Посещений:
СИНАПСЫ



Структура, функция, генетика

The synaptic proteome
• Melanie Laβek, • Jens Weingarten, • Walter Volknandt
Cell and Tissue Research January 2015, Volume 359, Issue 1, pp 255–265

Synapses are focal hot spots for signal transduction and plasticity in the brain. A synapse comprises an axon terminus, the presynapse, the synaptic cleft containing extracellular matrix proteins as well as adhesion molecules, and the postsynaptic density as target structure for chemical signaling. The proteomes of the presynaptic and postsynaptic active zones control neurotransmitter release and perception. These tasks demand short- and long-term structural and functional dynamics of the synapse mediated by its proteinaceous inventory. This review addresses subcellular fractionation protocols and the related proteomic approaches to the various synaptic subcompartments with an emphasis on the presynaptic active zone (PAZ). Furthermore, it discusses major constituents of the PAZ including the amyloid precursor protein family members. Numerous proteins regulating the rearrangement of the cytoskeleton are indicative of the functional and structural dynamics of the pre- and postsynapse. The identification of protein candidates of the synapse provides the basis for further analyzing the interaction of synaptic proteins with their targets, and the effect of their deletion opens novel insights into the functional role of these proteins in neuronal communication. The knowledge of the molecular interactome is also a prerequisite for understanding numerous neurodegenerative diseases.
Термин синапс был первоначально предложен в 1897 Charles Sherrington в учебнике по физиологии, под редакцией Michael Foster (Foster 1897). Здесь мы сфокусируемся на химических синапсах, впервые предложенных Santiago Ramon y Cajal (Cajal 1888) в каркасе доктрины нейрона. Синапсы являются фокальными горячими точками для сигналов трансдукции и пластичности в головном мозге. Синапсы представлены в окончаниях аксонов пресинапсом, синаптической щелью, содержащей белки внеклеточного матрикса и молекулы адгезии и постсинаптическое уплотнение (PSD) в качестве структуры мишени для передачи химических сигналов. Пресинапс содержит митохондрии и многочисленные синаптические пузырьки, часто закрепленные на пресинаптической решетке. Потенциалы действия, прибывающие к нервным окончаниям, обеспечивают приток кальция, который вызывает слияние компетентных к экзоцитозу закрепленных синаптических пузырьков с пресинаптической плазмой, и высвобождение хранимых ими нейротрансмиттеров в синаптическую щель. Нейротрансмиттеры соединяются с рецепторами, зарезервированными и собранными в кластеры в постсинаптическом уплотнении, это вызывает постсинаптическую реакцию. Дополнительные рецепторы могут быть активированы пресинаптически и модулировать высвобождение нейротрансмиттеров. Вследствие экзоцитоза пресинапс подвергается конформационной перестройке, включая компенсаторные периодические преобразования (cycling) синаптических пузырьков. Зависимое от активности повторное использование рецепторов нейротрансмиттеров модулирует эффективность синапсов. Параллельные внутриклеточные пре- и пост-синаптические сигнальные каскады могут запускать синтез белков и одновременно кратковременную и долго-времененую структурную регуляцию зрелых синапсов.
Несколько статей описывают выделение и глобальный анализ синаптического компартмента (e.g., Bayes et al. 2011, 2012; Biesemann et al. 2014; Boyken et al. 2013; Burre et al. 2006; Collins et al. 2006; Gronborg et al. 2010; Morciano et al.2005, 2009; Weingarten et al. 2014). Эти протеомные исследования подтверждают всё увеличивающуюся важность синаптических игроков, составляющих основу и подчеркивающих необходимость дальнейших исследований. Это д. привести не только к более детальной характеризации синаптического протеома, но и также влияние альтераций в белковом инвентаре в случае болезней, онтогенеза и эволюции.

