих в становлении архитектуры многоклеточных организмов. Ряд ключевых транскрипционных факторов, которые специфицируют экспрессию набора нижестоящих генов, участвуют в эмбриогенезе и морфогенезе тканей (Tam and Loebel, 2007). Более того, клеточно-специфичные транскрипционные факторы непосредственно или косвенно регулируются сигнальными молекулами, которые ответственны за пространственные и временные параметры клеток. Транскрипционная регуляция и передача внутриклеточных сигналов участвует в организации многоклеточности путем регуляции клеточных активностей, таких как пролиферация, дифференцировка и тканевой морфогенез (Arnold and Robertson, 2009).
Помимо базовой схемы генетической программы недавние исследования выявили важность секреторной и эндоцитической активностей в качестве др. слоя механизма, ответственного за регуляцию и интерпретацию межклеточных и клетка-ткань коммуникаций (Polo and Di Fiore, 2006; Wada and Sun-Wada, 2013; Willnow et al., 2012). Секреторный путь является путем синтеза для построения клеточной поверхности и внеклеточных характеристик. Он также необходим для сборки эндоцитических компартментов, которые в основном участвуют в исправлении и деградации клеточной поверхности и экстраклеточных компонентов. Комбинация секреторных и эндоцитических активностей важна для приобретения новых характеристик посредством обновления и модификации различных молекул клеточной поверхности и внеклеточного окружения. Быстрое распознавание клеточных активностей, таких как метаболизм, форма клетки, полярность клетки и адгезия, путем деградации предсуществующих цитоплазматических и внеклеточных молекул, достигается посредством эндоцитического пути. У животных функция нейронов и иммунологические реакции - это два примера физиологического феномена, в котором секреторный и эндоцитический процессы вовлечены глубоко и важны (Sudhof, 1995; Takamori et al., 2006). Потребление питательных веществ и системное кровообращение сильно зависят от внутриклеточного и внеклеточного превращения макромолекул (Fisher and Howie, 2006; Gorvin et al., 2013). У высших растений, ощущение гравитации (gravitropism) нуждается в эндоцитических компартментах в клетках корешков (Morita et al., 2002; Hirano et al., 2011).

The Basic Mechanism of Membrane Dynamics in the Cell


Секреторный и эндоцитический компартменты обменивают свои материалы динамически. В большинстве случаев эти процессы обеспечиваются малыми мембранными компартментами, обозначаемыми как транспортные пузырьки. Эти пузырьки происходят из одного компартмента, путешествуют по цитоплазме к месту из предназначения и наконец сливаются с акцепторными компартментами (Fig. 1). Этот транспорт, обеспечиваемый покрытыми мембраной пузырьками (везикулярный транспорт) является фундаментальной клеточной функцией, поддерживающей клеточную архитектуру, даже у одноклеточных организмов, таких как дрожжи. Более того, молекулярные механизмы, контролирующие динамику мембран вдоль секреторных и эндоцитических путей высоко консервативны среди эукариот. Фактически, пионерские исследования генетики дрожжей расширили наше понимание базовых концепций динамики мембран, которые приложимы ко всем эукариотам, включая животных, растения и грибы. Figure 1. Vesicle-mediated transport sustains the membrane dynamics of cells. Transport vesicles are formed in one compartment (donor) by aid of coat protein complex, and fuse with another compartment (acceptor). This process is strictly controlled by the members of small GTP binding proteins, various coat proteins and their adaptor molecules, tethering protein complexes, and fusion factors. The vesicles are tagged by v-SNAREs (vesicle SNARE) and acceptor compartments are equipped with t-SNAREs (target SNARE). Selective pairing of the v- and t-SNAREs ensures correct recognition and ordered transport of materials.
