Образование у позвоночных нейромышечных соединений (NMJ), периферических холинергических синапсов между двигательными нейронами и волокнами скелетных мышц базируется на аккуратном распознавании и присоединении пресинаптических моторных нейронов на постсинаптических мышечных мишенях, является процессом, происходящим под действием разнообразных организующих сигналов от обоих партнеров (Tintignac et al., 2015). Растут доказательства у некоторых видов позвоночных, на моделях in vitro и in vivo подтверждающие, что Wnt морфогены действуют как регуляторы инициации и/или образования NMJ (Gordon et al., 2012; Henrique z et al., 2008; Jing et al., 2009; Messйant et al., 2015; Packard et al., 2002; St roch lic et al., 2012;Zhang et al., 2012). Пока функция и молекулярные механизмы Wnt , посредством которых Wnts сотрудничают в NMJ позвоночных, остаются ускользающими и противоречивыми.

Wnts, как известно, активируют канонический сигнальный путь, зависимый от β-catenin (Ctnnb1), а также несколько не канонических путей, таких как основной путь planar cell polarity (PCP) ( Nusse, 2012). В NMJ позвоночных, Wnt лиганды трансдуцируют сигналы посредством активации рецепторного комплекса, формируемого muscle-specific tyrosine kinase, MuSK, и low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (Lrp4) и посредством активации классических Frizzled (Fzd) рецепторов (Avils et al., 2014; Zhang et al., 2012; Strochlic et al., 2012; Gordo n et al., 2012; Messant et al., 2015). Комплекс MuSK-Lrp4 составляет центральный каркас образования нейромышечного синапса (DeChi ara et al., 1996; Kim et al., 2008; Weatherbee et al., 2006; Zhang et al., 2008). Активация этого комплекса необходима для: (1) формирования раннего препаттерна мышц, независимого от нервов, на что указывает агрегация acetylcholine receptor (AChR) в проспективном синаптическом регионе на поверхности мышц, что помогает наводить аксоны растущих моторных нейронов на их финальные мишени; и (2) позднее для зависимых от нервов дифференцировки и созревания синапсов (Tintignac et al., 2015). Эта поздняя ступень контролируется высвобождением секретируемой нервами формы agrin, который соединяется с мышечным Lrp4, приводя к активации MuSK и образованию кластеров AChR в постсинаптических мембранах (Kim et al., 2008; Zhang et al., 2008, 2011; Zong et al., 2012).

Среди 19 Wnts, идентифицированных на сегодня у млекопитающих, Wnt2, 3a, 4, 6, 7b, 9a и 11 непосредственно взаимодействуют с MuSK, но только Wnt4, 9a и 11 усиливают образование кластеров AChR в мышечных клетках (Barik et al., 2014; Strochlic et al., 2012; Zhang et al., 2012) . У рыбок данио Wnt4a и Wnt11r инициируют формирование мышечного препаттерна, возможно за счет стимуляции PCP зависимого эндоцитоза MuSK в мышечных клетках (Gordo n et al., 2012; Jing et al., 2009). У мышей, хотя недавние данные оспаривают роль Wnts в NMJ (Remdio et al., 2016), но мы продемонстрировали, что Wnt4 вносит вклад в формирование препаттерна мышц (Strochlic et al., 2012). Передача сигналов Wnt также необходима для более поздних ступеней дифференцировки NMJ у позвоночных. Напр., dishevelled 1 (Dvl1), ступица (hub) для передачи сигналов Wnt, взаимодействует с MuSK и выполняет несколько ролей во время формирования NMJ ( Henriquez et al., 2008; Jing et al., 2009; Luo et al., 2002; Wang et al., 2014). Wnt3, экспрессируемый двигательными нейронами, усиливает образование кластеров AChR в развивающихся крыльях цыплят и вызываемое agrin образование кластеров AChR в культивируемых мышечных трубках посредством неканонического пути передачи сигналов (Henriquez et al., 2008). Напротив, Wnt3a рассеивает agrin-индуцируемые кластеры AChR путем подавления экспрессии rapsyn β-catenin-зависимым способом в культуре мышечных клеток ( Wang et al., 2008). Кроме того, мышечный β-catenin с избыточной или потерей функции у мышей проясняет свою роль в пре- и пост-синаптической дифференцировке, что согласуется с критическим уровнем экспрессии β-catenin, необходимого для собственно образования NMJ (Li et al., 2008; Liu et al., 2012; Wang and Luo, 2008; Wu et al., 2012a, 2015).

Здесь мы использовали набор мутантных мышей, а также вновь разработанные in vivo инструменты и биохимические методы, чтобы идентифицировать сигнальные пути, активируемые с помощью взаимодействия Wnt/receptor, и их функцию в пре- и постсинаптической дифференцировке NMJs млекопитающих. Было показано, что Wnt11 кооперируется с Wnt4, чтобы усилить уровни мРНК субъединицы AChR и образование нейральных AChR кластеров в культивируемых мышечных клетках, по крайней мере, частично посредством активации передачи сигналов β-catenin. Кроме того, использование in vivo Wnt4 и Wnt11 перед началом образования NMJs усиливало образование кластеров AChR и выросты двигательных нейронов. Напротив, отсутствие Wnt11 или подавление всех зависимых от Wnt сигналов in vivo снижало образование кластеров AChR и ветвление окончаний нервов. Специфическое подавление канонического пути Wnt сходным образом затрагивает распределение AChR, но не ветвление аксонов, подтверждая, что определенные ветви передачи сигналов Wnt регулируют терминальные разветвления аксонов. Интересно, что существенное количество аксонов не способно оканчиваться в кластерах AChR и разрастается обильно за пределы предназначенного региона мышц. Наконец было установлено: (1) Wnt11 и Wnt4 преципитируются совместно с Vangl2, ключевым компонентом основного PCP пути; (2) Vangl2 накапливается в эмбриональных NMJs; и (3) мыши, обнаруживающие мутацию потерю функции Vangl2, обнаруживают loop-tail ( Vangl 2 Lp/Lp) с разрушенными кластерами AChR и ростом аксонов, обходящим кластеры AChR. Полученные данные показывают, что скоординированное действие Wnt4 и Wnt11 регулирует образование NMJ посредством активации как канонического, так и Vangl2-зависимого PCP пути.

Итак, Wnt4 и Wnt11 стимулируют уровни мРНК AChR, а процесс образования кластеров AChR стоит ниже активации пути β-catenin. Мыши, несущие мутацию потери функции Vangl 2 (loop-tail) обнаруживают меньше кластеров AChR и рост аксонов в обход кластеров AChR. Следовательно, Wnt4 и Wnt11 кооперативно вносят вклад в образование NMJ у млекопитающих посредством активации Wnt канонического и не канонического Vangl2-зависимого стержневого PCP пути.