Isolation strategies


Стратегии очистки включают иммунологическую изоляцию структур мишеней непосредственно из гомогенатов головного мозга. Использование процедур выделения из лизатов головного мозга постсинаптических комплексов, таких как рецепторы нейротрансмиттеров были описаны с использованием immunoaffinity хроматографии, иммуно-очистки помощью антител, направленных против NMDA субъединицы R1, и пептидного сродства, базирующегося на структуре субъединицы NMDA R2B C конца, которая соединяется с NMDAR-связывающим белком PSD-95 (Husi et al. 2000). Используется протокол иммуно-преципитации с антителами против mGluR5, молекулярного составляющего этого сигнального комплекса (Farr et al. 2004).
Др. частая стратегия для уменьшения сложности тотального гомогената головного мозга и для очистки синаптических компартментов состоит в субклеточном фракционировании ткани головного мозга, включая дифференциальное и в градиенте плотности центрифугирование разрушенных и вторично собранных метаболических интактных нервных окончаний, наз. синаптосомами (De Robertis et al. 1962; Gray and Whittaker 1962; Whittaker et al. 1964). Некоторые процедуры субклеточного фракционирования для выделения синаптических компартментов, используя ступенчатое центрифугирование синаптосом мишеней в качестве стартового материала (Carlin et al. 1980; Huttner et al. 1983). На сегодня процедура выделения становится рутинной, начиная с обогащения синаптосомами c помощью частиц коллоидного кремнезема Percoll (Dunkley et al. 2008) или гидрофильного полисахарида Ficoll (Booth and Clark1978), оба обладают низкой вязкостью и осмолярностью для центрифугирования в градиента плотности.
Недавно разработанный метод позволяет выделять синаптосомы, содержащие глютамат хранящие синаптические пузырьки c помощью fluorescence-activated synaptosome sorting (FASS). Этот протокол позволяет анализировать специфическую субпопуляцию синапсов (Biesemann et al. 2014).
ЭМ анализ изолированных синаптосом выявил постсинаптические участки. Boyken et al. (2013) подвергали синаптосомы ограниченному протеолизу, используя трипсин для уменьшения постсинаптических загрязнений.
В целом синаптосомы были подвергнуты гипоосмотическому лизису, чтобы высвободить синаптические пузырьки. После центрифугирования в градиента плотности сахарозы синаптические пузырьки обнаруживали бимодальное распределение, что позволлило разделять синаптические пузырьки (Burre et al. 2006; Takamori et al. 2006; Morciano et al. 2005) на более лёгкие фракции, с одной стороны, и синаптические пузырьки, закрепленные в пресинаптической плазматической мембране в более плотной фракции градиента, с др. стороны. Это предоставило возможность разделять эти два синаптических компартмента (Boyken et al. 2013; Morciano et al. 2005, 2009; Weingarten et al. 2014). Синаптические пузырьки, относящиеся а более лёгкой фракции, были в дальнейшем очищены в соответствии с размером колонок гель фильтрации с контролируемыми порами стекла (controlled porous glass (CPG)) (Huttner et al. 1983; Nagy et al. 1976), Sephacryl-1000 (Volknandt and Zimmermann 1986) или центрифугированием в градиенте скорости глицерола (Clift-O'Grady et al. 1998; van de Goor et al. 1995). CPG очищенные пузырьки были использованы для описания молекулярной анатомии органелл доставки (Takamori et al. 2006).
Для дальнейшей очистки фракций, содержащих синаптические пузырьки, использовали иммуно-фильтрацию с антителами, направленными против цитозольного эпитопа интегральных синаптических белков мембран. Затем синаптические везикулярные белки становились мишенями для иммуно-изоляции: 12-раз пронизывающий мембрану белок SV2 (Bajjalieh et al. 1994; Burre et al. 2006; Lassek et al. 2013; Morciano et al. 2005, 2009; Weingarten et al. 2014), tetraspan белок синаптофизин (Boyken et al. 2013; Yao et al. 2010), и везикулярный GABA и глютамат vGluT1 транспортер (Boyken et al. 2013; Gronborg et al.2010). Антитела конъюгировали или с помощью кусочков магнита, белка A-Sepharose или микро-кусочков methacrylate в качестве твердой основы. Используя антитела пртив SV2 для иммуно-выделения, была продемонстрирована с помощью ЭМ чистота собственно синаптических пузырьков, закрепленных на пресинаптической плазматической мембране, с помощью анализа маркерных белков (Lassek et al. 2013; Morciano et al. 2005, 2009) и корреляции профилирования.
Постсинаптическая плотность (PSD) скапливается на дне градиента сахарозы (Jordan et al. 2004; Peng et al. 2004; Weingarten et al. 2014). PSD обычно очищается с помощью дифференциального центрифугирования интактных синаптосом (Cotman et al. 1974; Suzuki et al. 1994; Yoshimura et al. 1996). Фракция синаптосом, в свою очередь, отделяется от миелина и митохондриальных фракций с помощью центрифугирования, использующего высоко молярный градиент плотности сахарозы. Постепенно синаптосомы накапливаются в более плотной фракции и обрабатываются с помощью не ионного детергента Triton X-100, чтобы растворить мембранные белки и Triton X-100-нерастворимую PSD (Carlin et al. 1980). Комплекс, содержащий белок постсинаптической плотности PSD-95, может быть выделен из фракции синаптосом с использованием иммуно-очистки с помощью антител , направленных против PSD-95 (Dosemeci et al. 2007). Путем использования многомерной жидкостной хроматографии вместе с масс-спектрометрией для протеомного анализа, выявляются фракции постсинаптической плотности (Yoshimura et al. 2004).