Первой ступенью везикулярного транспорта является отпочкование части мембраны от компартмента (компартмента донора), чтобы сформировать небольшие покрытые мембранами пузырьки. Этот процесс нуждается в белках оболочки, которые обустраивают цитоплазматическую поверхность пузырьков. Сборка белков оболочки регулируется членами семейства Arf связывающих малых GTP. Сборка оболочки на цитоплазматической поверхности мембраны донора контролируется с помощью ряда добавочных белков, ассоциированных с белками оболочки. Эти дополнительные белки взаимодействуют со специфическим набором мембранных белков в доноре и рекрутируют их на место почкования. Во время этого процесса специфические белки отбираются и упаковываются в пузырьки для транспорта в др. компартменты мембраны.
Пузырьки затем транспортируются к месту предназначения, часто посредством цитоскелета. После прибытия пузырьки инкорпорируются акцепторные компартменты за счет слияния мембран пузырька и акцепторной органеллы, чтобы сформировать непрерывную мембрану. После слияния мембрана содержимое пузырьков высвобождается в просвет акцепторного компартмента. Этот процесс тщательно регулируется, а нарушение регуляции нарушает целостность клетки. Напр., несоответствуюшая доставка энзимов для деградации в в органеллу будет нарушать её функцию. Соответственно правильная комбинации пузырьков с акцепторными сайтом очень важна для везикулярного транспорта. В отличительных сайтах слияния мембран известен белковый комплекс как комплекс прикрепления, облегчающий спаривание (Nickerson et al., 2009; Schmitt and Jahn, 2009). Как только спаривание осуществляется с помощью закрепляющего комплекса, то rab малый GTP связывающий белок и белки SNARE (Ungar and Hughson, 2003) на акцепторном сайте и донорская мембрана способствуют слиянию мембран, чтобы сформировать непрерывную мембрану (Reese et al., 2005; Wickner, 2010).
Необходимо отметить, что специфичность транспорта тщательно регулируется на многих ступенях этого процесса (Fig. 2): отбор груза при отпочковании пузырька, отбор места предназначения в определенных субклеточных образованиях посредством цитоскелета и отбор места слияния, куда поставляются пузырьки. Каждый субклеточный компартмент специализируется с помощью определенных rab GTPases (Hutagalung and Novick, 2011), комплекса закрепления и белков SNARE (Schmitt and Jahn, 2009). Напр., ранние эндосомные компартменты обогащены rab5, комплексом закрепления CORVET и syntaxin-12 для SNAREs (Gorvel et al., 1991; Tang et al., 1998; Peplowska et al., 2007), когда как поздние эндоцитические компартменты являются местами для rab7, HOPS комплекса и syntaxins 7 и 8 (Mullock et al., 2000; Nakamura et al., 2000; Kawamura et al., 2012; Pols et al., 2013). Между тем белки могут участвовать на множественных отдельных ступенях. Напр., NEM-чувствительный белок слияния и его ко-фактор SNAP участвуют во всех ступенях слияния на секреторном и эндоцитическом путях (S?llner et al., 1993a, 1993b).

