Одновременное с транскрипцией удаление интронов происходит вблизи др. аппарата экспрессии генов, включая RNAPII и факторы, ремоделирующие хроматин. Поскольку воздействие RNAPII теперь хорошо известно, то роль хроматина в регуляции сплайсинга во многом неясна. Здесь мы провели всестороннее исследование связи между хроматином и сплайсингом, и мы создали систему in vitro для изучения непосредственно этой связи. Хотя мы имели ограниченное количество репортерных конструкций, наши данные показали, что транскрибирование пре-мРНК с chromatinized матрицы влияет на эффективность сплайсинга и мы предположили, что этот эффект частично обеспечивается физическими взаимодействиями между хроматиновыми факторами и сплайсесомами.

Наш RNAi скрининг выявил неожиданно широкий диапазон факторов скорее, чем специфический субнабор хроматиновых комплексов. Скрининг отлавливал почти каждый хроматиновый фактор, ранее описанный, как модулирующий сплайсиннг (SWI/SNF, Cbx3/HP1γ, ZMYND11/BS69, CHDs…), подтверждая их важность. Некоторые из этих факторов, включая Cbx3/HP1γ и ZMYND11/BS69 бвли исследованы в отношении их геномного эффекта на сплайсинг, еще сильнее подтверждая, что наши hits затрагивают экзоны и за пределами исследованных во время фазы атестации [4,23]. Эти геномные исследования и др. исследования MBD3 и CHD4 также показали, что эти хроматиновые факторы оказывают лишь минорные эффекты на экспрессию факторов сплайсинга, включая SRSF1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6 и hnRNPA1 [24,25].

Разумным объяснением для различий этих hits является предполагаемая гетерогенность локальных уровней компакции хроматина и/или ряд гистоновых модификаций, окружающих каждую копию нашего интегрированного сплайс-репортера, как и в примерах, описанных для разных копий эндогенных гистоновых генов (The Encode Project Consortium). В этом смысле, наш скрининг может счастливым образом исследовать большой спектр окружающих хроматин молекул, влияющих на регуляцию сплайсинга. Локальное влияние хроматина также проиллюстрировано с помощью наших атестирующих экспериментов на эндогенные гены. Эти эксперименты показали, что в зависимости от экзона при внимательном изучении, данный хроматиновый фактор оказывает различающийся эффект, способствующий включению или исключению экзона довольно непредсказуемым способом. Это согласуется с более ранними исследованиями, показавшими, что в MCF7 клетках рака груди человека, HDAC ингибитор TSA и ингибитор DNA methylase 5azadC способствуют включению экзона E107 из гена SYNE, тогда как они вызывают исключение экзона E33 из гена фибронектина [26].Сходным образом, в клетках Drosophila S2 истощение субъединиц SWI/SNF способствует использованию проксимального сайта сплайсинга в некоторых генах, тогда как он способствует использованию дистальной сайта в др. генах [27]. Возможным источником гетерогенности в хроматине экзонов может быть их степень близости с промоторами и энхансерами, вызываемая образованием петель ДНК [28]. Расшифровка возможно очень сложной комбинации регуляторных сигналов, играющих роль в данном локусе, необходима, чтобы справиться с проблемой влияния на каждый из генов хроматинового фактора на сплайсинг.

Наш протеомный подход подтвердил, что аппарат сплайсинга физически связан с субнабором хроматиновых факторов, когда сплайсесомные комплексы собираются in vivo. Некоторые из этих факторов ранее были связаны со сплайсингом, включая MORF4L2 (close homolog MRG15), Cbx3/HP1γ, SMARCA2/BRM, EHMT1 and EHMT2, EZH2 и множественные HDACs [2-4,29-31]. В некоторых более ранних протеомных исследованиях аппарата сплайсинга, такие взаимодействия не были выявлены или были ограничены немногими факторами. Это , скорее всего, коренится в процедурах, используемых для очистки, т.к. эти подходы были использованы для характеризации аппарата сплайсинга, собираемого de-novo на предварительно синтезированных репортерных РНК. Компоненты, обычно распространяющиеся во время транскрипции, не д. загружаться на сплайсесосмы. Наша процедура базируется на преодолении ограничения закрепления U2-snRNP и делает возможной выделение как de-novo-, так и in-vivo-собираемых сплайсесомных комплексов. В этом смысле, это напоминает ранее описанное отлавливание PRPF40A-U2 snRNP, которое выявляется по присутствию CHD4/8 и некоторых SWI/SNF субъединиц в дополнение к факторам сплайсинга [8]. Среди 15 ремоделирующих факторов, присутствующих в этом комплексе, 13 были также обнаружены с помощью нашего подхода.

U2 snRNP является одним из наиболее хорошо охарактеризованных snRNPs сплайсесом, и к тому же описано несколько версий, соотв. разным стадиям созревания [32], скорее всего, это только одна из наиболее часто встречающихся частиц, охарактеризованая столь хорошо, за исключением тех, ассоциированных с транскрибируемым хроматином. И генетические и биохимические исследования рассматривают snRNPs скорее как важные, чем регуляторные компоненты сплайсесом . Недавние исследования продемонстрировали, однако, что некоторые события альтернативного сплайсинга регулируются на уровне стержневых компонентов аппарата сплайсинга [18,33]. Экзоны, которые мы исследовали, чтобы оценить наши hits, были идентифицированы как осоебнно чувствительные к уровням U2-snRNP. Мы полагаем, что этот snRNP может действовать как медиатор между аппаратом сплайсинга и локальным окружением хроматина и что экзоны, чувствительные к активности U2-snRNP, также, скорее всего, являются объектами действия хроматина.

Наконец, мы отметили, что ряд "chromatin factors", физически связанных со сплайсесомами, в нашем протеомном подходе действительно включают гистоны. Это указывает на то, что эти первичные строительные блоки хроматина могут влиять на исход сплайсинга, возможно влияя на сборку нуклеосом, когда они присутствуют в ограниченном доступе. В самом деле, нуклеосомы могут быть вовлечены в определение экзона, на что указывает повышенное оккупирование и позиционирование нуклеосом, наблюдаемых в экзонах по сравнению с интронами (for a review, see [34]). Сборка нуклеосом может быть важна для скорости RNAPII элонгации, и для формирование петель, соединяющих альтернативные экзоны с позиционированными на промоторах нуклеосомами [28,35].