Proteomic approaches


Потеомные исследования прежде всего базируются на масс спектрометрии, которая использует протеолитическое переваривание и определение возникающих в результате массы пептидов для идентификации соотв. белков в базе данных белков. Аутопротеолитические фрагменты протеаз используются в качестве внутреннего стандарта. Подробнее о методологических основах см. (Barth and Volknandt 2011; Burre and Volknandt 2007; Ramos-Ortolaza et al. 2010). Итак, соотв. протеомные стратегии обогащают определенные субклеточные структуры с помощью субклеточного фракционирования. Насколько это возможно л. быть предприняты попытки очистки соотв. мишеней протеома с помощью иммуно-изоляции. Одним из преимуществ субклеточных протеомных подходов является то, что идентифицируемые белки может быть непосредственно отнесены к определенным компартментам. Особенно в случае новых белков, это может предоставить ценную информацию для будущей оценки их функциональной роли совместно с др. компонентами интерактома (Barth and Volknandt 2011).
Гидрофобные мембранные белки технически трудны для протеомных подходов. Их аминокислотные последовательности содержат только немногие места расщепления для большинства разнообразных протеаз. Это затрудняет их идентификацию с использованием mass fingerprinting пептидов (Tannu and Hemby 2006; van Montfort et al. 2002). Процедура идентификации для малых гидрофобных пептидов была существенно улучшена использованием метанольной свиной панкреатичесокй эластазы для переваривания белков или химотрипсина вместо трипсина (Rietschel et al. 2009a, b; Weingarten et al.2014).
Прогресс в профилировании протеомики синаптосом был ускорен с помощью комбинации классической субклеточной техники фракционирования для выделения синаптосом с разными протеомными анализами (Bai and Witzmann 2007). Протеомный анализ синаптосом выявил более 1000 индивидуальных белков (Schrimpf et al. 2005). Среди них было более 100 фосфопротеинов (Filiou et al. 2010), указывающее на необычную степень модификаций белков после трансляции в нервных окончаниях. Более того, протеомные характеристики синаптосом были осуществлены при использовании метода isotope-coded affinity tag (ICAT) вместе с масс спектрометрией, что повысило количество выявляемых белков (Li et al. 2004, 2005; Schrimpf et al. 2005). Комбинация protein/peptide immobilized metal affinity хроматографии с данными масс спектрометрии привело к крупномасштабному картированию фосфопротеома синаптосом (Collins et al. 2005).

The proteome of the postsynaptic active zone


Постсинаптическая активная зона определена как постсинаптическая плотность, представленная более чем 1000 белков (Bayes et al. 2012), что указывает на высокую степень молекулярной сложности (Bayes and Grant 2009). Потеомные исследования выявили многие сотни постсинаптических белков, которые организованы посредством физических взаимодействий в мультибелковые комплексы и сети (Pocklington et al. 2006). Ранняя ЭМ синаптических контактов на шипах дендритов в коре головного мозга показала, что под постсинаптической мембраной находится плотная полоса материала (Gray 1959), которая была обозначена как постсинаптическая плотность (PSD). Она характеризуется образованием кластеров внутри-мембранных частиц, таких как AMPA рецепторы (Okabe 2007). Одиночная структура PSD содержит несколько принципиальных молекул, таких как многочисленные копии AMPA и NMDA рецепторов, сходное количество transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs), приблизительно 1000 субъединиц CaMKII и сотни PSD-95, guanylate kinase-associated protein (GKAP), Shank/ProSAP и молекул Homer (Okabe 2007). PSD белки обнаруживают увеличение концентрации в PDZ и SH3 доменах, это позволяет им взаимодействовать с сетями др. белков (Collins et al. 2006). Мультибелковые комплексы PSD включают NMDA receptor-PSD95 комплексы с mGluR, AMPA receptor complexes (ARC) и MAGUK-associated signaling complexes (MASC). MASC соединен со многими клеточными биологическими эффекторными механизмами, организованными в их соотв. комплексах. Помимо MASCs и ARCs, описаны компоненты др. комплексов, таких как клеточная адгезия (Collins et al. 2006).