Figure 2. Secretory and endocytic membrane dynamics. The endoplasmic reticulum (ER), the Golgi apparatus, and plasma membrane are interconnected by vesicle mediated membrane transport. The endocytic pathway via early endosome provides routes toward digestive compartments, the late endosome, and lysosomes. Various molecules are involved in the complex membrane dynamics. The key molecules, whose functions are essential both at the subcellular levels and in the developmental context, are highlighted in this article (shown in red).

The Secretory Pathway for Signal Production


Различные сигнальные молекулы, способные к межклеточным коммуникациям, часто обозначаемые как лиганды, необходимы для клеточной дифференцировки и формирования паттерна тканей. Сигнальные молекулы, которые поддерживают внутриклеточные и/или внеклеточные обмены информацией, неизбежно секретируются во внеклеточное пространство и/или присутствуют на клеточной поверхности; поэтому они рассматриваются как секреторные белки. Секреторные белки синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и транспортируются на клеточную поверхность через аппарат Гольджи (Fig. 3). Секреторный путь представлен множественными наборами мембранных компартментов, в которых молекулы груза часто модифицируются с помощью пост-трансляционных модификаций, включая добавление углеводов, липидов и гликозилирование. Пост-трансляционная модификация является предварительным условием функционирования этих грузовых молекул, поскольку она предопределяет маршрут в направлении внеклеточного пространства. Более того, модифицированные молекулы сопровождаются шаперонами на специфических участках или во время всего процесса, прежде, чем они достигнут поверхности клетки.

Figure 3. Gallery of membrane organelles in the visceral endoderm, an epithelium (VE) in early embryo (Bielinska et al., 1999). VE is an epithelium overlying the epiblast of a pregastrulation rodent embryo. The VE develops numerous microvilli (mv) on the cell surface, reflecting their active endocytosis. Accordingly, many transport vesicles with coat (cv) are accumulated between the plasma membrane and tubuloreticular early endosomes (EE). Late endosome (LE) shows characteristic appearance with internal vesicles, and are thus referred to as multivesicular body (MVB). The lysosomal compartment in the VE is unusually large (not depicted here) (Wada, 2013; Wada et al., 2014). The VE cells contain organelles of the secretory pathway, the endoplasmic reticulum (ER), which are decorated by ribosomes, and the Golgi apparatus, which consists of a stack of multiple cisternae.

