Mateusz Dyla, Daniel S. Terry, Magnus Kjaergaard, et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature, 2017; DOI: 10.1038/nature24296 | |
|---|---|
|
|
Наши клетки перемещают энергию и вещество туда, где они необходимы. Датские исследователи получили новую базовую информацию об этом невидимом мире, как работает кальциевый насос.
Кальциевый насос не выглядит подобно многим. Каждый насос занимает лишь несколько нанометров, миллион от миллиметра, в каждом направлении и находится в клеточной мембране. Но несмотря на столь малые размеры он является критическим для жизни. Этот насос отвечает за то, чтобы мышцы сокращались, а нейроны отсылали сигналы. Если этот крошечный насос прекратит работу, то клетки перестанут общаться. Без него мы не смогли бы ни двигаться, ни думать. Вот почему клетки используют так много своей энергии -- примерно четверть топлива тела, известная как АТФ -- удерживает насосы в рабочем состоянии.
Имеется множество вещей, о которых мы всё ещё не знаем, напр., о структуре и функции этого жизненно важного насоса.
Датские ученые впервые показали, как функционирует насос на уровне одиночной молекулы и как он гарантирует, что будут накачиваться в правильном направлении.
"Эта работа представляет собой следующую ступень основательного и важного поиска, чтобы понять атомную структуру и функцию насоса. Мы теперь на одну ступень ближе к пониманию того, как накачка ионов гарантирует функционирование клеток. Мы охарактеризовали детально, как он качает ионы из клетки. Важность такого базового знания биофизических процессов не может быть недооценена. Это оказывает огромное влияние на наше понимание процесса жизни и на лечение болезней," сказал Professor Poul Nissen. The molecular backstop В определенной степени эта история началась в 1950s, когда проф. Jens Christian Skou опубликовал пионерскую работу, в которой открыл функции насосов в наших клетках. Кальциевый насос является близким кузеном натрий-калиевых насосов, с которыми работал Skou, и которые используют сходный механизм накачки. Работа Skou's принесла ему Нобелевскую премию по химии в 1997. С тех пор многочисленные исследователи посвятили свою жизнь исследованиям механизма и функции этих насосов -- включая многих исследователей из Center of Excellence for Membrane Pumps in Cells and disease, PUMPkin, at Aarhus University.
Ключевая информация нового исследования связана с однонаправленной природой ионного транспорта. Ранее предполагалось, что однонаправленная природная накачка возникает в результате расщепления энергией богатой молекулы АТФ. Считалось, что когда АТФ расщепляется, то насос не может действовать в обратную сторону и преобразовывать АТФ. Это оказалось далеким от истины: "Мы идентифицировали новое замкнутое состояние в цикле накачки, что насос может действовать только, если ионы кальция поступают из межклеточных жидкостей и насос расщепляет АТФ. Он не может достигать подобного состояния, если ионы поступают из клеточной среды. Если кальций высвобождается из этого состояния, то он оказывается в 'точке невозврата'. Этот механизм объясняет, что насос работает как насос, а не пассивный канал.
Это действительно уникальная информация, базирующаяся на высоко продвинутых экспериментах. Эти эксперименты позволили нам впервые непосредственно наблюдать действие насоса," объясняет Mateusz Dyla.
Кальциевый насос нуждается в энергии, которую он получает в результате расщепления молекулы АТФ, как уже отмечалось ранее. Энергия позволяет ему превращаться в работающий насос. Это объясняет, как концентрационные градиенты образуются между внутренней и внешней стороной клетки. Различия в концентрации может быть более чем в 10000 раз и это огромное различие важно для коммуникаций между клетками, таких как передача нервных сигналов. Smoke and mirrors Причина экспериментов такой сложности довольно ясна: насос столь мал, что он не может рассматриваться непосредственно в световом микроскопе. Пока с серьёзными затруднениями исследователи создали молекулярные модели стабильных состояний накачки, используя технику, известную как рентгеновская кристаллография. Ученые шутя обозначили свою визуализацию движений накачки между этими состояниями как 'Pump Fiction'. Новое исследование продвинуло визуализацию от остановленного движения к живым изображениям накачки. Техническое усовершенствование микроскопической техники позволило наблюдать новое состояние.
Использованная техника известна как одиночных молекул флюоресцентная микроскопия и использован феномен, известный как F?rster Resonance Energy Transfer, сокращенно FRET. Интенсивный лазерный свет и ультра-чувствительные камеры скомбинированы, чтобы прямо наблюдать одиночную молекулу посредством крохотных количеств света, испускаемых каждой молекулой.
Группа исследователей получила преимущества при исследовании кальциевых насосов у бактерий Listeria, которые были подготовлены для изучения с помощью преобразования белка. Это потребовало несколько лет для завершения.
В FRET экспериментах две молекулы краски присоединены к белку, который затем светится в лазерном свете. Одна краска, донор, абсорбирует лазерный свет и испускает его с характерной окраской. Альтернативно, он может переносить энергию на др. краску, акцептор, который затем испускает свет др. цвета. Т.о., свет будет испускаться двумя красками и ученые смогут измерить расстояние между двумя красками, измеряя сколько света испускается каждого цвета. Поскольку краски тщательно внедрены в две специфические позиции в насосе, то это изменение расстояния будет отслеживать движения накачки насоса.
Эта техника с одиночными молекулами привела к новому открытию, объясняет Magnus Kj?rgaard: "Мы продвинулись от 'Pump Fiction' к 'Pump Live'. Ранее мы регистрировали сигналы от многих молекул в одно и то же время, это смазывало движения. Используя технику одиночных молекул FRET мы смогли сфокусироваться на одной молекуле в данный момент времени, это позволило нам наблюдать структурные изменения непосредственно. Это позволило нам с помощью видео наблюдать насос в действии с небольшими перерывами. Наше видео Pump Fiction первоначально соответствовало его названию, поскольку мы знали, что переходы между разными состояниями цикла были вымышленными и что необходима дополнительная информация, заполняющая пробелы между известными состояниями. Мы теперь продемонстрировали это в изобилии и в то же самое время получили критическую новую информацию о том, как работает насос."
Помимо увеличения нашего знания об основных процессах жизни, понимание работы этих насосов может также иметь практическое значение. Мутации в насосах могут вызывать дефекты в клетках головного мозга и могут вызывать нейрологические нарушения, такие как мигрень, временный паралич или нейродегенеративные болезни.
Механизмы работы этих ионных насосов жизненно важны для понимания ошибок в насосах, особенно в смысле разработки новых лекарств, нацеленных на насосы.
"Мы пока не достигли состояния, когда бы мы могли переносить результаты наших исследований на ионных насосах на лечение болезней. Однако, новая информация привела к идее, что она может быть использована для разработки лечения, напр., дефектов передачи нейрональных сигналов. Но это работа будущего. Сейчас существует причина отпраздновать открытие интимных деталей наиболее важных ферментов жизни. " сказал Professor Poul Nissen.
|