Synaptic cell adhesion


Многие молекулы клеточной адгезии располагаются на синаптических сайтах аксонов и дендритов нейронов и на мостиках пре- и пост-синаптических специализаций. Синаптические адгезивные участвуют в формировании, созревании, функции и пластичности синаптических соединений. Эти молекулы потенциально участвуют в двунаправленной координации молекулярной и морфологической дифференцировки синапсов (Dalva et al. 2007). Белки, участвующие в передаче транс-синаптических сигналов, включают neuroligins, которые непосредственно связывают PSD-95 (Irie et al. 1997) и взаимодействуют с пресинаптическими neurexins, пресинаптическими ephrin-B лигандами, которые активируют EphB рецепторную тирозин киназу и индуцируют образование кластеров NMDA рецепторов, образование возбуждающих синапсов (Dalva et al. 2000), синаптических молекул клеточной адгезии SynCAM , которые управляют сборкой синапсов (Biederer et al. 2002), синаптических молекул, похожих на молекулы клеточной адгезии SALM2 (Ko et al. 2006), пресинаптического netrin-G лиганда, который активирует NGL-2-a ключевой регулятор развития input-specific синапсов в гиппокампе (DeNardo et al. 2012), который затем ассоциирует с PSD-95 (Kim et al. 2006), и кальций зависимую адгезивную молекулу N-cadherin, которая управляет синаптической активностью в шипах как постсинаптический элемент (Missler et al. 2012).

The proteome of the presynaptic active zone


Сборка пресинаптической активной зоны (PAZ) отличается от сборки постсинаптической плотности (Bresler et al. 2004). В то время как PSD молекулы, такие как NMDA рецепторы и каркасные молекулы ProSAP1 и ProSAP2 рекрутируются в формирующиеся синаптические соединения, белок активной зоны bassoon рекрутируется из дискретных и мобильных транспортных частиц (Zhai et al. 2001). Несколько ультраструктурных исследований подтвердили существование регулярно организованных пресинаптических плотных проекций, гексогональная пресинаптическая решетка с небольшими круглыми вдавлениями (Pfenninger et al. 1969). Недавнее ЭМ исследование описало многогранные белковые ящички, в которых упакованы синаптические пузырьки, и они участвуют в их прикреплении к активной зоне (Zampighi and Fisher 1997). Пресинаптическая решетка представлена цитоматриксом (cytomatrix), собранной в активной зоне (CAZ) (Garner et al. 2000). Протеом пресинаптической актиной зоны содержит кроме закрепленных синаптических пузырьков и составляющие пресинаптической плазматической мембраны, включая экзо- и эндоцитотический аппарат в местах высвобождения. Основные игроки, закрепленные в синаптических пузырьках, включают synaptotagmin-1, rab3a и SV2, также как и составляющие комплексов SNARE (Burre and Volknandt 2007; Takamori et al. 2006).
О специфических аспектах сайтов высвобождения см. обзоры (Clarke et al. 2012; Maas et al. 2012; Pitsch et al. 2012; Sudhof 2012; Volknandt and Karas 2012; Ohtsuka 2013). Синаптические пузырьки являются ключевыми органеллами передачи химических сигналов, которые играют критическую роль в протоколах очистки активной зоны, они будут упомянуты кратко. Детальное обсуждение протеома синаптических пузырьков см. недавний обзор (Burre and Volknandt 2007). Интегральные белки пузырьков или ассоциированные с мембраной пузырьки служат для исполнения многих целей органелл во время своей жизни. Сюда входит транспорт органелл, взаимодействие их с цитоскелетом нервных окончаний, приём и хранение составляющих низкого молекулярного веса и регулируемое взаимодействие с пресинаптической плазматической мембраной активной зоны. Успехи в выделении белков мембран и масс спектрометрия сделали возможным детальное описание протеома синаптических пузырьков (Burre and Volknandt 2007; Takamori et al. 2006).
Во время экзо- и эндоцитоза синаптические пузырьки тесно связаны посредством quadruplehelical SNARE комплекса с пресинаптической плазматической мембраной (Sudhof and Rizo 2011). Это делает возможной иммуно-очистку активной зоны с использованием антител, направленных против цитозольного эпитопа белков мембранных интегральных белков. Усовершенствованная масс спектроскопия выявила протеом этих сайтов высвобождения (Boyken et al. 2013; Morciano et al. 2005,2009; Weingarten et al. 2014). Сравнение белкового инвентаря, выявленного в крупных протеомных исследованиях в этой области, продемонстрировали удивительное перекрывание протеома PAZ, независимо от различий в методологических подходах (Weingarten et al. 2014).
Идентифицированные белки, включают белки синаптических пузырьков, компоненты пресинаптического слияния и аппарата восстановления, участвующих во внутриклеточной и внеклеточной передаче сигналов, а огромное разнообразие адгезивных молекул и белков, потенциально участвующих в регуляции функциональной и структурной динамики пресинапсов.