Posttranslational Modification in the Endoplasmic Reticulum


Внутриклеточный транспорт, также, как и функциональная способность сигнальных молекул, нуждаются в соотв. пост-трансляционных модификациях. Поэтому дефекты в системах модификаций часто вызывают неспособность к развитию из-за дисфункции определенных сигнальных каскадов.
Porcupine был идентифицирован у Drosophila в качестве гена, важного для развития насекомых (van den Heuvel et al., 1993). Porcupine является членом семейства связанных с мембраной O-acyl трансферазных белков, и необходим для добавления palmitoyl частицы к нескольким Wnt белкам. Эта ключевая липидизация (lipidation) в ER необходима для секреции лигандов во внеклеточное пространство (van den Heuvel et al., 1993;Takada et al., 2006; Chen et al., 2012). Porcupine-делетированные эмбрионы мыши обнаруживают дефекты гаструляции, из-за резкого снижения передачи сигналов Wnt (Barrott et al., 2011; Biechele et al., 2011). Секреция Nodal, важной сигнальной молекулы, участвующей в гаструляции, остаюется незатронутой, даже при потере porcupine, указывая, что porcupine необходим исключительно для Wnt модификации и секреции. Мутации porcupine вызывают генетический синдром, известный как formal dermal hypoplasia (FDH) у человека (OMIM: 305600) (Grzeschik et al., 2007). FDH наследуется как Х-сцепленный доминантный признак и затрагивает преимущественно женщин. Инактивация Х хромосомы происходит случайно во время раннего развития и как результат пациентки являются генетическими мозаиками относительно функции гена Porcn. Эти пациентки обнаруживают варьирующие уровни тяжести FDH. В этом отношении генетическая потеря функции Porcupine, по-видимому, не является клеточно автономной.
Подобно липидизации, добавление карбогидрата также является критическим для функции и локализации сигнальных молекул. Передача сигналов Notch участвует в организации нейрального эпителия. Notch является молекулой клеточной поверхности, которая воспринимает сигнал от молекул лиганда (delta/jagged), присутствующих на соседних клетках. Внеклеточный домен Notch рецептора модифицируется с помощью углевода фукозы и глюкозы. Модифицирующие энзимы, aka O-glycosyl трансферазы располагаются на ER и аппарате Гольджи. Notch рецептор без соотв. модификации с помощью O-сцепленного углевода, теряет функциональную компетентность из-за конформационных изменений, все же он может быть расположен на клеточной поверхности. Следовательно, в случае Notch, пост-трансляционная модификация необходима для рецепторной функции скорее, чем для транслокации вдоль секреторного пути. Генетическая потеря O-glycosyltransferase, которая кодируется с помощью Rumi, приводит к дефектам каскада передачи сигналов Notch у Drosophila (Acar et al., 2008).
У мышей ортолог Rumi, POGLUT-1, как было установлено, важен для развития нервной трубки, морфогенетического процесса, сильно зависящего от передачи сигналов Notch (Fernandez-Valdivia et al., 2011). Недавнее генетическое исследование выявило, что зависимая от POGLUT-1 пост-трансляционная модификация необходима не только для передачи сигналов Notch, но и также др. белков, участвующих в морфогенезе тканей (Ramkumar et al., 2015). Crumbs белки участвуют в предопределении клеточной полярности. Crumbs2 является субстратом для POGLUT-1, и его гликозилирование необходимо для собственно доставки на клеточную поверхность. Crumbs у POGLUT1 мутантных эмбрионов накапливается в ER. В этой связи потеря гликозилирования Crumbs и Notch по-разному влияет на их функции. Потеря экспрессии Crumbs2 в плазматической мембране приводит к аресту развития на ст. гаструляции, из-за тяжелых дефектов в эпителиально-мезенхимном переходе. Активность POGLUT-1 причастна к разным нарушениям у людей, таким как Dowling-Degos disease 4 (OMIM 61596), аутосомно доминантному генетическому нарушению, которое характеризуется гиперпигментацией кожи (Basmanav et al., 2014). Более того, его избыточная экспрессия часто ассоциирует с канцерогенезом (Ma et al., 2011; Chu et al., 2013; Jin et al., 2014). Побудительные механизмы могут быть разными для каждого патологического состояния, поскольку не только Notch, Crumbs, но и др. белки, скорее всего, являются субстратами для этого энзима гликозилирования.
Fibroblast growth factors (FGFs) образуют большое семейство секреторных белков. FGF связываются с рецепторами клеточной поверхности FGFR, приводя к активации присущей receptor tyrosine kinase (RTK), индуцируя тем самым активность mitogen-activated protein kinase (MAPKs) посредством ras малых GTPases. FGFs учатствуют в самых ранних стадиях развития позвоночных и беспозвоночных. Особенно критическую роль играют FGFs в эпибласте и в дифференцировке первичной энтодермы во внутреннюю клеточную массу бластоциста и на более поздних стадиях при индукции мезодермы и организации задних тканей во время гаструляции. Их функция необходима на дальнейших стадиях, во многих временных моментах, включая нейральное развитие и морфогенез конечностей. FGFs обнаруживают сродство к гепарину. Они соединяются с heparan sulfate proteoglycans (HSPG) из внеклеточного матрикса. Взаимодействие FGF-HSPG указывает, что секретируемые сигнальные лиганды сохраняются локально скорее, чем диффундируют по ткани. Сердцевина HSPG сильно гликозилируется с помощью множественных ступеней во время транслокации через аппарат Гольджи. Ферментативные комплексы Ext1 и Ext2 ответственны за удлинение углеводов, приводя к генерации цепочек из heparan sulfate сахаров. Мутантные мыши, лишенные белка Ext2, лишены и функционального HSPG, и одновременно дефектны по формированию паттерна FGF сигнальной активации, это в конечном счете приводит к дезорганизации формирования паттерна вне-эмбриональной эктодермы на стадии после гаструляции (Shimokawa et al., 2011). Это наблюдение четко подчеркивает важную роль модификации белков секреторного пути, которые участвуют в становлении пространственно-временного контроля передачи сигналов FGF у развивающихся эмбрионов. HSPG, как было установлено, также контролирует др. межклеточные сигнальные пути, включая Tgf-β, Wnt и Notch, и в in vitro экспериментальных системах, хотя его значение для становления тканей еще предстоит установить.

