Во время развития SG человека плюрипотентные стволовые клетки, относящиеся к популяции клеток нервного гребня, дифференцируются в морфологически, иммуногистохимически и функционально различающиеся типы клеток, которые передают разную информацию от периферии тела в ЦНС. Кстати, пространственное и временное появление этой популяции клеток, а также их распределение и взаимоотношения внутри развивающихся ганглиев человека, оставались нерешенными вопросами. Чтобы идентифицировать начало дифференцировки подтипов нейронов, экспрессирующих NF200, IB4, CGRP, calretinin, и VR1 во время раннего развития человека, анализировали иммунохимически расположение, пропорции и интенсивность экспрессии этих маркеров в клетках спинальных ганглиев между 5-й т 10-й неделями развития. Во время инициальной дифференцировки клеток нервного гребня, клетки SG обнаруживали первоначально признаки дифференцировки в направлении нейронов, положительных по nestin, как показали наши предыдущие исследования (Vukojevic et al., 2008; Vukojevic et al., 2009), и начало экспрессии некоторых маркеров подтипов нейронов.

В данном исследовании на самой ранней ст. развития (5-6 недель) обнаруживается лишь небольшое количество дифференцированных болевых рецепторов и механорецепторов, выявляемых в популяции клеток ганглиев человека. Это согласуется с исследованием Marmigere and Ernfors (2007), которые подчеркнули, что определенные подтипы нейронов начинают появляться уже во время первой и второй волны миграции клеток нервного гребня (E9.5 и E10 у эмбрионов мышей). Кроме того, предыдущие исследования показали, что дифференцирующиеся нейроны уже присутствуют среди первой волны вагусных клеток, происходящих из нервного гребня и вступающих с кишечную трубку (Baetge and Gershon, 1989; Young et al., 1999). Напротив, наши находки показали, что скорее наблюдается ранняя экспрессия IB4 в дифференцирующихся болевых рецепторах, Pan et al. (2012) установили, что у эмбрионов мышей IB4 впервые появляется на ст. E15.5 в малого диаметра первичных сенсорных SG нейронах, что соответствует 8-й неделе развития человека.

Механорецепторы составляют лишь небольшой процент от всех SG нейронов, которые появляются вскоре после объединения в SG (Lawson et al., 1993). Напротив, Dahl and Bignami (1985) приходят к выводу, что NF200, как маркер механорецепторов, может обнаруживаться только в зрелых аксонах, но не в незрелых нейронах. Возможной причиной такого расхождения является тот факт, что эти авторы использовали антитела, которые распознают только фосфорилированные эпитопы белка NF200, тогда как в нашем исследовании мы использовали антитела к белку NF200, которые распознают как фосфорилированные так и не фосфорилированные формы. Это согласуется с исследованием Foster et al. (1987), которые продемонстрировали присутствие белка NF200 в культуре клеток SG и спинном мозге (E13 эмбрионов мышей), и использовали антитала, сходные с нашими. Oblinger (1987) подчеркивает, что не фосфорилированные формы NF200 могут обнаруживаться в нейрональном perykarion, тогда как зрелая фосфорилированная форма появляется в аксонах, что согласуется с нашими находками. Во время дальнейшего развития дифференцировка клеток ганглиев быстро возрастает, достигая 18% механорецепторов и 20% болевых рецепторов в конце 8-й недели. С началом плодного периода дальнейшая дифференцировка обеих популяций клеток увеличивается лишь слегка и выравнивается (24% of nociceptors и 22% mechanoreceptors). В SG крыс после первого постнатального дня обнаруживается 23% IB4-позитивных клеток и 34% NF200-позитивных клеток (Beland and Fitzgerald, 2001). Эта находка показывает, что уже во время раннего плодного развития, по-видимому, создается окончательное количество болевых рецепторов в процессе дифференцировки. Причина такого небольшого количества механорецепторов в нашем исследовании может быть обусловлена embedding техникой, поскольку парафиновые срезы могут обнаруживать меньшие количества нейронов (Schmalbruch, 1987), или из-за техники подсчета, приводящей недоучету рада механорецепторов. С другой стороны, причина может заключаться в поздней дифференцировке, по крайней мере, у части механорецепторов человека или даже в межвидовых различиях в соотношении подтипов клеток в SG между людьми и крысами. Кроме того, выдающаяся совместная локализация NF200- и IB4-позитивных клеток подразумевает, что онтогенетические судьбы в направлении механорецепторов или болевых рецепторов всё ещё неоднозначна во время изучаемого периода. Некоторые исследования SG у эмбрионов кур подчеркивают локализацию механорецепторов в вентро-латеральной, а болевых рецепторов в дорсо-медальной частях ганглиев (Hamburger and Levi-Montalcini, 1949; Le Douarin, 1986; Rifkin et al., 2000). В нашем исследовании количество механорецепторов и болевых рецепторов лишь слегка выше в вентральной части ганглия, но м ы не обнаружили пространственно ограниченного распределения подтипов нейронов. Это указывает, что специфические различия в процессе дифференцировки между млекопитающими и птицами в отношении нейронального развития SG. Однако, мы не нашли бросающейся в глаза совместной локализации NF200 и IB4 в дорсальной части SG корешков, тогда как вентральная часть корешка обнаруживает совершенно оитличное образование индивидуальных NF200- и IB4-позитивных нервных волокон. Это может указывать на то, что даже если человеческие SG и не обладают пространственно ограниченным распределением подтипов нейронов, то специализированные нервные волокна склонны располагаться в виде пространственно определенного паттерна. Кроме того, необходимо подчеркнуть более быстрое ограничение онтогенетических судеб в направлении болевых рецепторов и механорецепторов в вентральных частях ганглиев, в частности необходимо помнить генеральные принципы развития нервной системы, где вентральные структуры обычно более продвинуты в процессе дифференцировки, чем дорсальные (Vukojevic et al., 2014). У взрослых нейроны, экспрессирующие NF200, не обладают местами связывания IB4 и не содержат нейропептидов (Merighi et al., 2008). Изучение peptidergic и nonpeptidergic восходящих путей показало, что эти пути в принципе разделены (Zhang and Bao, 2006).