The presynaptic active zone is a dynamic hot spot


Цитоскелетные элементы, участвующие в транспорте и структурной динамике, многочисленны в пресинаптической активной зоне. Взаимодействия между актиновыми филаментами и активными микротрубочками необходимы для пресинаптической динамики и пластичности (Cingolani and Goda 2008; Dent and Kalil 2001). Они играют критическую роль в становлении терминальных древ и рекрутировании пресинаптических пузырьков и компонентов активной зоны (Nelson et al. 2013).
Белковый состав пресинаптической активной зоны представлен огромным разнообразием белков, участвующих в перестройке микротрубочек, а также в реорганизации активного цитоскелета (Weingarten et al. 2014). В этом контексте septins представляют группу белков, которые могут взаимодействовать с актиновыми филаментами и микротрубочками. Пресинаптические септины обнаруживают усиление экспрессии с эмбриональной стадии до взрослой стадии и присутствуют в пресинаптических окончаниях зрелых синапсов. Они концентрируются в препаратах синаптических пузырьков (rev. Burre and Volknandt 2007) и совместно имунно-преципитируются из ткани головного мозга, указывая на их функциональную роль в пресинаптической пластичности. Пресинаптические нейрональные септиновые комплексы д. быть важны для обеспечения развития собственно аксонов и высвобождения нейротрансмиттеров (Tsang et al. 2011). Присутствие столь многих белков, участвующих в динамической перестройке цитоскелетныъ треков (tracks) характеризует активную зону как фокальную горячую точку. Это в дальнейшем было подтверждено легионами вне- и внутриклеточных сигнальных событий в пресинаптической активной зоне. Интересующие кандидаты, не обязательно участвующие в сигнальных событиях, это натрий-калиевая ATPase (Na+/K+-ATPase, NKA). Пронизывающий мембрану Na+/K+-ATPase (NKA) antiporter является многочисленным компонентом пресинаптической активной зоны. Помимо накачки ионов, NKA выполняет фундаментальную функцию в сигнальной трансдукции (rev. Tidow et al. 2010; Xie and Askari 2002) независимо от изменений во внутриклеточных концентрациях Na+ и K+. NKA сцеплена с сигнальным путем ERK1/2 с помощью протеин киназы C (Mohammadi et al. 2001), запускающей активацию CREB (Desfrere et al. 2009).
Активная зона, кроме того, состоит из огромного разнообразия белков клеточной адгезии. Представители, такие как neurofascin, NCAM-1, contactin, SynCAMS и neuroplastin существенны для структурной и функциональной организации пресинаптической плазматической мембраны во время развития и у взрослых (Falk et al. 2002; Fogel et al. 2007; Korshunova et al. 2008; Koticha et al. 2005).
Подобно как постсинаптической активной зоне, большое разнообразие кальций-связывающих белков присутствует в пресинаптических сайтах высвобождения, указывая на важность гомеостаза кальция в обоих компартментах. Кальцием активируемый calmodulin регулирует большое разнообразие энзимов, ионных каналов и др. белков, включая CaM киназы и фосфатазы, участвующие в синаптической пластичности и сигнальной трансдукции.