Retention in the Endoplasmic Reticulum as Negative Control for Signal Production


Системы модификаций для определенных сигнальных каскадов работают в секреторных системах. ER белок, наз. MESD способствует укладке низкой плотности lipoprotein receptor proteins (LRPs). Собственно, укладка LRP является предварительным условием для их выхода на более поздних стадиях на секреторный путь, и функция MESD необходима для их доставки на клеточную поверхность. MESD считается (молекулярным) шапероном. LRP5 и LRP6 являются ко-рецепторами Wnt лигандов и их потеря с клеточной поверхности приводит к тяжелым дефектам канонической передачи сигналов Wnt, которая, по крайней мере, частично ответственна за арест процесса гаструляции (Hsieh et al., 2003). Дефицит MESD влияет на локализацию др. LRPs (Lighthouse et al., 2011); следовательно, Mesd фенотип может отражать множественные дефекты, вызываемые нарушениями функции белков семейства LRP (Hsieh et al., 2003).
Shisa является расположенным в ER белком, взаимодействующим с Wnt рецептором белком Frizzled, чтобы подавлять его выход из ER (Yamamoto et al., 2005). Следовательно, Shisa действует как негативный регулятор пути передачи сигналов Wnt клеточно-автономным способом. Shisa взаимодействует с FGFR в дополнение к рецептору Frizzled: так что его избыточная экспрессия также противодействует передаче сигналов FGF/MAPK. Точный механизм, лежащий в основе того, как ER завлекает Shisa-Frizzled и FGFR понятен не до конца. Интересно, что экспрессия Shisa сильно ограничена передней эктодермальной тканью у мышей и лягушек (Furushima et al., 2007). Его экспрессия находится под контролем регулятора транскрипции OTX2, важного, индуцирующего голову, ткане-специфичного гена, это подтверждает, что экспрессия Shihsa ограничена передней эктодермой. Следовательно, его функция может быть высоко специализированной для регуляции внутриклеточного транспорта Wnt- и FGF-рецепторов скорее, чем для общей функции, необходимой для секреции или модификации белков.

The Sorting Center, Golgi Apparatus, in Development


Белки, транспортируемые на клеточную поверхность или в эндоцитические компартменты, посылаются в аппарат Гольджи, где происходят их экстенсивные пост-трансляционные модификации (Fig. 3). Члены семейства Rab малых GTP связывающих белков распределены по специфическим субклеточным местам и регулируют разделение, слияние и взаимодействия мембран посредством цитоскелета отдельных субклеточных мест расположения. Rab6 специфически ассоциирует с аппаратом Гольджи и участвует в токе через мембрану этого компартмента (Miserey-Lenkei et al., 2010). Нокаут функции Rab6 у эмбрионов мыши приводит к эмбриональной гибели перед гаструляцией (Bardin et al., 2015). Остается интересным вопрос, специфический ли сигнальный каскад или межклеточные взаимодействия затрагиваются при потере ассоциированного с Гольджи rab6 белка.
Rab8 малый GTP связывающий белок ассоциирует с компартментом Гольджи и участвует в целенаправленном транспорте из Гольжи на клеточную поверхность (Fig. 2). Как было установлено, изоформа rab8 (rab8b) контролирует интернализацию Lrp6 Wnt рецепторного белка. RNAi подавление rab8b приводит к снижению передачи сигналов Wnt3 in vitro. Ингибирование rab8b с помощью инъекций morpholino подавляет передачу сигналов Wnt у эмбрионов рыбок данио (Demir et al., 2013). У мышей функция rab8, как было установлено, необходима для становления и поддержания полярности эпителия (Sato et al., 2007). Более того, функция rab8 участвует в клеточных перемещениях посредством взаимодействия с актиновым цитоскелетом (Hattula et al., 2002) и сборкой первичных ресничек (Hattula et al., 2006; Knodler et al., 2010). Первичные реснички участвуют в восприятии различных стимулов, включая механические воздействия и хемокины (Goetz and Anderson, 2010; Yoshiba and Hamada, 2014). Однако, у мышей нокаут функции rab8 не вызывает тяжелые фенотипические отклонения от имплантации до родов (Sato et al., 2014, 2007). Отсутствие видимого фенотипического отклонения во время развития оставляет незаполненным пробел между находками in vitro и генетическим фенотипом на уровне ткани/органа.