Первое появление CGRP-позитивных клеток в SG человека наблюдается на 6-й неделе развития, указывая, что эта популяция нейронов появляется второй, после IB4-позитивных болевых рецепторов и NF200-позитивных механорецепторов. Это согласуется с исследованием Ai et al. (1998), которые установили, что у эмбрионов крыс SG нейроны первоначально лишены CGRP. Более того, это доказывает, что SG нейроны могут экспрессировать CGRP в отсутствие сигналов от ткани мишени, поскольку во время 5-6-й недели развития нервные окончания в тканях мишенях ещё не развиты. Именно, спинальные нервы достигают периферии во время 7-8-й недели развития, подразумевая, что эти CGRP-позитивные нейроны специфицируются рано при формировании SG. Это наблюдение согласуется с исследованием Hall et al. (1997) которые пришли к выводу, что нейроны, которые экспрессируют CGRP, субстанцию P и нейрофиламенты специфицируются как нейропептиды до контакта с мишенями в коже. Кроме того, мы установили, что наблюдается совместная локализация NF200 и CGRP. Однако, в нашем исследовании CGRP достигает пика экспрессии на поздних ст. развития (10 недель), это обнаружено относительно экспрессии CGRP как в спинном мозге, так и в мишенях в задних конечностях эмбрионов крыс (Jackman and Fitzgerald, 2000).

Как и в случае CGRP наблюдается сходный пространственно-временной паттерн появления VR1. Эта находка согласуется с исследованием Durham and Vause (2010), которые также показали, что CGRP экспрессируется C и Aδ волокнами из первичных афферентных, тогда как большинство афферентных волокон экспрессирует VR1. В нашем исследовании VR1 локализуется совместно с NF200 и обнаруживает наивысшую экспрессию в конце эмбрионального периода (8 недель), это по времени соответствует экспрессии VR1, наблюдаемой в эпендимных клетках развивающегося головного мозга крыс (Jo et al., 2013).