Mitochondria are constituents of PAZ


Идентификация митохондриальных белков во всех исследованиях отражает безусловно настоящую физическую ассоциацию митохондрий с пресинаптической активной зоной посредством взаимодействия с цитоскелетными элементами. В соответствии с этим предположением многочисленные митохондриальные белки были предназначены для пресинаптической плазматической мембраны (Elinder et al. 2005; Kolonin et al. 2004; Marin et al. 2007; Phillips et al. 2001; Soltys and Gupta 1999). В активной зоне митохондрии не только продуцируют аэробный АТФ, но и они также участвуют в определенных формах кратковременной синаптической пластичности, за счет буфферизации кальция (Billups and Forsythe 2002; Levy et al. 2003; Tang and Zucker 1997; Yang et al. 2003). Митохондрии были обнаружены связанными с активной зоной в ассоциированных с митохондриями в слипчивых комплексах (Rowland et al. 2000). ЭМ анализ иммунно-очищенной PAZ подтвердил мнение, что пресинаптический протеом, включает митохондрии, случайно прикрепленные к активной зоне (Morciano et al. 2009). Более того, электронная томография выявляет сложную цитоскелетную супер-структуру, которая связывает субнабор митохондрий с пресинаптической мембраной вблизи активной зоны (Perkins et al. 2010).

Additional protein constituents of the PAZ


Масс спектрометрия выявила bassoon (Boyken et al. 2013; Weingarten et al. 2014), piccolo, rab-interacting molecule (RIM) и liprin-α, CASK, ERC (ELKS/Rab6-interacting/CAST) (Boyken et al. 2013) в качестве составляющих цитоматрикса активной зоны (CAZ) (Gundelfinger et al. 2003; Schoch and Gundelfinger 2006). Некоторые из этих белков, по-видимому, существуют в низких количествах в местах высвобождения и могут легко избегать идентификации с помощью масс спектрометрии.
Пресинаптическая активная зона обладает не только Ca2+-каналами (P/Q- [Cav2.1] и N-type Ca2+-каналами [Cav2.2]) в качестве группы белков плазматической мембраны, но и также как транс-синаптические молекулы клеточной адгезии и пресинаптические рецепторы (Nyiri et al. 2005). Ранее независимое исследование выявило, что ионотропные AMPA-типа глютаматовые рецепторы (Fabian-Fine et al. 2000) и группа III metabotropic глютаматовых рецепторов (mGluR4, mGluR7 и mGluR8) концентрируются в пресинаптических местах высвобождения (Corti et al. 2002; Ferraguti et al.2005; Kogo et al. 2004; Shigemoto et al. 1996). Метаботропные глютаматовые рецепторы экспрессируются в пирамидальных нейронах гиппокампа и избирательно локалиуются только в синапсах, сформированных в промежуточных нейронах (Shigemoto et al. 1996). В этом контексте глютамат был описан как аутоингибирующий нейротрансмиттер в субнаборе возбуждающих синапсов и как гетеросинаптический супрессор в некоторых ингибирующих синапсах (Kogo et al. 2004). CB1 рецепторы для endocannabinoids обогащены в пресинаптическом регионе, где происходит эндоцитоз синаптических пузырьков (Nyiri et al. 2005). В основном пресинаптические рецепторы действуют с помощью ингибирующих пресинаптических Ca2+-каналов, обнаруживая тем самым механизм, с помощью которого может быть модулировано высвобождение нейротрансмиттера (Sudhof 2012). G белком-обеспечиваемое пресинаптическое подавление высвобождения с помощью супрессии активации Ca2+-каналов, по-видимому, действует посредством рецепторов для нейромодуляторов, таких как нейропептиды, endocannabinoids, ацетилхолин и катехоламины. В этом контексте, Wilson and Nicoll описали форму кроатко-временной пластичности, когда постсинаптически высвобождаются endocannabinoids, супрессируя пресинаптическое высвобождение GABA путем ингибирования пресинаптических Ca2+-каналов (Wilson and Nicoll2001). Др. класс пресинаптических рецепторов представлен ионотропными P2X и метаботропными P2Y рецепторами, участвующими в обеспечении действия внеклеточного АТФ и др. нуклеотидов. АТФ причастен к синаптической трансмиссии, затрагивая или позитивную, или негативную обратную связь путем соединения с P2X или P2Y рецепторами. В этом контексте высвобождение нейротрансмиттеров модулируется с помощью АТФ при участии acetylcholine, noradrenaline, dopamine, serotonin, glutamate и GABA. Помощь высвобождению нейротрансмиттеров традиционно приписывается P2X рецепторам, тогда как P2Y рецепторы ассоциируют с ингибирующей модуляцией. Интересно, что оба типа рецепторов совместно экспрессируются в нервных окончаниях, наделяя их мишени фармакотерапевтическим потенциалом, напр., при связанных с ишемией нейро-дегенеративных болезнях (Sperlagh et al. 2007). Пресинаптические kainate рецепторы, как полагают, депрессируют высвобождение глютамата и GABA посредством неизвестного механизма; однако, усиленная синаптическая трансмиссия за счет облегчения высвобождения глютамата, также была описана (Schmitz et al. 2001; Sihra and Rodriguez-Moreno 2013).
Пресинаптические рецепторы часто избегают идентификации с помощью масс спектрометрии (Boyken et al. 2013; Morciano et al. 2009; Weingarten et al. 2014) , это может быть связано с их небольшим количеством копий, их локализацией в специализированных синапсах или с их временным включением в PAZ.
Следовательно, можно ожидать идентификации дополнительных ключевых игоков в будущем. Интересно, что амилоидные предшественники, члены белкового семейства (APP; APLP1 и APLP2) были идентифицированы в качеcтве составляющих пресинаптической плазматической мембраны в местах высвобождения в головном мозгемышей (Lassek et al. 2013).