Endocytic Compartments and Developmental Program: Positive- and Negative Regulation of Signaling Cascades


Эндоцитический путь является другим основным путем тока через мембрану, который соединяет клеточную поверхность с внутриклеточными органеллами, которые содержат набор ферментов для деградации макромолекул (Kornfeld and Mellman, 1989). Клеточная поверхность и внеклеточные компоненты транспортируются внутрь клетки посредством этого пути (Fig. 2). Путь эндоцитической активности и секреторный путь, т.о., участвуют в модификации и обновлении клеточной поверхности и внеклеточных характеристик, которые очень важны для межклеточных взаимодействий и морфогенеза тканей во время эмбриогенеза (Wada et al., 2014).

Two Pathways From the Plasma Membrane to the Endosomes


Эндоцитический путь, по-видимому, участвует не только в поддержании динамических изменений клеточных характеристик, но и также непосредственно участвует в передаче клеточных сигналов (Miaczynska et al., 2004; Le Borgne, 2006; Polo and Di Fiore, 2006; Chen, 2009; Willnow et al., 2012). Комплекс клеточной поверхности и часть плазматической мембраны инвагинируют в цитоплазму (почкуются), и отсоединяются от клеточной поверхности, чтобы создавать небольшие мембранные органеллы. Инициальная степень эндоцитоза, интернализация плазматической мембраны, использует , по крайней мере, два разных механизма, которые рекрутируют разные субнаборы цитозольных белков. Clathrin-обеспечиваемый эндоцитоз является классическим путем интернализации, при котором часть мембраны, включая фосфолипиды и мембранные белки, инвагинирует внутрь путем добавления белкового комплекса клатрина и адапторных белков для клатрина (Boehm and Bonifacino, 2001). Генетические дефекты этого пути приводят к гибели эмбрионов на очень ранней ст. развития (Mitsunari et al., 2005).
Др. эндоцитический маршрут не зависит от клатринового комплекса, но нуждается в др. белке, известном как кавеолин (Hommelgaard et al., 2005). В плазматической мембране, также как в мембранах др. органелл, имеется определенный мембранный домен, богатый холестеролом и сфинголипидами. Этот микродомен клеточной мембраны также обогащен glycosylphosphatidyl inositol (GPI) модифицированными белками, включая различные сигнальные рецепторы для цитокинов и иммунных компонентов (Simons and Toomre, 2000; Helms and Zurzolo, 2004). Богатые холестеролом микродомены инвагинируют в цитозоль формируя структуру в форме бокала и затем приобретают фляго-подобную морфологию. Эта структура обозначается как кавеола и она содержит присущий мембране белок кавеолин. Млекопитающие экспрессируют три кавеолина (Cav-1, 2 и 3) с тканевой специфичностью: Cav-1 и Cav-2 экспрессируются повсеместно, тогда как Cav-3 обнаруживает ограниченный паттерн экспрессии в мышцах и астроцитах (Razani et al., 2002a; Schubert et al., 2007).
Несколько исследований подтверждают, что некоторые сигнальные каскады, включая TGF-β, BMP, Wnt и MAPK, интернализуются посредством кавеолиновго эндоцитоза, чтобы продуцировать разные исходы посредством зависимого от клатрина пути (Di Guglielmo et al., 2003; Nohe et al., 2005; Hartung et al., 2006; Sprenger et al., 2006). Рецепторы клеточной поверхности, такие как epidermal growth factor receptor (EGFR), также обнаруживаются в ассоциации с микродоменом плазматической мембраны, где их тирозин киназы становятся не активированными (Couet et al., 1997; Waugh et al., 1999; Lajoie et al., 2007). Помимо каскадов передачи сигналов с участием секретируемых внеклеточных лигандов, класс молекул, находящихся на клеточной поверхности, известен как преимущественно ассоциированный с мембранным микродоменом. Изоформа neural cell adhesion molecule (N-CAM) модифицируется с помощью GPI; поэтому она обогащена в микродоменах (Niethammer et al., 2002). Др. молекула клеточной адгезии, интегрин, также ассоциирована с микродоменом на клеточной поверхности (Krauss and Altevogt, 1999).
Эти результаты подтверждают, что микродомены мембран и зависимая от кавеолина интернализация обеспечивают основную регуляторную функцию в развитии тканей и органов посредством регуляции межклеточных коммуникаций и посредством секреторных сигнальных молекул (Sprenger et al., 2006; Yamamoto et al., 2006; Sakane et al., 2010). Однако, их значение в контексте развития остается неясным, поскольку отсутствует фенотипическое отклонение после генетической инактивации важных компонентов этого класса эндоцитоза. В отличие от клатрина и родственных ему белков, генетическая потеря кавеолина не приводит к серьезным последствиям в развитии мышей (Le Lay and Kurzchalia, 2005). Мутантные животные с компаундным генотипом, лишенным Cav-1 и Cav-2 развиваются нормальными и плодовитыми (Razani et al., 2001,2002a,2002b).