Исследование Ambrus et al. (1998) показало, что у эмбрионов крыс calretinin экспрессируется в большинстве SG клеток между ст. E11 и E14 (что соответствует 3-й и 5-й неделе развития человека), тогда как позднее его экспрессия снижается до лишь небольшой порции нейронов (период, соотв. 8-ой неделе развития человека). В нашем исследовании мы обнаружили первые calretinin-позитивные клетки на 8-й неделе развития и в небольшой проворции нейронов, это может быть объяснено тем фактом, что во время этого промежутка развития устанавливаются соединения с мишенями на периферии. В соответствии с этой возможностью, Kiraly et al. показали, что культуры диссоциированных спинальных ганглиев эмбрионов кур никогда не обнаруживают иммунореактивности calretinin до установления соединений с периферическими мишенями, тогда как после установления таких соединений обнаруживается сильное иммуноокрашивание.

Кроме того, первичные сенсорные нейроны экспрессируют calretinin in vitro в виде сходного паттерна, описанного in vivo, подчеркивая, что экспрессия гена calretinin зависит от становления соединений с периферическими мишенями (Kiraly et al., 1993).

Путем сравнения динамики появления маркера зрелых нейронов PGP9.5 в клетках ганглиев (Vukojevic et al., 2009), с появлением NF200 и IB4 между 5-й и 10-й неделями развития, наблюдается сходный паттерн увеличения количества позитивных клеток в течение всего исследуемого периода. Однако, общее количество клеток, позитивных по генеральному маркеру нейронов PGP9.5 изменяется в предалах от 41% (5-6 неделя) до 55% (9-10-я неделя). А тот же самый период NF200-позитивных клеток, представляющих клеточную линию механорецепторов, значительно меньше, в пределах от 9% до 24% на 9-10 неделе. Сходный паттерн изменений количества позитивных клеток во время исследуемого периода (от 7% на ранних стадиях до 22% на поздних стадиях развития) характеризовал IB4-позитивные клетки и (с 7% на ранних стадиях до 43% на поздних стадиях развития) характеризовал VR1 позитивные клетки, и (с 9% на ранних стадиях до 35% на поздних ст. развития) характеризовал calretinin-позитивные клетки, в то время как (с 11% на ранних ста. до 26% на поздних ст. развития) характеризовал CGRP-позитивные клетки. Во время дифференцировки SG нейронов человека экспрессия общего нейронального маркера (PGP9.5) начинается с наивысшего процента по сравнению с маркерами, специфичными для типов клеток болевых рецепторов (IB4) и механорецепторов (NF200). Т.о., во время самых ранних ст. развития (5/6 неделя), характерный для всех нейронов маркер обнаруживает экспрессию в 4 раза большую в клетках ганглиев (Vukojevic et al.), чем маркеры, специфичные для типов клеток, это может быть объяснено существенной совместной экспрессией этих маркеров в одних и тех же клетках. Двойное иммунофлюоресцентное мечение выявило множество разных типов в SG в виде специфического пространственно-временного паттерна. Двойное мечение иммунозолотом при ЭМ также подтвердило IB4 и CGRP аксоны были очевидными и обнаруживались в одиночных не миелинизированных нервных волокнах (Murinson et al., 2005). Кроме того, разные классы болевых рецепторов, как было установлено, обнаруживают разные паттерны экспрессии рецепторов и белков (Hunt and Mantyh, 2001; Julius and Basbaum, 2001), и лишь некоторые из них были исследованы в данной работе. Поскольку некоторые болевые рецепторы не могут быть визуализированы с помощью IB4 маркера (Merighi et al., 2008) или имеется перекрывание в экспрессии разных маркеров в сенсорных нейронах, подсчет клеток оказывается затруднен и нуждается в дополнительной технике исследования.

Во время развития и дифференцировки SG нейронов человека присутствие болевых рецепторов и механорецепторов обнаруживается уже на 5-й неделе развития. Врастание дорсальных корешков спинальных нервов в спинной мозг, слияние с вентральным корешком при образовании спинального нерва, который достигает периферии во время 7-8-й недели развития, указывает на присутствие всех базовых структурных компонентов, важных для передачи сенсорной информации в ЦНС. Поскольку появление calretinin-позитивных нейронов совпадает с иннервацией периферических мишеней, то экспрессия др. маркеров, таких как NF200, IB4, CGRP, и VR1, в развивающихся клетках ганглиев, по-видимому, независима от соединения с тканью мишенью.