Amyloid precursor proteins are constituents of PAZ


Амилоидного предшественника белок (APP) и члены его семейства amyloid precursor-like proteins 1/2 (APLP1/2) были локализованы в пуле органелл, располагающихся в аппарате Гольджи и эндосомных компартментах и в их зрелой форме в пуле пресинаптической активной зоны (Lassek et al. 2013). APP является повсеместно экспрессирующимся типа 1 трансмембранным гликопротеином с крупным N-терминальным внеклеточным доменом, закрепленным с помощью один раз пронизывающего мембрану α-спиральным регионом и коротким цитоплазматическим хвостом (Kang et al. 1987). В головном мозге APP экспрессируется исключительно в нейронах и один из его протеолитических продуктов является главным белковым компонентом старческих бляшек, типичных для болезни Алцгеймера (Glenner and Wong 1984; Guo et al. 2012; Masters et al. 1985). APP имеет несколько изоформ в результате альтернативного сплайсинга, причем в 695 аминокислот изоформа isoform (APP695) специфична для нейронов (Sandbrink et al. 1994). В то время как APP и APLP2 повсеместно экспрессируются в огромном большинстве тканей взрослых, APLP1 ограничивается нервной системой (Lorent et al. 1995; Slunt et al. 1994). APP одновременно с трансляцией вставляется в мембрану ER и транспортируется в аппарат Гольджи, где он становится модифицированным за счет N- и O-гликозилирования, за счет sialylation и за счет прикрепления к нему гликозаминогликанов (Lyckman et al. 1998). APP отсортировывается в аксоны (Tienari et al. 1996) в везикулярный компартмент. Используя кинезин в качестве мотора и микротрубочки в качестве путей он достигает пресинаптического региона за счет быстрого антероградного аксонального транспорта, где он оказывается включенным в пресинаптическую плазматическую мембрану (Kins et al. 2006; Lazarov et al. 2005; Szodorai et al.2009). Недавно все три APPs были локализованы в пресинаптической активной зоне (Lassek et al. 2013). Здесь APPs могут действовать совместно с разнообразными др. белками, напр. сигнальной трансдукции и клеточных реакциях тонкой настройки. На клеточной поверхности, как полагают, происходят цис- транс- гомотипные и гетеротипные взаимодействия (Soba et al. 2005) (Kins et al. 2006). Анализ дефицитных по APP мышей выявил дефицит long-term potentiation (LTP) в гипокампе и кратковременной пластичности нейромышечных синапсов из-за аберрантной активации пресинаптических N-типа и L-типа кальциевых каналов (Ring et al. 2007; Yang et al. 2007). Многочисленные пресинаптические участники взаимодействий с APP, участвующие в транспорте пузырьков, доставке и эндоцитозе, были недавно идентифицированы (Anliker and Muller 2006; Reinhard et al. 2005; Wolfe and Guenette 2007). Анализ составляющего пресинаптической активной зоны Munc 13-1 у нокаутных и knock-in модельных животных показал, что Munc-13-1-обеспечиваемый детонатор (priming) пузырьков вносит вклад в регуляцию метаболизма APP (Rossner et al. 2004). Др. составляющим протеома синаптических пузырьков (Burre et al.2006), который может взаимодействовать непосредственно сAPP (Volknandt and Karas 2012) могут быть GTPase dynamin-1, участвующая в эндоцитозе синаптических пузырьков, syntaxin-1-связывающий белок Munc18, участвующий в экзоцитозе, N-ethylmaleimide-sensitive factor NSF (a homohexameric AAA ATPase, участвующая в развертывании комплекса