The Early Endosome as Platform of Signal Transduction


Как только компоненты клеточной поверхности появляются внутри клетки в виде небольших пузырьков, они транспортируются в определенный компартмент мембраны, известный как ранние эндосомы (Fig. 3). Многие исследования подтвердили, что активация цитозольных трансдукторов с помощью рецепторы-лиганды происходит на цитозольной стороне ранней эндосомы скорее, чем на плазматической мембране, где формируется комплекс рецептор-лиганд. Напр., активация канонического пути передачи сигналов Wnt необходима на ранней стаадии эндоцитоза (Blitzer and Nusse, 2006). Передача сигналов TGF-β базируется на разных исходах (активация Smad2 или Smad3) с помощью разных эндосомных компартментов (Di Guglielmo et al., 2003; Felici et al., 2003).
Компартменты мембраны, представляющие эндоцитический путь и пост-Гольджи секреторный путь обладают общими свойствами: их внутренность (просвет) переменно кислый (Mellman et al., 1986). Ацидификация внутри этих органелл достигается с помощью vacuolar-type proton-translocating ATPase (V-ATPase), крупного белкового комплекса, который управляет активным притоком протонов из цитозоля в сочетании с гидролизом АТФ (Sun-Wada and Wada, 2010). V-ATPase является древним насосом протонов, обнаруживаемым у всех эукариот, включая животных, растения и грибы, и его функция важна для развития мышей на ст. до и после имплантации (Sun-Wada et al., 2000). Аппарат Гольджи и ранние эндосомы являются менее кислыми компартментами по сравнению с лизосомами, который обнаруживают высокую кислотность (~pH 5 или менее), тогда как поздние эндосомы обладают умеренной кислотностью (pH 6) (Futai et al., 2000). Ацидификация внутри аппарата Гольджи на секреторном пути нуждается в пост-трансляционной модификации белков. Генетические дефекты располагающейся в Гольджи V-ATPase ответственны за синдром cutis laxa type 2, болезнь соединительной ткани, обусловленную гипогликозилированием различных внеклеточных белков (Kornak et al., 2008). Ацидификация внутри лизосом и поздних эндосомах предоставляет энергию для транспортировки малых молекул через мембраны органелл и также поддерживает субстрат протонов для гидролиза макромолекул, таких как белки, полисахариды и олигонуклеотиды (Sun-Wada and Wada, 2013).
Вероятно, что комплекс лиганд-рецептор подвергается существенным конформационным изменениям после доставки в ранние эндосомы и воздействию слегка кислого окружения. Эта индуцированная кислотностью конформация может вносить вклад в эффективную передачу сигналов из интернализованных комплексов лиганд-рецептор цитозольным трансдукторам (Sun-Wada and Wada, 2015). Кислое окружение внутри лизосом, как полагают, помогает диссоциации лигандов от рецепторного комплекса. Для потребления питательных веществ низкой плотности липопротеины получаются с помощью эндоцитоза вместе с их рецепторным комплексом и транспортируются в ранние эндосомы, где лиганды и рецепторы диссоциируют после изменения pH. В этих сценариях рецепторный комплекс подвергается структурным альтерациям после транспорта в ранние эндосомные компартменты. Было показано, что Atp6ap2, (aka (pro)renin receptor), фактор сборки V-ATPase (Kinouchi et al., 2010), необходим для активации канонического пути Wnt (Cruciat et al., 2010). Без белка Atp6ap2 V-ATPase собственно не функционирует, приводя к де-ацидификации эндоцитических компартментов (Kinouchi et al., 2010; Oshima et al., 2011; Kurauchi-Mito et al., 2014). Ингибирование экспрессии Atp6ap2 у эмбрионов Xenopus приводит к дефектам развития передних структур, обусловленное снижением канонической передачи сигналов Wnt . Atp6ap2 взаимодействует с Wnt рецепторным белком Lrp6, обнаруживая тесную физическую ассоциацию части V-ATPase комплекса с каноническим сигнальным комплексом Wnt (Cruciat et al., 2010). Недавнее исследование показало, что Atp6ap2 также необходим для становления клеточной полярности (Kanda et al., 2013), подтверждая, что функция V-ATPase широко используется в тканевом морфогенезе.
Др. возможность заключается в том, что физическое окружение в эндосомных мембранах может способствовать передаче сигналов от активированного рецептора к цитозольным медиаторам. В небольшом мембранном компартменте, изгиб мембраны значительно круче по сравнению с плазматической мембраной. Геометрическое позиционирование сигнального комплекса вызывает локальную концентрацию лигандов и рецепторов, это может облегчать сигнальную активность (Schmick and Bastiaens, 2014). В самом деле, ранние эндосомы появляются в виде reticule-tubular сети под плазматической мембраной с многочисленными 'tight curve' участками (Ichimura et al., 1994) (Fig. 3). Изгиб мембраны часто влияет на активность белков (Schmick and Bastiaens, 2014). Наиболее впечатляющий пример это механо-ощущающие ионные каналы, реагирующие на изменения в напряжении мембраны и её изгиб (Arnadottir and Chalfie, 2010). Хотя остается открытым вопрос, все ли члены цитозиновых сигнальных комплексов находятся под контролем таких физических параметров, этот сценарий может быть привлекательным, поскольку механо-физические параметры привлекают существенное внимание в попытке понять тканевой морфогенез и спецификацию различных аспектов развития (Hiramatsu et al., 2013).
Несмотря на это, многие сигнальные каскады, ступень интернализации сигнальных комплексов, являются предварительным условием для сигнальной трансдукции внеклеточных стимулов к цитозольным компонентам. Процесс интернализации и транспорта в ранне эндосомы может представлять еще один дополнительный слой стадии верификации и контроля для реагирующего на стимулы купирования клеток. На системном уровне дефекты развития часто ассоциируют с мутациями в генах, ответственных за динамику мембран в ранних эндосомах. Sorting nexins (SNXs) представлены семейством белков, чьи члены ассоциированы с ранними эндосомами. Потеря SNX членов ведет к дефектам эмбриогенеза (Schwarz et al., 2002; Zheng et al., 2006). Hrs (также известен как Hgs) является белком ранних эндосом, который взаимодействует с SNXs, TGF-β сигнальными компонентами и с RTKs (Chin et al., 2001; Miura et al., 2000). Hrs (Hgs) нулевые эмбрионы мышей обнаруживают тяжелые дефекты во время гаструляции (Miura et al., 2000), или образования сердечной трубки и дезорганизацию передней кишки на поздних ст. развития (Komada and Soriano, 1999). Эти находки четко показывают, что функция ранних эндосом безусловно вовлечена в становление тканевой архитектуры путем контроля сигнальной трансдукции.

The Late Endosome and Lysosome: Termination of the receptor-Mediator Coupling


В ранних эндосомах рецепторы питательных веществ, такие как transferrin рецептор (TfnR) и LDLR высвобождают лиганды, а сами рецепторы возвращаются обратно на клеточную поверхность. Этот процесс осуществляется с помощью покрывающего мембрану ретромерного комплекса и направляется в дистальный регион аппарата Гольджи (trans-Golgi), где GARP (Golgi-associated retrograde protein) комплекс действует как закрепляющий фактор, принимая происходящие из эндосом компартменты (Bonifacino and Hierro, 2011). Vps52 является компонентом комплекса GARP и, как было установлено, является важным для гаструляции путем поддержания роста эмбриональных тканей у мышей (Sugimoto et al., 2012). Др. компонент GARP, Vps54, необходим также для нормального развития мышей (Karlsson et al., 2013). Интересно, что функция Vps54 участвует в возникновении нейро-патологии амиотрофического бокового склероза (ALS) (Schmitt-John et al., 2005).
Большинство сигнальных рецепторов перемещается разными маршрутами к поздним эндосомам. Они далее транспортируются в поздние эндосомы, уникальные органеллы, расположенные между ранними эндосомами и лизосомами. Поздние эндосомы более кислые, чем ранние эндосомы и обладают характерной структурой. Они содержат многочисленные внутренние пузырьки и электрон-плотные материалы в своем просвете. Поэтому они часто обозначаются как мультивезикулярные тельца (Raiborg et al., 2003; Gruenberg and Stenmark, 2004) (Fig. 3). Внутренние пузырьки происходят из ограничивающей мембраны (наиболее наружной части мембраны) этого компартмента, которые в конечном счете инвагинируют внутрь просвета.
Переход ранних эндосом в поздние эндосомы связан с изменениями в фосфолипидной части мембран органеллы (Sasaki et al., 2009). Присутствие phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) в мембране ранних эндосом характеризует этот компартмент. Белки ранних эндосом, включая Hrs, имеют характерный структурный домен (FYVE домен), который связывается специфически с PtdIns3P (Komada and Soriano, 1999; Miura et al., 2000). Во время превращения в поздние эндосомы, PtdIns3P получает фосфатную часть благодаря активности phospholipid kinase PIPK(III), и становится phosphatidylinositol 3,5-bis-phosphate (PtdIns3,5P2), который затем привлекает несколько белков, включая Chmp5, необходимый для обеспечения направленных внутрь инвагинаций мембраны поздних эндосом и важен также для гаструляции у мышей (Shim et al., 2006). Потеря PIPK(III) у эмбрионов мышей приводит к образованию гигантских эндосом в клетках, указывая, что они неспособны внедрять лимитирующие мембраны внутрь, а скорее массово накапливаются. Кроме того, мутантные эмбрионы неспособны завершать гаструляцию, указывая на то, что сборка поздних эндосомы тесно связана с эмбриогенезом (Takasuga et al., 2013).
Во время перехода ранних эндосом в поздние ограничивающая мембрана эндосом, которая обращена к цитозолю, инвагинирует, создавая мембранную почку, направленную внутрь органеллы, которая в конечном итоге высвобождается в просвет в виде небольшого внутреннего мембранного пузырька. Образуемые внутренней мембраной пузырьки, возникающие из лимитирующей мембраны поздней эндосомы, часто содержат компоненты цитозоля. В терминах сигнальной трансдукции, интернализация является важным процессом в завершение передачи сигналов. Во-первых, цитоплазматические домены мембраны пронизаны сигнальными рецепторами и отделены от цитозоля и цитоплазматические передатчики (transducers) т.о. оказываются бездействующими, хотя они всё ещё биохимически активны (Wada and Sun-Wada, 2013). Во-вторых, увеличение кислотности и гидролитических ферментов, предоставляемых лизосомами, эффективно инактивируют сигнальные рецепторы и в конечном счет выключают сигнальную трансдукцию (Futai et al., 2000; Sun-Wada et al., 2009).
Следовательно, дефекты созревания поздних эндосом могут вызывать фенотипические отклонения, как это наблюдается при мутация PIPK(III) (Takasuga et al., 2013) или rab7 small GTP связывающего белка (Kawamura et al., 2012). mVam2 является субъединицей закрепляющего комплекса, действующего в поздних эндосомах (Brocker et al., 2012). Устранение функции mVam2 у эмбрионов мыши вызывает аномалии развития на ст. гаструлы из-за нарушения регуляции пространственно-временного паттерна активности bone morphogenetic protein (BMP) у эмбрионов. Белок mVam2 специфически взаимодействует с рецепторным компонентом BMP и целенаправленно направляет активированный рецептор в компартмент деградации. Неспособность к завершению передачи сигналов ограничивает рост эмбриональной ткани и её дифференцировку в эмбриональную мезодерму, приводя к тяжелым дефектам гаструляции. Эти наблюдения четко показывают наличие механистической связи между динамикой поздних эндосом и сигнальной регуляцией и её значение в контексте развития (Aoyama et al., 2012; Wada et al., 2013).

Conclusions and Perspectives


Membrane trafficking via the secretory- and endocytic pathways has been a major issue in the field of cell biology, whereas the mechanism of embryogenesis and morphogenesis in the multicellular context is, needless to say, a main subject in developmental biology. The establishment of major concepts in membrane dynamics is due to studies in the unicellular organism Saccharomyces cerevisiae, and in vitro cultured cells. Recent forward- and reverse genetics studies have shown that the membrane dynamics and physicochemical processes indeed sustain the establishment and maintenance of the architecture of multicellular organisms. These new findings suggest that membrane dynamics play regulatory roles in morphogenesis and embryogenesis, and provide an integrated view of cell biological aspects in developmental biology.
Cellular and subcellular mechanisms may participate in the modulation of signaling at the tissue level. Endocytic activation and inactivation control the duration and strength of signal reception, whereas its feedback (signal production) establishes the strength of response. These processes, in combination, control morphogenetic cell behavior in tissues. Therefore, membrane dynamics are important in the regulation of how cells interpret external and internal situations within the tissue. This function is essential for sustaining the robustness of embryogenesis and tissue morphogenesis in the multicellular system.
Precise mechanistic details of how membrane dynamics sustain the interpretation of signal activity have unprecedented importance, not only in the morphogenesis aspects of development, but also for further understanding of various pathophysiological states in adults. Particularly, clinical strategies against carcinogenesis, tissue-regeneration, and neural degeneration will benefit by further knowledge of membrane dynamics.