SNARE; Cottrell et al.2005), белок синаптических пузырьков SV2A (Norstrom et al. 2010), и сенсор кальция synaptotagmin-1 (Kohli et al. 2012). Дополнительные партнеры по взаимодействию включают белок синаптических пузырьков synapsin-2, везикулярная vATPase накачки протонов (Norstrom et al.2010), и члены семейства адапторных белков 14-3-3 family (Kohli et al. 2012). Более того, внутриклеточный FE65 адапторный белок, который соединяется с внутриклеточным доменом APP (AICD) (illustrated in Fig. 1) , как было установлено, взаимодействует с SV2A (Nensa et al. 2014). FE65 взаимодействует кроме того с APLP1 и APLP2 (Guenette et al. 2006). Примечательно, что APP способен формировать комплексы с белками активной зоны Mint1, CASK (Wang et al. 2009) и с bassoon, видным членом цитоматрикса активной зоны (CAZ) (Norstrom et al. 2010). Хотя взаимодействия этих составляющих PAZ были описаны, лежащие в основе молекулярные механизмы остаются загадкой. Предыдущее исследование, анализирующее APP и APLP2-dKO мышей, показало, что плотность синаптических пузырьков, размер активной зоны и количество закрепленных пузырьков в активной зоне существенно снижались по сравнению с показателями при APLP2-KO (Yang et al. 2005). Более того, синаптическая трансмиссия снижалась в органотипических культурах срезов гиппокампа, которые были лишены APP и APLP2 полной длины (Schrenk-Siemens et al. 2008). В то время как APP-KO мыши обнаруживали дефицит долговременной потенциации (LTP) в гиппокампе у старых мышей параллельно с поведенческими нарушениями (Ring et al. 2007), APLP2-KO мыши не обнаруживали LTP фенотипа на всех возрастах (Weyer et al. 2011). Напротив, у APPsα-KI/APLP2-KO мышей наблюдался дефицит LTP даже у молодых мышей.

Fig. 1 Cartoon depicting discussed constituents of a synapse. Not to scale

Conclusions


Refinement of subcellular fractionation, immunopurification, and mass spectrometry culminated in the isolation and identification of the proteinaceous inventory of the synapse. The identification of the participating protein components is a prerequisite for further functional investigations and provides the basis for evaluating their interaction. Novel proteins not previously assigned to this compartment can be placed in this mosaic to create a functional scenario of neuronal communication and plasticity in these dynamic focal hot spots. Taken together, these data further support the notion that not only the developing but also the adult synapse is a highly dynamic compartment capable of undergoing continued structural and functional reorganization.
Regional synapse heterogeneity is an important aspect to be addressed in the future. For this purpose, sensitive and high-resolution proteomic analyses of the presynaptic active zone of defined brain regions are required. Future investigations will also include the refined analysis of the proteome of subsynaptic compartments, the comparative analysis of the proteinaceous inventory of subpopulations of synaptic vesicles, or the identification of proteinaceous alterations occurring in various neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. The exploration of the fine-tuning of the synaptic interactome during synaptic growth and development will lead to an advanced understanding of the dynamics of neuronal communication and plasticity.